Remodelação de membrana das vesículas gigantes em resposta a gradientes de íons cálcio localizadas

Apresentamos uma técnica para manipulação de vesículas gigantes usando gradientes localizados de íons cálcio. A principal vantagem dessa técnica é a estimulação totalmente sem contato da superfície da vesícula e a visualização direta da remodelação da membrana lipídica após a interação com íons cálcio. Nossa abordagem introduz um meio de abordar os detalhes das interações da membrana de íons de cálcio, fornecendo novos locais para estudar os mecanismos de remodelação da membrana celular após mudanças no microambiente celular.

Para iniciar este procedimento, prepare uma solução de lipídios em clorofórmio. A concentração final de lipídios no clorofórmio é de um miligrama por mililitro e a massa final é de 0,6 miligramas. Enrole o frasco de vidro contendo a mistura lipídica com papel alumínio para proteger o conteúdo da luz ambiente.

Coloque o frasco de amostra embrulhado em papel alumínio dentro de um copo de vidro. Para remover o clorofórmio, evaporar o solvente num evaporador rotativo durante três horas, com a pressão a atingir sete quilopascais, vácuo a 80 rpm. Uma película lipídica seca é formada no fundo do frasco de vidro após a evaporação.

Adicione lentamente 600 microlitros de solução salina tamponada com fosfato em cima do filme lipídico seco. Após a adição do tampão, adicione suavemente seis microlitros de glicerol para proteger a amostra da desidratação completa durante a formação de uma vesícula unilamelar gigante conectada a uma vesícula multilamelar, ou GUV-MLV. Feche o frasco de vidro com Parafilm.

E cubra com papel alumínio para proteger da luz ambiente. Conservar o frasco para injetáveis a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, sonicar o frasco de vidro contendo a solução durante um minuto utilizando um banho de ultra-sonicação à temperatura ambiente.

Remova o parafilme e pipete até formar uma solução visualmente uniforme de pequenas vesículas lipídicas. Alíquota de 30 microlitros da solução de vesícula lipídica pequena obtida em tubos plásticos individuais de 0,5 mililitro. Descongelar um tubo de plástico contendo uma alíquota da suspensão congelada de pequenas vesículas lipídicas à temperatura ambiente.

Vortex o tubo quatro vezes por um a dois segundos usando um misturador de vórtice na velocidade máxima. Coloque cinco microlitros da pequena suspensão de vesícula lipídica na superfície de uma lamínula de vidro para formar uma pequena gota redonda. Use uma lamínula de vidro sem nenhuma etapa de pré-limpeza.

Agora, coloque a lamínula de vidro em um dessecador a vácuo por 20 minutos. Armazene o filme lipídico seco em temperatura ambiente por quatro minutos. Em seguida, pipete lentamente 50 microlitros de tampão HEPES de 10 milimolares em cima do filme lipídico seco para reidratação.

Aguarde cinco minutos para pré-formar os complexos GUV-MLV. Centralize uma lamínula de vidro no estágio do microscópio. Em seguida, pipete 300 microlitros de tampão HEPES e posicione o centro da gota acima da objetiva.

Transfira os 50 microlitros de solução GUV-MLV pré-formada para a solução HEPES. Aguarde 25 minutos para permitir que os complexos GUV-MLV esparsamente formados adiram firmemente à superfície da lamínula de vidro. Arredonde as bordas dos capilares de vidro borossilicato, colocando suavemente as extremidades capilares na chama de uma vela para evitar que a micropipeta se quebre enquanto a prende ao porta-micropipeta.

Puxe pelo menos três capilares de vidro usando um extrator automático a laser. Use os capilares de vidro borossilicato referenciados no texto para obter uma micropipeta com a abertura da ponta de aproximadamente 0,3 mícrons de diâmetro. Para evitar entupir a ponta da pipeta, filtre uma solução de cloreto de cálcio de cinco milimolares em solução tampão HEPES usando um filtro de seringa de 0.2 a 0.5 mícron antes do uso.

Em seguida, preencha cada micropipeta com oito microlitros da solução de cloreto de cálcio usando um Microloader. Conecte um suporte de micropipeta a um micromanipulador. Monte a micropipeta firmemente no suporte da micropipeta.

Em seguida, conecte a bomba injetora e o suporte capilar usando o tubo de alimentação. Depois de iniciar a bomba injetora, ajuste as configurações na bomba injetora para uma pressão de injeção de 20 hectopascal. Defina também uma pressão de compensação de cinco hectopascal.

Defina o microscópio para o modo de campo claro. Configure-o para contraste de interferência diferencial. Use o micromanipulador grosso para posicionar a micropipeta acima da gotícula contendo os complexos GUV-MLV.

Localize a ponta da micropipeta acima da objetiva e traga a pipeta até a gota usando o micromanipulador grosso. Defina o microscópio para o modo de fluorescência. Posicione a ponta da micropipeta a uma distância de três mícrons da superfície da membrana enquanto injeta a solução de cloreto de cálcio da micropipeta para permitir a formação de MTPs.

Para transladar o MTPS ao longo da superfície GUV, mova lentamente a ponta da pipeta ao redor da superfície GUV usando o micromanipulador fino. Mantenha aproximadamente a mesma distância entre a superfície GUV e a ponta da micropipeta enquanto continua a injeção de íons cálcio. Para interromper a microinjeção, desligue a bomba injetora.

Uma imagem de microscopia fluorescente representativa de um complexo GUV-MLV imobilizado na superfície de uma lamínula de vidro é mostrada aqui. As saliências tubulares da membrana geradas pela injeção localizada de íons de cálcio na superfície do GUV podem ser vistas nessas imagens. A translação da ponta da micropipeta ao redor da superfície da membrana, conforme indicado pela seta, desencadeia o movimento das saliências tubulares da membrana na direção da fonte de íons cálcio.

Para resumir, propomos uma técnica que permite a remodelação da membrana sem contato de vesículas lipídicas gigantes que resultaram na formação de saliências tubulares da membrana após estimulação localizada com íons de cálcio. As aplicações futuras deste método incluem a transição de vesículas lipídicas sintéticas para membranas biológicas nativas ou a aplicação desta abordagem a sistemas poliméricos com o objetivo de desenvolver plataformas de micromanipulação sem contato.