Name: Pulldown biotina-baseado do ensaio para validar mRNA miRNAs alvos de celular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Aprenda a validar alvos de mRNA de microRNAs celulares usando miméticos de LNA biotinilados. Este método de pulldown oferece alta especificidade e estabilidade para quantificação por qPCR.

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Este trabalho foi parcialmente financiado pelo National Institutes of Health (NIH) subvenções DA037779 (para J.P.), DA024558, DA30896, DA033892, DA021471, AI22960 e MD007586 (para CD). O trabalho também foi apoiado pelo RCMI Grant G12MD007586, o Vanderbilt CTSA Grant UL1RR024975, a Meharry Translational Research Center (MeTRC) CTSA conceder (U54 RR026140 de NCRR/NIH, o U54 Grant MD007593 de NIMHD/NIH e o centro de Tennessee para AIDS Pesquisa (P30 AI110527).

1. a transfeccao de 3'-biotinilado miRNA
Nota: Execute as seguintes etapas dentro de uma capa de estéril de fluxo laminar.
<ol><li>Semente 4 x 105– 5 x 105 HEK-293T células por poço em 2 mL de completam modificado águia médio (DMEM de Dulbecco) [DMEM suplementado com 10% de soro Fetal bovino (FBS) e 1 x antibiótico caneta-estreptococos]. Cultura de células em uma incubadora que defina a 37 ° C, 5% CO2 durante a noite.</li>
	<li>No dia seguinte, verificar a integridade e a aderência das células chapeadas sob um microscópio de luz. Nota: Certifique-se de que as células têm aderido e alcançou a morfologia apropriada antes de prosseguir para a próxima etapa. As células HEK-293T estão normalmente prontas para transfeccao 18 – 24 h postar chapeamento.</li>
	<li>Em um tubo de microcentrífuga estéril 1,7 mL, dilua 75 picomoles de miRNA biotinilado em 200 µ l de media mínimos essenciais. Transfira esta mistura para outra 1,7 mL microcentrífuga tubo contendo lipossomas baseado reagente de transfeccao (8 µ l/poço) diluído em 200 µ l de media mínimos essenciais. Misturar cuidadosamente, mas delicadamente, pipetando e incube por 20 – 25 min à temperatura ambiente para permitir a formação dos complexos do transfection.</li>
	<li>Remova a placa de cultura de 6 pipetando suave a velha mídia e reabastecer a cada poço com 1,6 mL de DMEM completa recentemente preparada (sem 1 x antibióticos caneta-estreptococos).</li>
	<li>Adicione os complexos de transfeccao (de 1,3) drop-wise para as células a placa 6 usando uma pipeta bem calibrada. A placa agitar suavemente o frasco ao adicionar os complexos para garantir a sua distribuição uniforme em toda a placa. Nota: Este passo é muito crítico para alcançar alta eficiência do transfection e deve ser realizado com cuidado e paciência.</li>
	<li>Cultura de células em 37 ° C e 5% CO2 pelo menos 36 h.</li>
</ol>2. preparação do Streptavidin revestido grânulos magnéticos — eu
<ol><li>Resuspenda as esferas magnéticas streptavidin completamente vortexing. Transferi 30 µ l de suspensão de conta (por exemplo) para um tubo de microcentrífuga nuclease-livre de 2 mL.</li>
	<li>Coloca o tubo contendo a suspensão do grânulo no stand separador magnético do grânulo ("ímã" daqui em diante) por 2 min. Depois de garantir que as contas são atraídas para o lado do tubo em contato com o ímã, remova cuidadosamente o sobrenadante utilizando uma micropipeta.</li>
	<li>Adicione 100 µ l de tampão de lavagem do grânulo (10 mM Tris-Cl pH 7,5, EDTA de 0,5 mM, 1 M NaCl) para as contas. Retire o tubo do ímã. Vórtice por 15 s à temperatura para lavar os grânulos.</li>
	<li>Colocar o tubo contendo esferas sobre o ímã por 2 min e cuidadosamente remover e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Repita as etapas 2.3 e 2.4 para um total de três lavagens. Após a etapa de lavagem final, retire o tubo do ímã.</li>
	<li>Adicione 100 µ l de RNase liberando solução (0.1 M NaOH, 0,05 M NaCl) para as contas, misture bem vortexing por 15 s, incubar a temperatura ambiente por 5 min. Coloque o tubo contendo esferas sobre o ímã por 2 min e cuidadosamente remover e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Repita a etapa 2.6 para um total de três vezes.</li>
	<li>Adicionar a solução de ressuspensão do grânulo (0,5 M NaCl) aos talões, vórtice 15 s e incubar a temperatura ambiente por 5 min. Coloque os grânulos ressuspensão sobre o ímã por 2 min e retire com cuidado o sobrenadante.</li>
	<li>Adicione 200 µ l de grânulo obstrui a solução (1 µ g / µ l BSA, 2 µ g / µ l fermento tRNA) para as contas. Mix vortexing suave por 15 s à temperatura ambiente. Incube a 4 ° C, durante 16 h (durante a noite) em tubo multi rotacao.</li>
</ol>3. preparação de lisados celulares
<ol><li>Colheita de células transfectadas HEK-293T por raspagem suave com uma espátula estéril célula dentro do capô laminar e, em seguida, transferir cada amostra para um tubo de microcentrífuga estéril de 2 mL.</li>
	<li>Granule as células raspadas por centrifugação a 1.500 x g por 5 min. resuspenda o pellet em 1X PBS estéril (salina tampão de fosfato), pH 7,2. Centrifugue novamente a 1.500 x g por 5 min obter uma pelota de mídia residual. Imediatamente, mergulhe o tubo contendo a pelota no gelo.</li>
	<li>Preparar o tampão de lise celular completa fresco (150 mM NaCl, 25 mM Tris-Cl, pH 7,5, 5mM DTT, 0,5% IGEPAL, 60 U/mL Superase, 1 x inibidor da Protease). Nota: Um estoque de tampão de lise celular falta coquetel de inibidor de Protease, Superase e IGEPAL pode ser preparado com antecedência e armazenado à temperatura ambiente. Prepare uma nova fornada de tampão de lise celular completo adicionando os suplementos acima nas concentrações finais recomendadas para a lise celular das ações e armazená-lo em gelo.</li>
	<li>Adicionar 260 µ l de tampão de lise celular completa gelada para cada amostra no tubo de microcentrífuga (ou seja, cada tubo de microcentrífuga contém células colhidas de um poço da placa de 6-poços) e ressuspender as células em uma suspensão homogénea pipetando.</li>
	<li>Lisar as células usando o método de congelamento-descongelamento: incubar os tubos a-80 ° C durante 10 a 15 min. Em seguida, permitir que as células para descongelar no gelo.</li>
	<li>Centrifugue a célula resultante lisada a 16.000 x g por 5 min em uma centrífuga de bancada refrigerada a 4 ° C.</li>
	<li>Transfira o lisado celular total apurado para um tubo de microcentrífuga estéril 1,7 mL no gelo. Descarte a pelota. Nota: O volume final de apagado lisado deve ser ~ 240-250 µ l.</li>
	<li>Adicionar 5 M em NaCl para o desmarcado lisado para uma concentração final de 1M e manter as amostras no gelo.</li>
</ol>4. preparação dos grânulos magnético Streptavidin — II
<ol><li>Preparar o tampão de lavagem de suspenso completa fresco (10 mM KCl, 1,5 mM de MgCl2, 10mm Tris-Cl pH 7,5, 5 mM DTT, 1 M NaCl, 0,5% IGEPAL, 60U/mL Superase e coquetel de inibidor de Protease 1x) Nota: Um estoque de tampão de lavagem de suspenso falta coquetel de inibidor de Protease, Superase e IGEPAL pode ser preparado com antecedência e armazenado à temperatura ambiente. Prepare uma nova fornada de tampão de lise celular completo adicionando os suplementos acima nas concentrações finais recomendadas para a lise celular das ações e armazená-lo em gelo.</li>
	<li>Coloque o tubo contendo os grânulos preparados (da etapa 2.9) sobre o ímã 2 min. Retire cuidadosamente e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Adicione 150 µ l de tampão de lavagem gelada de suspenso completa para os grânulos. Vórtice por 15 s e incubar a temperatura ambiente por 30 a 60 s. lugar dos tubos sobre o ímã 2 min. Retire cuidadosamente e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Repita a etapa 4.3 para um total de 3 vezes.</li>
	<li>Resuspenda as contas em 300 µ l de tampão de lavagem completa de suspenso.</li>
</ol>5. suspenso de complexos de RNAm-miRNA alvo
<ol><li>Transferência de 300 µ l do lisado celular (da etapa 3.8) para o tubo de microcentrífuga contendo 300 µ l de grânulos (da etapa 4.5).</li>
	<li>Incube a mistura em um misturador de oscilador por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Coloca o tubo sobre o ímã para 5 min. Retire cuidadosamente e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Adicione 300 µ l de tampão de lavagem gelada de suspenso completa para os grânulos. Vórtice por 15 s à temperatura ambiente e coloque o tubo sobre o ímã de 5 min. Retire cuidadosamente e descartar o sobrenadante.</li>
	<li>Repita a etapa 5.4 mais duas vezes.</li>
	<li>Resuspenda as contas em 100 µ l de água livre de nuclease e incubar no gelo.</li>
</ol>6. total extração do RNA, síntese de cDNA e qPCR
<ol><li>Extraia o RNA total da ressuspensa missanga (da etapa 5.6) usando um método adequado (ver Tabela de materiais). Resuspenda o RNA total extraído em 25 µ l de água livre de nuclease. Determine a concentração de RNA e a qualidade usando um espectrofotômetro (absorvância a 260/280). Prepare um estoque de trabalho do RNA em 50 ng / µ l.</li>
	<li>Realizar a síntese do cDNA, em triplica, usando 50 ng do RNA total (da etapa 6.1) usando uma síntese do cDNA apropriado kit (veja a Tabela de materiais) usando as primeiras demão do oligo dT em um volume final de 20 µ l (tabela 1). Em seguida, carga da polimerase dentro do instrumento de qPCR para executar a ciclagem térmica conforme as condições descritas na tabela 2.</li>
	<li>
Executar qPCR em CDNA (da etapa 6.2) usando química SYBR Green (ver tabela de materiais):
	<ol>
<li>Realize todas as reações de qPCR triplica em um prato fundo bem clara 96 em condições estéreis.</li>
		<li>Alíquota 9 μL de mistura de reacção com o mestre qPCR misturar (ver quadro 3) em cada poço da placa. Em seguida, adicionar 1 µ l do cDNA a cada poço para alcançar um volume final de 10 µ l. selar a placa do PCR usando selador de placa resistente ao calor do PCR e carregar para o instrumento de qPCR</li>
		<li>Execute a ciclagem térmica conforme as condições descritas na tabela 4.</li>
		<li>Normalize os níveis de expressão (valores de Ct) de cada amostra para os níveis de expressão do controle ovos mexido. Use esses valores para calcular prega mudanças na expressão.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros e não financeiros.

Identificação de alvos de mRNA de miRNAs celulares é importante para a compreensão de sua função reguladora. Várias ferramentas computacionais são empregadas para prever alvos com base na complementaridade de sequência de sementes e conservação de alvo sequências19,20. Embora estas ferramentas são valiosas, podem gerar altos níveis de falsos positivos e falsos negativos. Portanto, estas previsões são acoplados com métodos experimentais, tais como imunoprecipitaçã...

MicroRNAs (miRNAs) são pequenos RNAs que regulam negativamente a expressão de proteínas1não-codificante. Precursores de miRNA residem em clusters através de muitas regiões do genoma, mais frequentemente nas regiões intergênicas e intrões de2,de genes codificantes de proteínas3. Biogênese dos miRNAs envolvem a transcrição dos pri-miRNAs de miRNA-codificação de genes4. Os pri-miRNAs passam por processamento sequencial, primeiro no núcleo e em seguida no citoplasma para gerar o único encalhado miRNAs maduro4,5. Posteriormente, os maduros miRNAs são incorporados o complexo silencioso induzido por RNA (RISC): um complexo proteína-RNA multiméricas que inclui um membro da família Argonaute de proteínas para alvo reconhecimento4,5, 6,7. MiRNAs maduros no complexo do RISC predominantemente ligar os 3' UTR de alvo mRNAs8,9,10 , mas pode também ligar ocasionalmente na codificação e a região 5' UTR do mRNA10,11 . A ligação de miRNA para o mRNA sequências resultados translacional silencioso12,13,14 e em alguns casos mRNA desestabilização15. Desde que um único miRNA pode direcionar muitos mRNAs, estas moléculas reguladoras estão envolvidas em quase todos os processos celulares e têm sido implicadas em várias doença condições16,17,18.
Conhecimento detalhado de como os miRNAs regulam vias celulares requer a identificação dos mRNAs alvo. Múltiplas plataformas de Bioinformática estão disponíveis para prever miRNA:mRNA putativo interações19,20. Estas previsões dependem de emparelhamento base em Watson-Crick perfeito entre a sequência de semente de nucleotídeos de 2 – 8 da miRNA e uma sequência complementar dentro do alvo do mRNA4,21. Além disso, essas ferramentas geram estrutura secundária de duplex miRNA:mRNA, calcular parâmetros termodinâmicos desta interação molecular e mostram conservação dos sítios de ligação entre espécies para melhorar a relevância funcional do alvo Previsão. Infelizmente, essas ferramentas também tem a limitação de prever alvos falsos positivos, em uma taxa muito alta (~ 27 – 70%)15,22. Mais importante ainda, essas plataformas em silico não reconhecem as interações não-canônicos de miRNAs com seus alvos de23. Portanto, essas análises preditivas são muitas vezes combinados com métodos experimentais para validar alvos funcionalmente relevantes.
Várias abordagens têm sido desenvolvidos para validar experimentalmente a interação miRNA:mRNA. Experimentos genéticos usando miRNA imita, esponjas e inibidores que alteram os níveis de miRNAs na célula fornecem pistas para seu efeito regulador sobre o alvo gene expressão24,25,26. Além disso, o repórter com base em ensaios através de transfeccao co de um clone que contém a região 3' UTR de imita de mRNA e miRNA o alvo ou inibidores em células fornecem evidência da função reguladora de miRNAs26. Enquanto esses métodos são cruciais para estudar a regulação pós-transcricional da expressão gênica por miRNAs, transfecção eficiência e pleotropic os efeitos de alterações nos níveis de miRNA celulares são maiores limitações dessas abordagens genéticas23, 26. Portanto, métodos bioquímicos complementares que sondam a interação direta entre miRNA e seu alvo são empregados para entender melhor a função celular de miRNAs.
Um método amplamente utilizado para estudar a interação direta entre miRNA e seu alvo é a imunoprecipitação do complexo do RISC, seguido de detecção de alvo de mRNA dentro do complexo27,28,29,30 . Recentemente, um método melhorado de armadilha RISC também foi utilizado para identificar alvos de miRNA; -casais estabilização de alvos dentro os intermediários de RNAm-miRNA-RISC com a purificação dos alvos de mRNA. No entanto, estes methodsface os desafios inerentes de interacções não-específicas entre proteínas RNA e RNA-obrigatórias que geralmente são segregadas por compartimentos celulares31,32. Além disso, estes ensaios são dependentes da presença da proteína AGO2 para a imunoprecipitação do complexo RISC.33. Dado que AGO2 não é a única argonaute para mediar as interações miRNA:mRNA eficiente, exclusão de outras argonautes pode levar a resultados tendenciosos34. Portanto, estratégias alternativas são necessários para estudar a ligação direta de miRNA para mRNA.
Neste relatório, elaboramos uma abordagem de uma etapa para sondar a interação direta entre uma miRNA e seu alvo mRNA. Primeiro, a 3' biotinilado trancado ácido nucleico (LNA) miRNA imita é transfectadas em células de mamíferos. Em seguida, o miRNA:mRNA complexo no celular lisado é capturada usando esferas magnéticas cobertas com estreptavidina. O alvo do mRNA vinculado a sua complementar miRNA é quantificado usando qPCR.

<table><tbody><tr><td>Células de linhagem celular HEK293T</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal inativado por calor (Hi-FBS)</td> <td>GIBCO / Thermofisher</td><td>10438-026</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco ' s Águia modificada' s meio (DMEM)</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS) (1x)</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>20012-027</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%)&nbsp;</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Penicilina-Estreptomicina (100x)</td><td>Cellgro/Mediatech</td><td>30-002-CI</td><td></td></tr><tr><td>DNase&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM2238</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM Meios de soro reduzidos</td><td>GIBCO / Thermofisher</td><td>3198-088</td><td></td></tr><tr><td>Liopfectamine 2000 Reagente de transfecção</td><td>Invitrogen / Thermofisher</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Has-miR-125b biotinilado</td><td>Exiqon</td><td>339178 / ID-27281622</td><td></td></tr><tr><td>Controle embaralhado biotinilado</td><td>Exiqon</td><td>479997-671 / ID-714884</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>18896</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin Grânulos magnéticos</td><td>Pierce</td><td>88816</td><td></td></tr><tr><td>TRNA de levedura</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td>15401-011</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>Solução de cloreto de potássio (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60142</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio (MgCl<subSolução >2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sódio (NaOH)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429</td><td></td></tr><tr><td>Solução de ácido etilenodiamina tetracético, sal dissódico (EDTA), 0,5 M, pH 8,0</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7889</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>Superase</td><td>Ambion/Thermofisher</td><td>AM2694</td><td></td></tr><tr><td>Coquetel de inibidores de protease</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8340</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de RNAse/DNAse</td><td>GIBCO/Thermofisher</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extração RNeasy</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Kit de síntese de cDNA iScript-Select</td><td>Biorad</td><td>170-8897</td><td></td></tr><tr><td>qPCR Primers&nbsp;</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>iTaq-Universal SYBR verde supermix</td><td>Biorad</td><td>172-5120</td><td></td></tr><tr><td>DynaMag-Spin Ímã</td><td>Invitrogen/Thermofisher</td><td>12320D</td><td></td></tr></tbody></table>

pulldown biotina-baseado do ensaio para validar mrna mirnas alvos de celular

Biotin-based Pulldown Assay to Validate mRNA Targets of Cellular miRNAs

MicroRNAs (miRNAs) são uma classe de pequenos RNAs não-codificante que regulam a expressão gênica celular post-transcriptionally. Os MiRNAs ligam a 3' untranslated região (UTR) do alvo do mRNA para inibir a tradução de proteínas ou em alguns casos causar degradação do mRNA. A ligação do miRNA para o 3' UTR do mRNA é mediada por uma sequência de semente 2 – 8 nucleotídeos na extremidade 5' de miRNA de destino. Embora o papel dos miRNAs como moléculas reguladoras celulares está bem estabelecido, identificação dos mRNAs alvo com relevância funcional permanece um desafio. Ferramentas de Bioinformatic têm sido empregadas para prever sequências dentro a 3' UTR de mRNAs como alvos potenciais para vinculação de miRNA. Essas ferramentas também têm sido utilizadas para determinar a conservação evolutiva de tais sequências entre espécies relacionadas na tentativa de prever o papel funcional. No entanto, estes métodos computacionais frequentemente geram resultados falso-positivos e limitam-se a prever canônica interação entre miRNA e mRNA. Portanto, procedimentos experimentais que medem a vinculação direta de miRNA ao seu alvo de mRNA são necessários para estabelecer a interação funcional. Neste relatório, nós descrevemos um método sensível para validar a interação direta entre o miRNA celular miR-125 e o 3' UTR de PARP-1 mRNA. Elaboramos um protocolo em que imita biotinilado-miRNA sintético foram transfectadas em células de mamíferos e o complexo de miRNA-mRNA no celular lisado foi puxado para baixo com grânulos magnéticos streptavidin-revestido. Finalmente, o destino de que mRNA no ácido nucleico puxado para baixo complexo foi quantificada utilizando uma estratégia baseada em qPCR.

Os MiRNAs regulam processos celulares, ligando-se alvo de mRNAs. Portanto, identificando alvos de mRNA são uma chave para entender a função de miRNA. Aqui, elaboramos um método para identificar o alvo do mRNA de miRNA celular. Este protocolo é adaptado do Wani et al 35 , com a modificação da utilizando biotinilado baseado no LNA miRNA imita a pulldown alvo do mRNA. O uso do LNA-baseado do oligonucleotide imita realça a especificidade da ligação de destino ...

Este relatório descreve um método rápido e confiável para validar alvos de mRNA de miRNAs celulares. O método usa biotinilado sintético baseado no LNA de ácido nucleico trancado miRNA imita para capturar o alvo do mRNA. Posteriormente, grânulos magnéticos streptavidin-revestidas são empregados para pulldown o alvo mRNA para quantificação por qPCR reação em cadeia da polimerase.

Pulldown biotina-baseado do ensaio para validar mRNA miRNAs alvos de celular

MicroRNAs (miRNAs) are a class of small noncoding RNAs that post-transcriptionally regulate cellular gene expression. MiRNAs bind to the 3&#39; ...

Este método pode nos ajudar a responder a perguntas-chave no campo da biologia do mRNA, como se o alvo de mRNA previsto in silico pode interagir diretamente com um microRNA celular específico. A principal vantagem desse método é que ele utiliza imitadores biotinilados para puxar para baixo o mRNA alvo. E esses imitadores biotinilados bloquearam ácidos nucléicos ou química de imitação baseada em LNA, o que ajuda na formação de oligonucleotídeos muito estáveis com uma afinidade muito alta que pode aumentar a especificidade da reação.As implicações dessa metodologia é que ela pode ir desde a compreensão da biologia do microRNA até a terapêutica baseada em microRNA. Isso ocorre principalmente porque, porque todos sabemos que os microRNAs desempenham papéis críticos em todos os aspectos da biologia celular. Portanto, ao identificar os alvos dos microRNAs, esses são os mRNAs, certamente podemos fornecer conhecimento crítico que seria importante para a descoberta e terapêutica.Demonstrando o protocolo estará Sabyasachi Dash, um estudante de pós-graduação de nosso laboratório. Para revestir as esferas magnéticas com estreptavidina, primeiro, vortice as contas completamente para ressuspende

biotin-based-pulldown-assay-to-validate-mrna-targets-cellular

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

A Biblioteca de ID de destino é um plasmídeo baseado em coleta de todo o genoma de cDNA clonado usado para identificar alvos miRNA. Aqui nós demonstrar o seu uso e aplicação.

Genome-wide tela de Metas de miRNA Usando a missão Biblioteca ID Alvo

MicroRNAs (miRNAs) são importantes reguladores da expressão gênica e foram mostrados a desempenhar um papel em inúmeros processos biológicos. Para entender melhor miRNA-UTR interações, criamos uma coleção de todo o genoma de três repórteres UTR luciferase emparelhado com um novo gene luciferase e reagentes de ensaio, o sistema de interruptor.

Metas de identificação de microRNAs humanos com o Sistema de ensaio de luciferase lightswitch usando 3&#39;UTR repórter-Constrói e um microRNA em células aderentes Mimic

A identificação luminescente de elementos funcionais em regiões 3' não traduzidas (3'UTRs) (3'LIFE) é uma técnica para identificar a regulação funcional em 3'UTRs por miRNAs ou outros fatores regulatórios. Este protocolo utiliza metodologia de alto rendimento, como transfecção de 96 poços e ensaios de luciferase, para rastrear centenas de interações putativas quanto à repressão funcional.

Detecção de alvos miRNA em métodos de alta capacidade utilizando o ensaio 3&#39;LIFE

Descrevemos o uso de uma plataforma de expressão gênica multiplexada de alto rendimento que quantifica a expressão gênica por código de barras e contagem de moléculas em substratos biológicos sem a necessidade de amplificação. Usamos a plataforma para quantificar a expressão de microRNA (miRNA) no sangue total em indivíduos com e sem síndrome do intestino irritável.

Perturbações de circulação miRNAs na Síndrome do Cólon Irritável detectada usando um multiplexado de alta capacidade: Plataforma Gene Expression

Este método de suspenso de RNA permite identificar os alvos de RNA de um tempo não-codificantes do RNA (lncRNA). Baseado na hibridação de caseiras, concebidas antido sentidas oligonucleotide sondas de DNA específicas para este lncRNA em um tecido apropriadamente fixo ou linha de células, com eficiência permite a captura de todos os alvos de RNA do lncRNA.

Procedimento de Pull-down de RNA para identificar alvos de RNA de um tempo não-codificantes do RNA

Apresentamos um protocolo para avaliar os níveis de expressão de microRNA (miRNAs) em circulação em amostras de plasma de pacientes com câncer. Em particular, usamos um kit comercialmente disponível para circulação miRNA extração e transcrição reversa. Finalmente, analisamos um painel de 24 miRNAs selecionados usando placas personalizadas em tempo real sonda pre-manchado.

Deteção de um painel personalizado de MicroRNA circulantes em pacientes com câncer colorretal metastático

Este protocolo utiliza uma reação em cadeia da polimerase em tempo real (PCR), um ensaio de sulforhodamina B (SRB), 3 ' regiões não traduzidas (3 ' UTR) clonagem e um ensaio de luciferase para verificar os genes alvo de um miRNA de interesse e para compreender as funções de miRNAs.

Protocolo in vitro para avaliação de níveis de MicroRNA, funções e genes alvo associados em células tumorais

Aqui, apresentamos um novo e totalmente automatizado pipeline de miRNA, mirMachine, que 1) pode identificar miRNAs conhecidos e novos com mais precisão e 2) é totalmente automatizado e disponível gratuitamente. Os usuários agora podem executar um script de envio curto para executar o pipeline mirMachine totalmente automatizado.

mirMachine: Um balcão único para anotação de miRNA de planta

Desenvolvemos um ensaio de repórter de biogênese intrônica para ser usado em células in vitro com quatro plasmídeos: um com miRNA intrônico, um com o alvo, um para superexpressar uma proteína regulatória, e outro para a luciferase renilla. O miRNA foi processado e pôde controlar a expressão da luciferase ligando-se à sequência de alvos.

Um ensaio repórter para analisar a maturação intronic microRNA em células mamíferas

O protocolo descreve um ensaio de hibridização de imunofluorescência em tandem com tecido embebido em parafina fixado em formalina para detectar e quantificar microRNA e proteínas multiplexadas simultaneamente.

Amplificação e reconhecimento de microRNA por meio de hibridização in situ de ácido nucleico bloqueado como um novo método de detecção e quantificação

Aprenda a validar alvos de mRNA de microRNAs celulares usando miméticos de LNA biotinilados. Este método de pulldown oferece alta especificidade e estabilidade para quantificação por qPCR.

Pulldown biotina-baseado do ensaio para validar mRNA miRNAs alvos de celular

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