Name: Indução e validação da senescência celular em células humanas primárias (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 18 s
Description: Aprenda a induzir e validar senescência celular em fibroblastos primários humanos usando doxorrubicina e marcadores associados. Este método reprodutível não requer equipamentos especiais e facilita pesquisas em envelhecimento e câncer.

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Agradecemos a membros do laboratório Demaria para discussões frutuosos e Thijmen van Vliet para compartilhar dados e protocolo sobre a senescência induzida por UV.

<ol><li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Muñoz-Espín, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="https://www.nature.com/articles/nrm3823">Cellular senescence: from physiology to pathology. Nature reviews.</a> Molecular cell biology. 15, 482-496 (2014).</li>
<li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nature Reviews Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li>
<li>Correia-Melo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+are+required+for+pro-ageing+features+of+the+senescent+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Mitochondria are required for pro-ageing features of the senescent phenotype.</a> The EMBO Journal. 10, e201592862(2016).</li>
<li>Loaiza, N., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+and+tumor+promotion%3A+Is+aging+the+key%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Reviews+on+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence and tumor promotion: Is aging the key?</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. , (2016).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Naturally+occurring+p16%28Ink4a%29-positive+cells+shorten+healthy+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan.</a> Nature. 530 (7589), 184-189 (2016).</li>
<li>Xu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+senescent+cells+enhances+adipogenesis+and+metabolic+function+in+old+age%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Targeting senescent cells enhances adipogenesis and metabolic function in old age.</a> Elife. 4, e12997(2015).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li>
<li>Jeon, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+clearance+of+senescent+cells+attenuates+the+development+of+post-traumatic+osteoarthritis+and+creates+a+pro-regenerative+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment.</a> Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).</li>
<li>Demaria, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Senescence+Promotes+Adverse+Effects+of+Chemotherapy+and+Cancer+Relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discovery%22%5BJournal%5D)">Cellular Senescence Promotes Adverse Effects of Chemotherapy and Cancer Relapse.</a> Cancer Discovery. 7 (2), 165-176 (2017).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+senescent+cells+by+ABT263+rejuvenates+aged+hematopoietic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).</li>
<li>Soto-Gamez, A., Demaria, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+interventions+for+aging%3A+the+case+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Therapeutic interventions for aging: the case of cellular senescence.</a> Drug Discov Today. 22 (5), 786-795 (2017).</li>
<li>Childs, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescent+cells%3A+an+emerging+target+for+diseases+of+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Senescent cells: an emerging target for diseases of ageing.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 16 (10), 718-735 (2017).</li>
<li>Marthandan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+genes+and+pathways+in+primary+human+fibroblast+strains+undergoing+replicative+and+radiation+induced+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Research%22%5BJournal%5D)">Conserved genes and pathways in primary human fibroblast strains undergoing replicative and radiation induced senescence.</a> Biological Research. 49, 34(2016).</li>
<li>Marthandan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+Senescence+Associated+Genes+and+Pathways+in+Primary+Human+Fibroblasts+Detected+by+RNA-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Conserved Senescence Associated Genes and Pathways in Primary Human Fibroblasts Detected by RNA-Seq.</a> PLoS One. 11 (5), e0154531(2016).</li>
<li>Hernandez-Segura, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unmasking+Transcriptional+Heterogeneity+in+Senescent+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Unmasking Transcriptional Heterogeneity in Senescent Cells.</a> Current Biology. 27 (17), 2652-2660 (2017).</li>
<li>Le, O. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ionizing+radiation-induced+long-term+expression+of+senescence+markers+in+mice+is+independent+of+p53+and+immune+status%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Ionizing radiation-induced long-term expression of senescence markers in mice is independent of p53 and immune status.</a> Aging Cell. 9 (3), 398-409 (2010).</li>
<li>Hall, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C%2FEBPalpha+regulates+CRL4%28Cdt2%29-mediated+degradation+of+p21+in+response+to+UVB-induced+DNA+damage+to+control+the+G1%2FS+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">C/EBPalpha regulates CRL4(Cdt2)-mediated degradation of p21 in response to UVB-induced DNA damage to control the G1/S checkpoint.</a> Cell Cycle. 13 (22), 3602-3610 (2014).</li>
<li>Nitiss, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+DNA+topoisomerase+II+in+cancer+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting DNA topoisomerase II in cancer chemotherapy.</a> Nature Reviews Cancer. 9 (5), 338-350 (2009).</li>
<li>Pazolli, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+remodeling+underlies+the+senescence-+associated+secretory+phenotype+of+tumor+stromal+fibroblasts+that+supports+cancer+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Chromatin remodeling underlies the senescence- associated secretory phenotype of tumor stromal fibroblasts that supports cancer progression.</a> Cancer Research. 72, 2251-2261 (2012).</li>
<li>Venturelli, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+induction+of+apoptosis+and+senescence+by+the+DNA+methyltransferase+inhibitors+5-azacytidine+and+5-aza-2%27-deoxycytidine+in+solid+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer+Therapeutics%22%5BJournal%5D)">Differential induction of apoptosis and senescence by the DNA methyltransferase inhibitors 5-azacytidine and 5-aza-2'-deoxycytidine in solid tumor cells.</a> Molecular Cancer Therapeutics. 12, 2226-2236 (2013).</li>
<li>Tennant, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+Trypan+Blue+Technique+for+Determination+of+Cell+Viability%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the Trypan Blue Technique for Determination of Cell Viability.</a> Transplantation. 2, 685-694 (1964).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Lee, B. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+%CE%B2-galactosidase+is+lysosomal+%CE%B2-galactosidase%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated β-galactosidase is lysosomal β-galactosidase.</a> Aging Cell. 5, 187-195 (2006).</li>
<li>Kopp, H. G., Hooper, A. T., Shmelkov, S. V., Rafii, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beta-galactosidase+staining+on+bone+marrow.+The+osteoclast+pitfall%5BTitle%5D)+AND+%22Histology+and+Histopathology%22%5BJournal%5D)">Beta-galactosidase staining on bone marrow. The osteoclast pitfall.</a> Histology and Histopathology. 22 (9), 971-976 (2007).</li>
<li>Dimri, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+biomarker+that+identifies+senescent+human+cells+in+culture+and+in+aging+skin+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A biomarker that identifies senescent human cells in culture and in aging skin in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (20), 9363-9367 (1995).</li>
<li>Salic, A., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+chemical+method+for+fast+and+sensitive+detection+of+DNA+synthesis+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (7), 2415-2420 (2008).</li>
<li>Sherr, C. J., McCormick, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RB+and+p53+pathways+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The RB and p53 pathways in cancer.</a> Cancer Cell. 2 (2), 103-112 (2002).</li>
<li>Bunz, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+p53+and+p21+to+sustain+G2+arrest+after+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Requirement for p53 and p21 to sustain G2 arrest after DNA damage.</a> Science. 282 (5393), 1497-1501 (1998).</li>
<li>Severino, J., Allen, R. G., Balin, S., Balin, A., Cristofalo, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+beta-galactosidase+staining+a+marker+of+senescence+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Is beta-galactosidase staining a marker of senescence in vitro and in vivo.</a> Experimental Cell Research. 257 (1), 162-171 (2000).</li>
<li>Stolzing, A., Coleman, N., Scutt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-induced+replicative+senescence+in+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Rejuvenation+Research%22%5BJournal%5D)">Glucose-induced replicative senescence in mesenchymal stem cells.</a> Rejuvenation Research. 9 (1), 31-35 (2006).</li>
<li>Blazer, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+glucose-induced+replicative+senescence%3A+point+of+no+return+and+effect+of+telomerase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">High glucose-induced replicative senescence: point of no return and effect of telomerase.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 296 (1), 93-101 (2002).</li>
<li>Wiley, C. D., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+Ancient+Pathways+to+Aging+Cells-Connecting+Metabolism+and+Cellular+Senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">From Ancient Pathways to Aging Cells-Connecting Metabolism and Cellular Senescence.</a> Cell Metabolism. 23 (6), 1013-1021 (2016).</li>
<li>Kumar, R., Gont, A., Perkins, T. J., Hanson, J. E. L., Lorimer, I. A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+senescence+in+primary+glioblastoma+cells+by+serum+and+TGFbeta%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Induction of senescence in primary glioblastoma cells by serum and TGFbeta.</a> Scientific Reports. 7 (1), 2156(2017).</li>
<li>Hypoxia Blagosklonny, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MTOR+and+autophagy%3A+converging+on+senescence+or+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">MTOR and autophagy: converging on senescence or quiescence.</a> Autophagy. 9 (2), 260-262 (2013).</li>
<li>Meuter, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Markers+of+cellular+senescence+are+elevated+in+murine+blastocysts+cultured+in+vitro%3A+molecular+consequences+of+culture+in+atmospheric+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Assisted+Reproduction+and+Genetics%22%5BJournal%5D)">Markers of cellular senescence are elevated in murine blastocysts cultured in vitro: molecular consequences of culture in atmospheric oxygen.</a> Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 31 (10), 1259-1267 (2014).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human-like+senescence-associated+secretory+phenotype+is+conserved+in+mouse+cells+dependent+on+physiological+oxygen%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A human-like senescence-associated secretory phenotype is conserved in mouse cells dependent on physiological oxygen.</a> PLoS One. 5 (2), e9188(2010).</li>
<li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+senescent+cells+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li>
<li>Kim, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implications+of+time-series+gene+expression+profiles+of+replicative+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Implications of time-series gene expression profiles of replicative senescence.</a> Aging Cell. 12, 622-634 (2013).</li>
</ol>

Os protocolos explicados aqui foram otimizados para fibroblastos humanos primários, particularmente células BJ e WI-38. Os protocolos para a senescência replicative, radiação ionizante e doxorrubicina, foram aplicados com sucesso para outros tipos de fibroblastos (HCA2 e IMR90) e em outros tipos de células (nomeadamente neonatais melanócitos e queratinócitos ou cardiomyocytes iPSC-derivado) em nosso laboratório. No entanto, adaptações para tipos de células adicionais podem ser otimizadas ajustando alguns detalhes como o ...

Em 1961, Hayflick e Moorhead relataram que fibroblastos primários na cultura perdem seu potencial proliferativo após sucessivas passagens1. Este processo é causado pelo sequencial encurtamento dos telômeros após cada divisão celular. Quando os telômeros atingir um comprimento curto criticamente, eles são reconhecidos pela resposta DNA-danos (DDR) que ativa uma detenção irreversível da proliferação — também definida como senescência replicative. Senescência replicative é atualmente um dos muitos estímulos que são conhecidos por induzir a um estado de prisão permanente ciclo celular que reproduz células minúsculas de mitógenos e apoptotic sinais2,3. O programa de senescência normalmente é caracterizado por recursos adicionais, incluindo a alta atividade dos lisossomos, disfunção mitocondrial, alterações nucleares, rearranjos de cromatina, stress do retículo endoplasmático, danos ao DNA e uma senescência-associados o fenótipo secretor (SASP)3,4. As células senescentes têm múltiplas funções no corpo: desenvolvimento, ferida cura e tumor supressão2. Igualmente, eles são conhecidos por desempenhar um papel importante no envelhecimento e, paradoxalmente, em progressão de tumor5. Os efeitos negativos e parcialmente contraditórios, a senescência são frequentemente atribuídos a SASP6.
Recentemente, foi demonstrado que a eliminação de células senescentes de ratos leva a extensão de vida útil e a eliminação de muitos do envelhecimento características7,8,9,10,11, 12. da mesma forma, várias drogas têm sido desenvolvidas para também eliminar as células senescentes (senolytics) ou para direcionar o SASP13,14. O potencial terapêutico antienvelhecimento recentemente tem atraído mais atenção ao campo.
O estudo dos mecanismos associados à senescência celular e as projecções para intervenções farmacológicas dependem fortemente ex vivo modelos, particularmente em fibroblastos humanos primários. Embora existam algumas características comuns ativadas por indutores de diversas senescência, uma grande variabilidade do fenótipo de senescência é observado e dependente de vários factores, incluindo a célula tipo, o estímulo e o tempo ponto3,15, 16,17. É imperativo considerar a heterogeneidade para estudar e orientar células senescentes. Portanto, esse protocolo visa fornecer uma série de métodos utilizados para induzir a senescência em fibroblastos primários usando tratamentos diferentes. Como será explicado, os métodos podem ser facilmente adaptados para outros tipos de células.
Além de senescência replicative, descrevemos cinco outros tratamentos senescência de indução: ionizando radiação, radiação ultravioleta (UV), doxorrubicina, estresse oxidativo e alterações epigenéticas (nomeadamente promoção da acetilação da histona ou demetilação do ADN) . Ambos, radiação ionizante e radiação UV causam danos diretos do DNA e, com a dose apropriada, desencadear senescência18,19. Doxorrubicina também provoca senescência principalmente através de dano do ADN por intercalação no DNA e interromper a função de topoisomerase II e assim travar o DNA reparo mecanismos20. A expressão de genes essenciais para a senescência é normalmente controlada por acetilação da histona e metilação do DNA. Como consequência, inibidores de deacetilase de histona (por exemplo, o butirato de sódio e Santos) e DNA demethylating (por exemplo, 5-aza) agentes desencadear senescência em células normais21,22.
Finalmente, quatro dos marcadores mais comuns associados às células senescentes será explicado: atividade da senescência associado-β-galactosidase (SA-β-gal), taxa de síntese de DNA por ensaio de incorporação de EdU, superexpressão dos reguladores do ciclo celular e p21, p16 de inibidores da quinase cyclin-dependente e superexpressão e secreção de membros da SASP.

<table><tbody><tr><td>Mídia DMEM - GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>31966-047</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Hyclone</td><td>SV30160.03</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina (P / S; 10.000 U / ml)</td> <td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Dimetil Sulfóxido (DMSO)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>SC-202581</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de nuclease (não tratada com DEPC)</td> <td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Balão T75</td><td>Sarstedt</td><td>833911002</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Tripsina/EDTA</td><td>Lonza</td><td>CC-5012</td><td></td></tr><tr><td>PBS comprimidos</td><td>Gibco</td><td>18912-014</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 ml</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9661-1000EA</td><td></td></tr><tr><td>Corning&nbsp; Tubos de centrífuga de 15 mL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430791</td><td></td></tr><tr><td>placa de 6 poços</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr><tr><td>placa de 24 poços</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>lamínulas redondas de 13 mm</td><td>Sarstedt</td><td>83.1840.002</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip</td><td>Merck Chemicals</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>fonte de césio137 IBL</td><td></td><td></td><td>637 césio-137câmara de radiação UV para máquina de raios gama</td></tr><tr><td></td> Opsytec, Dr. G&ouml;<td></td><td></td><td> bel BS-02</td></tr><tr><td>Dicloridrato de Doxorrubicina&nbsp;</td><td>BioAustralis Fine Chemicals</td><td>BIA-D1202-1</td><td></td></tr><tr><td>Solução de peróxido de hidrogênio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7722-84-1</td><td></td></tr><tr><td>5-aza-2'-desoxicitidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3656</td><td></td></tr><tr><td>SAHA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0061</td><td></td></tr><tr><td>Butirato de Sódio&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5887</td><td></td></tr><tr><td>X-gal (5-Bromo-4-cloro-3-indolil-&beta;-D-galactopiranosídeo)</td><td>Fisher Scientific</td><td>7240-90-6</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico monohidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5949-29-1</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato dibásico de sódio</td><td>Acros organics</td><td>7782-85-6</td><td></td></tr><tr><td>Ferrocianeto de potássio&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>14459-95-1</td><td></td></tr><tr><td>Ferricianeto de potássio</td><td>Fisher Scientific</td><td>13746-66-2</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Merck Millipore</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Fisher Chemicals</td><td>7791-18-6</td><td></td></tr><tr><td>25% de glutaraldeído</td><td>Fisher Scientific</td><td>111-30-8,7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>16% de formaldeído (p / v)</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina)</td><td>Lumiprobe</td><td>10540</td><td></td></tr><tr><td>Sulfo-Cyanine3 azida (Sulfo-Cy3-Azide)</td><td>Lumiprobe</td><td>D1330</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbato de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4034</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de cobre(II) pentahidratado ((II)SO4.5H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>209198</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros organics</td><td>215682500</td><td></td></tr><tr><td>base TRIS</td><td></td><td>Placa Multipoços Roche</td> 11814273001 <td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 384, branca&nbsp;</td><td>Folha</td><td>de vedação Roche 4729749001</td><td></td></tr><tr><td>Lightcycler 480</td><td>Kit Roche</td><td>4729757001</td><td></td></tr><tr><td>Sensifast Probe Lo-ROX&nbsp;</td><td>Bioline</td><td>BIO-84020</td><td></td></tr><tr><td>UPL Probe</td><td>Library Sigma-Aldrich</td><td>Vários</td><td></td></tr><tr><td>DuoSet IL-6 Humanos ELISA</td><td>R& D</td><td>D6050</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad TC20</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de contagem</td><td>Bio-Rad</td><td>145-0017</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora a seco</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>Heratherm</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilformamida</td><td>Merck Millipore</td><td>1.10983</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm 'M' filme de laboratório</td><td>Bemis&nbsp;</td><td></td><td></td>#PM992</tr><tr><td>Agulhas</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>de</td><td></td><td></td><td></td>pinça</tr></tbody></table>

indução e validação da senescência celular em células humanas primárias

Induction and Validation of Cellular Senescence in Primary Human Cells

Senescência celular é um estado de prisão permanente ciclo celular ativado em resposta a diferentes estímulos nocivos. Ativação da senescência celular é uma marca registrada de diversas condições fisiopatológicas incluindo supressão de tumor, tecido, remodelação e envelhecimento. Os indutores da senescência celular na vivo caracterizam-se ainda mal. No entanto, uma série de estímulos pode ser usada para promover a senescência celular ex vivo. Entre eles, indutores de senescência mais comuns são exaustão replicative, ionizante e radiação não-ionizante, drogas genotóxicas, estresse oxidativo e demethylating e acetificar agentes. Aqui, iremos fornecer instruções detalhadas sobre como usar esses estímulos para induzir os fibroblastos em senescência. Este protocolo pode ser facilmente adaptado para diferentes tipos de células primárias e de linhagens celulares, incluindo as células cancerosas. Também descrevemos os métodos diferentes para a validação da indução da senescência. Em particular, focamos em medir a atividade da enzima lisossomal associada a senescência β-galactosidase (SA-β-gal), a taxa de síntese de DNA utilizando o ensaio de incorporação 5-ethynyl-2'-desoxiuridina (EdU), os níveis de expressão do ciclo celular p16 inibidores e p21 e a expressão e secreção de membros do fenótipo secretor Senescence-Associated (SASP). Finalmente, podemos fornecer resultados de exemplo e discutir aplicações desses protocolos.

Enriquecimento de SA-β-gal coloração em fibroblastos senescentes
Β-galactosidase (β-gal) é uma enzima lisossomal que é expressa em todas as células e que tem um pH ótimo de 4.025,26. No entanto, durante a senescência, lisossomos aumentam de tamanho e, consequentemente, as células senescentes acumulam β-gal. O aumento dos montantes desta enzima tornam possível detectar sua a...

Aqui, vamos discutir uma série de protocolos para indução e validação da senescência celular em culturas de células. Podemos focar diferentes estímulos indutores senescência e descrever a quantificação de marcadores comuns associadas a senescência. Nós fornecemos detalhes técnicos utilizando fibroblastos como modelo, mas os protocolos podem ser adaptados para vários modelos de celulares.

Indução e validação da senescência celular em células humanas primárias

Cellular senescence is a state of permanent cell cycle arrest activated in response to different damaging stimuli. Activation of cellular senescence is a ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do envelhecimento e do câncer, como realizar técnicas comuns para induzir a senescência celular e como avaliar o fenótipo de senescência. As principais vantagens dessa técnica são que ela é fácil de seguir, altamente reprodutível, não requer nenhum equipamento especial ou caro e resulta na indução de senescência em pelo menos 50% da população celular. Demonstrando este procedimento estará Alejandra Hernandez-Segura, uma estudante de pós-graduação do nosso laboratório.Para começar, semeie sete vezes 10 elevado ao quinto fibroblastos primários viáveis com baixa duplicação populacional ou PD em um frasco T75 contendo 10 mililitros de D10. Incube as células em uma incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 5% de oxigênio durante a noite. Diluir 11 microlitros da solução-mãe de doxorrubicina 1.000X em 11 mililitros de D10 até uma concentração final de 250 nanomolares.Em seguida, aspire o meio das células e substitua-o por 10 mililitros de D10 mais doxorrubicina. Incube as células em uma incubadora de cultura de células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 5% de oxigênio por exatamente 24 horas. Em seguida, aspire o meio e use 10 mililitros de D10 para lavar cuidadosamente as células uma vez.Incubar as células em 10 mililitros de D10 por mais seis dias, substituindo o meio regularmente aproximadamente a cada três dias. Para realizar a coloração com beta-galactosidase, para cada amostra semeie uma vez 10 elevado às quatro células em pelo menos um poço de uma placa de 24 poços contendo 500 microlitros de D10 para que as células fiquem esparsas. Incube as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 5% de oxigênio durante a noite.No dia seguinte, use 500 microlitros de PBS para lavar as células duas vezes. Em seguida, adicione 500 microlitros por poço de formaldeído a 2% mais glutaraldeído a 0,2% em PBS e incube as células em temperatura ambiente por três a cinco minutos para fixá-las. Em seguida, use 500 microlitros de PBS para lavar as células duas vezes.Em seguida, depois de preparar a solução de coloração fresca, adicione 500 microlitros por poço e use parafilme para selar a placa para evitar a evaporação que pode causar a formação de cristais. Incube as células no escuro a 37 graus Celsius em uma incubadora seca sem dióxido de carbono por 12 a 16 horas. Em seguida, use 500 microlitros de PBS para lavar as células duas vezes.Verifique as células em um microscópio óptico normal para avaliar os resultados em que as células positivas aparecerão com coloração paranuclear azul. Para facilitar a visualização e quantificação de células individuais, use DAPI como contracoloração. Em seguida, usando um microscópio fluorescente, determine a porcentagem de células positivas versus o número total de células tirando várias fotos da mesma amostra para avaliar pelo menos 100 células individuais.Para cada amostra ou condição, coloque uma lamínula por poço em uma placa de 24 poços. Semeie uma vez 10 elevado às quartas células com 500 microlitros de D10 por poço para que as células fiquem esparsas. Incube as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 5% de oxigênio durante a noite.Prepare uma solução EdU de 20 micromolares e D10 suficiente para que cada amostra receba 250 microlitros. Remova metade do meio de cada poço a ser tratado e substitua-o por uma solução EdU D10. A concentração final de EdU é de 10 micromolares.Incube as amostras a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono e 5% de oxigênio por 18 a 24 horas. Use o mesmo tempo de incubação para células de controle e senescentes. Após a incubação, use 500 microlitros de PBS para lavar as células duas vezes.Em seguida, adicione 500 microlitros de formaldeído a 4% em PBS e incube as células por 10 minutos para corrigi-las. Após a fixação, adicione 500 microlitros de Tris 100 milimolar pH 7,6 às amostras e incube-as por cinco minutos. Em seguida, adicione 500 microlitros de 0,1% Triton X-100 em PBS às células e permeabilize-as por 10 minutos.Em seguida, use PBS para lavar as amostras três vezes. Prepare 50 microlitros de mistura de rótulos para cada lamínula, adicionando os componentes na seguinte ordem, 44,45 microlitros de PBS, 0,5 microlitros de sulfato de cobre (II), 0,05 microlitros de sulfo-cy3-azide e cinco microlitros de ascorbato de sódio. Pipete 50 microlitros da mistura de rótulos em um pedaço de parafilme.Em seguida, usando uma pinça e uma agulha, levante a lamínula e coloque-a com o lado da célula voltado para baixo em cima da mistura de etiquetas. Certifique-se de que não haja bolhas e que toda a superfície da lamínula esteja tocando a mistura de etiquetas. Incubar a amostra no escuro durante 30 minutos.Coloque as células de volta nos poços da placa de 24 poços e use PBS para lavá-las três vezes. Em seguida, use o meio de montagem com DAPI para montar as amostras e deixá-las secar durante a noite. Para começar, semeie sete vezes 10 para o quinto fibroblastos primários viáveis com uma baixa Duplicação da População ou.Crie imagens de pelo menos 100 células por condição. Finalmente, quantifique a porcentagem de células que incorporaram EdU usando a seguinte fórmula. Realizar estudos de expressão gênica e proteica de acordo com o protocolo de texto.Aqui são mostradas imagens representativas da coloração SA-beta-gal em fibroblastos primários em proliferação versus senescentes. As células senescentes parecem aumentadas dentro de um corpo celular regular. Como mencionado, pode ser difícil distinguir células individuais.Portanto, a co-coloração com DAPI facilita a visualização e a contagem de células. Neste experimento, a suflo-cy3-azida foi usada para realizar cicloadição de azida-alcino catalisada por cobre à população. Se o acoplamento da azida ao alcino tiver ocorrido, as células exibirão fluorescência sob um filtro cy3 distinguindo as células em proliferação das não proliferativas.Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 36 horas se executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ser o mais rápido possível ao manusear células fora da incubadora, pois oscilações na concentração de oxigênio podem afetar seus resultados. Após este procedimento, outros métodos, como arranjo de citocinas ou Western blot, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como os níveis de proteínas secretadas ou a compreensão de vias de sinalização específicas.Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo do envelhecimento e do câncer explorarem como as células senescentes estão envolvidas em condições fisiológicas e patológicas em mamíferos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como induzir a senescência de forma reprodutível em células primárias e como avaliar seu status de senescência.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Se senescência impede ou promove tumorigenesis permanece controverso. Desde agentes quimioterápicos podem induzir as células cancerosas senesce, estudando senescência é essencial para propor novas terapias. No entanto, o ensaio de β-galactosidase padrão e amplamente utilizado apresenta grandes inconvenientes. Propomos aqui um fluxo de ensaio baseado em citometria rápido e sensível para quantificar a senescência.

Um método sensível para quantificar células senescentes Câncer

A senescência celular, o estado irreversível de paragem do ciclo celular, pode ser induzida por vários stresses celulares. Aqui, descrevemos os protocolos para induzir a senescência e métodos celular para avaliar marcadores de senescência.

Técnicas para induzir e quantificar Cellular Senescence

Aqui nós apresentamos um protocolo detalhado para detectar ambos senescentes e células-tronco pluripotentes no músculo esquelético após lesões enquanto induzindo na vivo reprogramação. Este método é adequado para avaliar o papel da senescência celular durante a regeneração do tecido e reprogramação na vivo.

Avaliação da senescência induzida por lesão e na Vivo reprogramação no músculo esquelético

ROS intracelular foi mostrado para jogar um papel importante na indução da senescência celular. Aqui, descrevemos um ensaio sensível para quantificação dos níveis ROS durante a senescência celular. Nós também fornecemos protocolos para avaliar o fenótipo secretor associada a senescência, que alegadamente contribui para várias desordens relacionadas com a idade.

Uma medida quantitativa de espécies reativas de oxigênio e senescência-associado fenótipo secretor em fibroblastos humanos normais durante a senescência induzida pelo Oncogene

A senescência celular é o fator-chave no desenvolvimento de patologias crônicas relacionadas à idade. A identificação da terapêutica que visam as células senescentes mostra a promessa de estender o envelhecimento saudável. Aqui, nós apresentamos um ensaio novo à tela para a identificação do senotherapeutics baseado na medida da atividade associada da senescência β-galactosidase em únicas pilhas.

Ensaio de triagem à base de SA-β-galactosidase para a identificação de medicamentos Senoterapêuticos

A imunofluorescência multiplexada permite a marcação sequencial de múltiplos marcadores de anticorpos dentro de uma única seção de tecido para apoiar a análise espacial da arquitetura do tecido e das populações celulares. Aqui, é apresentado um fluxo de trabalho para a detecção multiplex de marcadores estruturais, estruturais e imunológicos associados à senescência, incluindo preparação manual e automatizada de lâminas, imagens iterativas e análise de células únicas usando software digital de...

Ensaio de Imunofluorescência Multiplexada para Avaliação Espacial de Marcadores de Senescência in vivo

Este protocolo apresenta microscopia confocal com luz refletida para a detecção objetiva, por célula única, da atividade beta-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal) na fração vascular estromal isolada do tecido adiposo humano. O método é compatível com imunocitoquímica, incorpora controles de pH para avaliação quantitativa e, adicionalmente, oferece uma alternativa mais sensível e menos subjetiva à coloração convencional de SA-β-gal.

Detecção de Senescência usando luz refletida na fração vascular estromal adiposa

Um protocolo padronizado para induzir senescência prematura em HNM usando tBHP, protocolos padronizados para análise de marcadores-chave de senescência, incluindo paragem do crescimento, atividade SA-β-galactosidase e fatores SASP.

Um protocolo padronizado para induzir senescência prematura induzida por estresse em melanócitos humanos primários usando hidroperóxido de tert-butila

Este artigo apresenta um protocolo LysoTracker de células vivas para medir a remodelação lisossômica durante a senescência em fibroblastos humanos IMR-90.

Perfil Lisossômico com LysoTracker para avaliação quantitativa da senescência celular em fibroblastos humanos

Esse método estuda como fibroblastos cutâneos senescentes afetam os saudáveis. A senescência é induzida por exposição à UVB, e o meio condicionado é aplicado aos fibroblastos normais. Ele ajuda a avaliar compostos bioativos que visam a comunicação celular alterada no envelhecimento da pele.

Nova combinação de antioxidantes para restaurar a comunicação intercelular saudável em um modelo in vitro usando meio condicionado de células senescentes

Aprenda a induzir e validar senescência celular em fibroblastos primários humanos usando doxorrubicina e marcadores associados. Este método reprodutível não requer equipamentos especiais e facilita pesquisas em envelhecimento e câncer.

Indução e validação da senescência celular em células humanas primárias

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