Pulldown biotina-baseado do ensaio para validar mRNA miRNAs alvos de celular

Este método pode nos ajudar a responder a perguntas-chave no campo da biologia do mRNA, como se o alvo de mRNA previsto in silico pode interagir diretamente com um microRNA celular específico. A principal vantagem desse método é que ele utiliza imitadores biotinilados para puxar para baixo o mRNA alvo. E esses imitadores biotinilados bloquearam ácidos nucléicos ou química de imitação baseada em LNA, o que ajuda na formação de oligonucleotídeos muito estáveis com uma afinidade muito alta que pode aumentar a especificidade da reação.

As implicações dessa metodologia é que ela pode ir desde a compreensão da biologia do microRNA até a terapêutica baseada em microRNA. Isso ocorre principalmente porque, porque todos sabemos que os microRNAs desempenham papéis críticos em todos os aspectos da biologia celular. Portanto, ao identificar os alvos dos microRNAs, esses são os mRNAs, certamente podemos fornecer conhecimento crítico que seria importante para a descoberta e terapêutica.

Demonstrando o protocolo estará Sabyasachi Dash, um estudante de pós-graduação de nosso laboratório. Para revestir as esferas magnéticas com estreptavidina, primeiro, vortice as contas completamente para ressuspender. Em seguida, transfira 30 microlitros dos grânulos ressuspensos em um tubo de microcentrífuga sem nuclease de dois milímetros.

Deixe o tubo cheio com a suspensão magnética do grânulo no ímã por dois minutos. Após dois minutos, remova o sobrenadante com a ajuda de uma micropipeta quando as esferas forem puxadas para o lado do tubo em contato com o ímã. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão de lavagem às contas.

Depois de adicionar o tampão de lavagem, remova o tubo do ímã. Em seguida, agite as contas por 15 segundos para lavá-las. Em seguida, transfira o tubo contendo as esferas magnéticas no ímã por dois minutos.

Após o término da incubação, pipetar o sobrenadante e descartá-lo. Em seguida, adicione 100 microlitros de solução de liberação de RNase aos grânulos. Vortex as contas por 15 segundos para misturar a solução de RNase.

Em seguida, incube as esferas em temperatura ambiente por cinco minutos. Após cinco minutos de incubação, transferir o tubo que contém as esferas magnéticas no íman durante dois minutos. Após a incubação, pipetar o sobrenadante e descartá-lo.

Em seguida, adicione 100 microlitros de solução de ressuspensão aos grânulos e vortex por 15 segundos. Após o vórtice, incubar o tubo à temperatura ambiente durante cinco minutos. Após cinco minutos, transfira o tubo com as esferas magnéticas no ímã por dois minutos.

Após dois minutos, pipetar o sobrenadante e descartá-lo. Em seguida, adicione 200 microlitros de solução de bloqueio de grânulos aos grânulos. Para ressuspender os grânulos na solução de bloqueio, agite-os completamente à temperatura ambiente por 15 segundos.

Em seguida, deixe o tubo em um rotador de vários tubos a quatro graus Celsius por 16 horas. Para preparar o lisado, use um raspador de células e raspe as células HEK293T transfectadas sob a capa laminar. Em seguida, transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de dois mililitros.

Em seguida, submeter a suspensão celular a centrifugação a 1.500g por cinco minutos. Após a centrifugação, dissolva o pellet celular em 1x solução salina tamponada com fosfato mantida em pH 7,2. Repetir o processo de centrifugação, para obter um sedimento residual isento de meio.

Após o término da centrifugação, transfira rapidamente o pellet para o gelo. Em seguida, prepare um novo tampão de lise celular. Depois de preparar o tampão, adicione 260 microlitros de tampão de lise celular completo à amostra no tubo de microcentrífuga.

Pipetar o pellet celular várias vezes para uma suspensão homogênea. Para lisar as células, incube os tubos a 80 graus Celsius por 10 a 15 minutos. Em seguida, deixe as células no gelo.

Repita o processo de centrifugação a 16.000g por cinco minutos em uma centrífuga de bancada a quatro graus Celsius. Após a centrifugação, transferir o sobrenadante contendo lisado para um tubo estéril de 1,7 ml sobre o gelo e expulsar o sedimento. Ao sobrenadante, adicione cloreto de sódio cinco molares para atingir uma concentração final de um molar.

Primeiro, prepare o tampão de lavagem suspenso. Após o bloqueio noturno do grânulo pós-incubação, transfira o tubo contendo os grânulos magnéticos no ímã por dois minutos. Rejeitar o sobrenadante após o período de incubação.

Às contas, adicione 150 microlitros de tampão de lavagem suspenso gelado. Em seguida, vortex as contas em temperatura ambiente por 15 segundos. E incube imediatamente em temperatura ambiente por 30 a 60 segundos.

Após um minuto, transfira o tubo que contém as esferas magnéticas no ímã por dois minutos. Rejeitar o sobrenadante após o período de incubação. Em seguida, ressuspenda os grânulos em 300 microlitros de tampão de lavagem pull-down completo.

Depois de adicionar cloreto de sódio, transfira 300 microlitros do lisado celular para um tubo de microcentrífuga cheio de 300 microlitros de contas. Em seguida, deixe a mistura no misturador de nutação por uma hora em temperatura ambiente. Após uma hora, transfira o tubo no ímã por cinco minutos.

Rejeitar o sobrenadante após o período de incubação. Em seguida, adicione 300 microlitros de tampão de lavagem retrátil completo gelado às contas. Depois que o buffer for adicionado, vortex as contas por 15 segundos em temperatura ambiente.

Em seguida, coloque o tubo no ímã por cinco minutos. Rejeitar o sobrenadante após o período de incubação. Em seguida, dissolva as esferas em 100 microlitros de água livre de nuclease e guarde no gelo.

Isole o RNA total das contas. Em seguida, dissolva o RNA isolado em 25 microlitros de água livre de nuclease. Em seguida, meça a concentração de RNA no espectrofotômetro.

Finalmente, prepare a solução de estoque de RNA a 50 nanogramas por microlitro. Em seguida, use 50 nanogramas do RNA isolado total para sintetizar DNA complementar seguindo as instruções do fabricante. Em seguida, adicione oligoprimers a um volume final de 20 microlitros.

Coloque o tubo de PCR no termociclador e inicie a corrida. Após a conclusão do qPCR, transfira nove microlitros da mistura de reação de PCR em cada poço da placa. Para cada poço, adicione um microlitro de DNA complementar para atingir um volume final de 10 microlitros.

Em seguida, use o selador de placa PCR resistente ao calor para selar a placa PCR e carregar no termociclador. Em seguida, inicie o programa no termociclador. A fim de validar os alvos do miR-125b, os níveis de expressão dos mRNAs alvo de PARP-1 e p53 são estudados.

Curiosamente, os níveis de expressão de mRNAs PARP-1 e p53 são comparativamente mais altos do que o mRNA de Actina, que é o controle negativo. Outros controles negativos usados no experimento são nenhum modelo e três sequências embaralhadas biotiniladas primárias. Além disso, as três principais regiões não traduzidas de PARP-1 e p53 quantificadas também mostram níveis variados de amplificação.

Isso é em comparação com os controles negativos, como Actina, sem molde e três sequências embaralhadas biotiniladas primárias. Essa amplificação de PARP-1 e p53 indica que estes são alvos fortes do miR-125b celular. Uma vez dominada, esta técnica começando com o plaqueamento de células, para a transfecção dos imitadores de LNA marcados com biotina e concluindo com a análise de PCR pode ser feita dentro de uma semana, se realizada corretamente.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como validar os possíveis alvos de mRNA em células de mamíferos. Isso pode ser alcançado com alta especificidade para baixa relação de ruído, introduzindo a transfecção baseada em três principais imitadores de ácidos nucleicos bloqueados marcados com biotina nas células de mamíferos. Não se esqueça de que trabalhar com RNA, especialmente RNA pequeno, como micro RNAs, pode ser altamente sensível e propenso à degradação.

Portanto, as precauções necessárias devem ser tomadas durante a realização deste ensaio, como o uso de água livre de nuclease, tubos de microcentrífugas livres de nuclease e tampões estéreis, e tampões e reagentes recém-preparados devem ser considerados durante a realização deste ensaio para obter melhor sensibilidade e melhores resultados.