Name: Fatias de cérebro-hipófise saudáveis para investigações eletrofisiológicas das células da hipófise em peixes teleósteos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 14 s
Description: Aprenda a preparar fatias de cérebro-hipófise viáveis de Oryzias latipes para análise eletrofisiológica com patch-clamp perfurado. Este método permite estudar a comunicação celular e respostas a fatores cerebrais em contexto fisiológico mais intacto.

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Agradecemos a Sra. LourdesCarreon G Tan para lhe ajuda a manter as instalações de medaka e Anthony Peltier para as figuras ilustrativas. Este trabalho foi financiado pelo NMBU e pelo Conselho de pesquisa da Noruega, concessão números 244461 (programa de aquicultura) e 248828 (programa de vida Digital Noruega).

Todo animal manipulação foi realizada de acordo com as recomendações para o cuidado e bem-estar dos animais de pesquisa na Universidade Norueguesa de Ciências da vida e sob a supervisão de pesquisadores autorizados.
1. preparação de soluções e instrumentos
Nota: Todas as soluções devem ser esterilizadas. Cuidadosa atenção deve ser dada para o pH e a pressão osmótica (osmol/kg de água) de todas as soluções, que deve ser cuidadosamente adaptada para o ambiente extracelular das espécies estudadas. pH e pressão osmótica devem ser ajustados com equipamentos eletrônicos precisos como o medidor de pH e ponto de congelamento aparelhos respectivamente.
<ol><li>
Fazer 500 mL de solução extracelular sem Ca2 + (Ca2 + livre CE): 150 mM de NaCl, 5 mM KCl, 1,3 mM MgCl2, glicose de 4 mM, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>Dissolver 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, 61,89 mg de MgCl2, 360,32 mg de glicose e 1,19 g de HEPES em 450 mL de ultrapura (0,055 uS / cm a 25 ° C, a resistividade de 18,2 MOhm) H2O num copo de vidro, utilizando um agitador magnético.</li>
		<li>Ajuste o pH a 7.75 com NaOH.</li>
		<li>Transferi a solução para um balão volumétrico de 500 mL. Encha o balão volumétrico com ultrapura H2O até 500 mL.</li>
		<li>Misture a solução bem antes de medir a osmolalidade. Ajuste para 290 – 300 mOsm com manitol. Filtro de esterilizar a solução usando o sistema de aspiração de água e filtro de 0,2 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fazer 500 mL de solução extracelular (CE): 150 mM de NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, glicose de 4 mM, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>Dissolva 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, 147,01 mg de CaCl2, 61,89 mg de MgCl2, 360,32 mg de glicose e 1,19 g de HEPES em 450 mL de ultrapura H2O num copo de vidro, utilizando um agitador magnético.</li>
		<li>Ajuste o pH a 7.75 com NaOH.</li>
		<li>Transferi a solução para um balão volumétrico de 500 mL. Encha o balão volumétrico com ultrapura H2O até 500 mL.</li>
		<li>Misture a solução bem antes de medir a osmolalidade. Ajuste para 290 – 300 mOsm com manitol. Filtro de esterilizar a solução usando o sistema de aspiração de água e filtro de 0,2 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fazer 500 mL de solução extracelular com 0,1% albumina de soro bovino (CE com BSA): 150 mM de NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,3 mM MgCl2, glicose de 4 mM, 10 mM Hepes.
	<ol>
<li>Dissolva 4,38 g de NaCl, 186,37 mg de KCl, 147,01 mg de CaCl2, 61,89 mg de MgCl2, 360,32 mg de glicose e 1,19 g de HEPES em 450 mL de ultrapura H2O num copo de vidro, utilizando um agitador magnético.</li>
		<li>Ajuste o pH a 7.75 com NaOH.</li>
		<li>Transferi a solução para um balão volumétrico de 500 mL. Encha o balão volumétrico com ultrapura H2O até 500 mL.</li>
		<li>Misture a solução bem antes de medir a osmolalidade. Ajuste para 290 – 300 mOsm com manitol. Filtro de esterilizar a solução usando o sistema de aspiração de água e filtro de 0,2 µm. Adicione 50 mg de BSA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fazer 250 mL de solução intracelular (IC): 110 mM KOH, 20 mM KCl, 10 mM Hepes, sacarose 20 mM.
	<ol>
<li>Dissolva 1,54 g KOH, 327,75 mg de KCl, 595,75 mg de HEPES e 1,712 g de sacarose em 450 mL de ultrapura H2O num copo de vidro, utilizando um agitador magnético.</li>
		<li>Ajuste o pH para 7.2 com (N-Morpholinos) etano (MES) sulfônico.</li>
		<li>Transferi a solução para um balão aferido de 250 mL. Encha o balão volumétrico com ultrapura H2O até 250 mL.</li>
		<li>Misture a solução bem antes de medir a osmolalidade. Ajuste a 280 – 290 mOsm (10 mOsm inferior CE) com sacarose. Filtro de esterilizar a solução usando o sistema de aspiração de água e filtro de 0,2 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fazer 100 mL de solução de agarose derretimento baixo de 2% de Ca2 + e BSA CE livre (livre de 2 g de agarose derretimento baixo em 100 mL de Ca2 + CE). Dissolver usando um microondas e coloque o agarose derretido em um banho de água a 40 ° C. Deixe arrefecer até atingir 40 ° C antes de usar sobre os tecidos. Nota: CE, Ca2 + CE livre pode ser armazenado a 4 ° C por várias semanas se estéril e soluções de IC a-20 ° C, durante vários meses. Agarose pode ser armazenado por uma semana a 4 ° C e pode ser reutilizado em 3 a 5 vezes por microondas brevemente. Reutilização excessiva conduzirá a evaporação e alteração de agarose e concentração de sal e de qualidade.</li>
	<li>
Fazer a ponte de ágar:
	<ol>
<li>Capilares de vidro de borosilicato longa 7,5 mm com diâmetro externo (OD) 2mm de calor e dentro diâmetro (identificação) 1,16 mm, utilizando um bico de Bunsen em um focal ponto cerca de 1/3 de uma ponta até o vidro começa a dobrar. Retirar o vidro da chama e deixar o vidro dobrar com um ângulo de cerca de 120 graus(Figura 2).</li>
		<li>Derreta 2% de ágar na CE normal sem glicose usando um microondas, e enquanto a agarose é líquido preencher o capilar usando a capilaridade de vidro pré-fabricados forças, colocando uma das extremidades do vidro no líquido e, esperando por alguns minutos. Loja pontes até o uso em 4 ° C na CE sem glicose.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare-se vidro de borosilicato com pipetas de remendo de filamento usando um extrator de pipeta apropriada. Consulte o manual do extrator de pipeta para obter a resistência desejada do eletrodo. Nota: O cone da pipeta deve ser tão curto quanto possível. Atarraxamento curta pipeta é conseguida usando-se puxando passos 4-6. A resistência do eletrodo deve ser entre 2 e 6 MΩ dependendo do tamanho da célula.</li>
	<li>
Para evitar o movimento do tecido durante os experimentos de remendo-braçadeira revestir a superfície da câmara de gravação com 0,1% do polyethylenimine (PEI) em tampão de borato.
	<ol>
<li>Prepare 500 mL de tampão de borato (25 mM):<ol>
<li>Dissolva 4,768 g de Na2B4O710 H2O em 450 mL de ultrapura H2O num copo de vidro, utilizando um agitador magnético.</li>
			<li>Ajuste o pH para 8,4 com HCl.</li>
			<li>Transferi a solução para um balão volumétrico de 500 mL. Encha o balão volumétrico com ultrapura H2O até 500 mL e 0,2 µm filtro esterilizar a solução usando o sistema de aspiração de água.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Prepare uma solução de 1% das ações de PEI (1 mL 50% PEI para 49 mL de tampão de borato 25 mM) e uma diluição de PEI 0,1% diluição 10 µ l de solução 1% em 100 µ l de tampão de borato para utilização final.</li>
		<li>Adicione 2 mL de 0.1% PEI no vidro do titular da fatia e deixe o revestimento incubar durante 1 minuto. Então brevemente lavar o copo duas vezes com 5 mL de ultrapura H2O... e deixe o ar seco até o uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Prepare soluções de anfotericina B.
	<ol>
<li>Faça 60 mg/mL de solução dissolvendo-se 3 mg de anfotericina B em pó em 50 µ l dimetil sulfóxido (DMSO), em um tubo de 1 mL, protegido da luz. Vórtice na velocidade máxima por 30 s e proceda à sonicação durante 15 min homogeneizar. Armazenar as alíquotas para tubos de 3 – 5 a-20 ° C e usar a alíquota de um por dia. Nota: Se a solução estoque de anfotericina B não é clara e amarela cor mas leitoso (amarelo ainda), depois de 15 – 20 min sonication tornar-se uma nova solução.</li>
		<li>Fazer solução de IC com anfotericina B por pipetagem 2ml do IC para um copo de vidro limpo com mais de 10 mL de capacidade. Adicionar 8 µ l de solução-mãe de anfotericina B para a solução da pipeta e misture por pipetagem. Envolva o copo com folha de alumínio e coloque no gelo até o uso e renová-lo a cada 3h.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. dissecção e cortar com Vibratome
<ol><li>Prepare as ferramentas de dissecação antes de dissecar, incluindo uma afiada e uma pinça forte com uma tesoura. Limpar as ferramentas (suporte do tecido, pincel, pinça) com etanol e certifique-se de que eles são usados apenas para fins de dissecação e nunca em contacto com tecidos fixos. Mantê-los em uma caixa separada para evitar contaminação.</li>
	<li>Eutanásia o peixe em água fria de gelo por 1 min.</li>
	<li>
Siga as etapas subsequentes para dissecar rapidamente o medaka cérebro e hipófise com Pinças afiadas (usar não mais que 3 min).
	<ol>
<li>Enquanto segurando o peixe com a pinça forte grave os dois nervos ópticos atrás dos olhos com uma tesoura ou pinça em ponto.</li>
		<li>Abra a parte dorsal do crânio do posterior para o lado anterior por quebrar os ossos do crânio passo a passo com pinça forte.</li>
		<li>Retire o crânio de um lado com pinça forte.</li>
		<li>Grave da medula espinhal com tesoura ou pinça afiada.</li>
		<li>Suavemente, pegar a medula espinhal com a pinça, virar o cérebro de posterior para anterior e coloque-o em um prato com o gelado Ca2 + grátis CE.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Encher um molde de metal3 1,5 a 2 cm com agarose líquido e coloque-o no gelo.</li>
	<li>Antes da agarose solidifica (em torno de 25 – 30 ° C), gentilmente agarrar o cérebro pela medula espinhal com o fórceps, secar a pinça com um pedaço de papel fino e coloque o tecido no agarose. Misture rapidamente o agarose para diluir os vestígios da CE o tecido parietal esquerdo e orientar o tecido e deixar o molde em gelo por alguns segundos até que a agarose endurece. Nota: É essencial para esta etapa ser rápido. A agarose solidifica rapidamente como o molde metálico é arrefecido pelo gelo.</li>
	<li>Corte um bloco quadrado de agarose contendo o tecido com uma lâmina de bisturi e cola-lo no porta-amostra vibratome usando cola de cirurgia (tóxicos).</li>
	<li>Encher a cubeta do vibratome receber o suporte de amostra (cérebro-pituitária) com gelado Ca2 + grátis CE.</li>
	<li>Introduza o suporte do espécime a vibratome e cortar o bloco de agarose para tornar parasagital seções de 150 µm, usando a alta frequência e a baixa velocidade para o corte. Recolher as seções selecionadas e colocá-los na câmara de gravação de remendo-braçadeira com 3ml da gelada Ca2 + grátis CE.</li>
	<li>Coloque a harpa de grade (Figura 2B) na seção de tecido. Nota: A harpa será junto com o revestimento estabilizar o tecido e impedir a movimentação durante as gravações de remendo-braçadeira.</li>
	<li>Depois a harpa está no lugar, mude o Ca2 + grátis CE médio para o CE normal com Ca2 + e BSA. Deixe o resto de tecido por 10 min.</li>
</ol>3. perfurado Patch-clamp e eletrofisiológicas gravações
<ol><li>Antes de iniciar o experimento, o cloreto de prata fio eletrodos pelas seguintes etapas: primeiro, use uma lixa fina (p180) para limpar os eletrodos de fio de prata. Em segundo lugar, enxague com 2 mL, de etanol a 70%. Em terceiro lugar, mergulhe os fios em 2 mL, 2 – 5% de cloro por 10 min. Finalmente, enxaguar com 2 mL, ultrapura H2O.</li>
	<li>Coloque a câmara de gravação com a fatia de cérebro-hipófise na fase de microscópio e localizar a área de alvo (hipófise) com objetivo de X 10 e inspecionar as células com o objectivo de X 40. Nota: Se a preparação for bem sucedida, muito poucas células redondas devem ser visíveis. Esses redondos são células geralmente danificadas que são desanexação do tecido.</li>
	<li>Coloque o eletrodo de aterramento através da ponte de ágar de 2% para o banho do CE.</li>
	<li>Localize uma célula saudável usando o objectivo X 40. Nota: Uma célula saudável deve ser firmemente anexada para o pedaço de tecido e não arredondada e desanexada da fatia.</li>
	<li>Definir o amplificador em tensão-braçadeira (VC; Modo de Figura 4A ponto 1). Abrir o selo teste janela e pressione o banho configuração (Figura 4B os pontos 1 e 2. Use um pulso de 5-mV para monitorar a resistência de pipeta (Figura 4B ponto 3).</li>
	<li>A ponta da pipeta com a solução de IC antifúngica gratuita antes de adicionar a solução de IC com anfotericina B, utilizando uma seringa de enchimento microremendo de aterramento (ver Figura 3).</li>
	<li>Adicione uma pressão ligeiramente positiva de ar dentro da pipeta de remendo usando a seringa de 1 mL. Nota: Isto faz um pequeno fluxo líquido da pipeta remendo que evite a contaminação da ponta.</li>
	<li>Uma vez no banho, avaliar a resistência de uma pipeta de remendo e certifique-se de que nenhuma partícula é anexada a ponta da pipeta (Figura 4). Nota: Um pequeno pedaço de fita é anexado para o monitor exibindo a forma de gravação de vídeo, o campo de visão. Isso faz com que o posicionamento da pipeta remendo em relação à célula mais fácil quando o objetivo é não focando a célula.</li>
	<li>Guia da pipeta de remendo para baixo a célula usando Micromanipuladores. Nota: Certifique-se que a pipeta é limpa, procurando por pequenas partículas que podem ter ligado para a ponta da pipeta. Mudanças súbitas na resistência também podem ser um resultado de partículas preso na ponta da pipeta.</li>
	<li>Reajustar a pipeta quando alguns mícrons acima a célula para que a ponta da pipeta tocará a célula 1/3 do meio da célula, como mostrado na Figura 5. Quando tocar o celular, liberar a pressão e aplicar a sucção suave para fazer uma vedação. Nota: O tempo da pipeta remendo entra o banho para uma bem sucedida selo deve ser mantido tão curtos quanto possível. Não mais do que 1 – 1,5 min para evitar a anfotericina B, atingindo a ponta da pipeta e fuga para o banho.</li>
	<li>Imediatamente, alterne para a janela de remendo no software remendo-braçadeira (Figura 4 D ponto 1) e têm um potencial de exploração entre-50 e a-60 mV (ponto4 da figura 2). Zero fora a capacitância rápida composta pela pipeta de vidro (ponto4 da figura 3).</li>
	<li>Alterne para a janela da cela no software remendo-braçadeira (Figura 4E os pontos 1 e 2) e iniciar o monitoramento de resistência de acesso, Ra, exibida na janela. Zerar a capacitância de membrana no software do amplificador (Figura 4E ponto 3) após acesso suficiente. Nota: Acesso suficiente pode demorar de 10 a 30 min (Figura 4E ponto 2). Um bom acesso para gravações de braçadeira atual deve estar abaixo de 20 M.</li>
	<li>Alternar para braçadeira atual, IC, na janela de software do amplificador (Figura 4F ponto 1). Ajuste as correntes rápido-capacitivo na janela - braçadeira do software para o mesmo valor 3.12 amplificador (Figura 4F ponto 2 e 3). Verifica o potencial de membrana (Figura 4F ponto 1). Nota: Importante, se o potencial de membrana é superficial (típico acima -35 mV) a célula pode estar danificada. Cancelar a gravação e encontrar uma nova célula.</li>
	<li>Depois de encontrar uma célula saudável (firmemente ligado ao tecido com membrana potencial abaixo de -40 mV), começam as gravações experimentais como detalhadas do fabricante protocolo 33,34.</li>
</ol>

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Os autores não têm nada a divulgar

Eletrofisiológicas gravações usando a técnica patch-clamp em fatias de cérebro-hipófise exigem cuidadosa otimização. Protocolos bem otimizados para a realização de investigações de viver-pilha especificamente em teleósteos são limitados, com a maioria das publicações usando protocolos baseados em sistemas de mamíferos. A este respeito, é importante estar ciente do fato de que vários parâmetros fisiológicos como pH e pressão osmótica são não só espécies dependentes, mas também muito dependente se o organismo em questão vi...

A hipófise é um órgão endócrino chave nos vertebrados, localizados abaixo do hipotálamo e posteriores para o quiasma óptico. Produz e secreta hormônios de seis a oito dos tipos de célula específica. Hormônios hipofisários constituem um intermediário entre o cérebro e os órgãos periféricos e conduzir a uma grande variedade de processos fisiológicos essenciais, incluindo o crescimento, reprodução e regulação da homeostase. Semelhante a neurônios, células endócrinas da hipófise são eletricamente excitáveis com a capacidade de potenciais de ação de fogo espontaneamente 1. O papel destes potenciais de ação é dependente de célula. Em vários tipos de células da hipófise mamíferos, potenciais de ação podem elevar o intracelular Ca2 + suficientemente para uma liberação sustentada de hormônio 2. Além disso, a hipófise recebe informações estimulatórios e inibitórias do cérebro que afeta o potencial de membrana das células 3,4,5,6. Normalmente, entrada estimulatório aumenta a excitabilidade e muitas vezes envolve a liberação de Ca2 + de lojas intracelulares bem como aumentou a frequência 7a disparar. Compreender como a célula utiliza a composição de canais de íon e adapta-se a estes sinais de entrada do cérebro é chave para a síntese de hormônio de compreensão e libertação.
A técnica da remendo-braçadeira foi desenvolvida na década de 1970 pela Sakmann e Neher 8,9,10 e melhorada pelo Hamill 11e permite investigações detalhadas das propriedades eletrofisiológicas das células até canais de íon único. Além disso, a técnica pode ser usada para estudar a corrente e a tensão. Hoje, remendo de aperto é o padrão de ouro para medir propriedades eletrofisiológicas da célula. Quatro configurações principais da técnica patch-clamp selo apertado foram desenvolvidos 11; o celular conectado, de dentro para fora, o fora-out e o patch de células inteiras. As três primeiras configurações são normalmente utilizadas para investigações de canal único íon. Para o quarto, seguindo a configuração de conexão de celular, um buraco na membrana celular é feito usando a pressão atmosférica sub. Esta configuração também permite que as investigações da composição iônica canal do celular total 12. No entanto, uma limitação dessa técnica é que moléculas citoplasmáticas são diluídas pelo patch pipeta solução 13 (Figura 1A), afetando as respostas elétricas e fisiológicas das células estudadas. Na verdade, algumas dessas moléculas podem desempenhar um papel importante na transdução do sinal ou na regulação dos canais iônicos diferentes. Para evitar isso, Lindau e Fernandez 14 desenvolveu um método onde um composto formadoras de poros é adicionado para a pipeta de remendo. Após a configuração de conexão de celular, o composto irá incorporar a membrana plasmática sob o patch e lentamente perfurar a membrana criando contato elétrico com o citosol (Figura 1B). Podem ser usado vários diferentes antifúngicos tais como nistatina 15 e anfotericina B 16, ou surfactantes como o beta-escina de saponina 17,18 . Estes compostos criar poros grandes o suficiente para permitir que o cátion monovalente e Cl– difusão entre o citosol e a pipeta de remendo, preservando os níveis citosólico de macromoléculas e o maiores íons como Ca2 + 15, 16.
O desafio de usar patch perfurada é a resistência série potencialmente elevados. Resistência série (Rs) ou acesso de resistência é a resistência combinada sobre a pipeta de remendo em relação ao solo. Durante as gravações do remendo-braçadeira, o Rs será em paralelo com a resistência da membrana (Rm). Rm e Rs em trabalho paralelo como um divisor de tensão. Com a alta Rs, a tensão vai cair o Rs dando erros nas gravações. O erro se tornará maior com maiores correntes gravadas. Além disso, o divisor de tensão é também frequência dependente, criando um filtro passa-baixa, afectando assim a resolução temporal. Com efeito, o patch perfurado pode não sempre permitir gravações do grandes e rápidas as correntes como a voltagem dependente correntes at+ (para leituras detalhadas consulte referência 19). Além disso, Rs pode variar durante gravações de remendo-braçadeira, novamente, levando a mudanças na corrente gravada. Assim, falsos positivos podem ocorrer em situações onde Rs muda durante a aplicação da droga.
A eletrofisiologia no tecido cortado foi introduzida primeiramente pelo laboratório para o estudo eletrofisiológicas características dos neurônios no cérebro 20Andersen. A técnica pavimentou o caminho para investigações detalhadas de células únicas, bem como circuitos de comunicações e célula célula célula num ambiente mais intacto. Uma técnica semelhante para fazer fatias da hipófise foi introduzida em 1998 por Guérineau et al 21. no entanto, não foi antes de 2005, que a preparação da fatia do cérebro-hipófise foi usada com sucesso para estudos de remendo-braçadeira em teleósteos 22. Neste estudo, os autores também relataram o uso de gravações de remendo-braçadeira perfurada. No entanto, de longe, a maioria das investigações eletrofisiológicas das células da hipófise foram realizada em mamíferos e apenas um punhado de outros vertebrados, incluindo peixes teleósteos 1,2,22,23 . Em teleósteos, quase todos os estudos foram realizados em células dissociadas primária 24,25,26,,27,28,29,30 .
No presente trabalho, descrevem um protocolo otimizado para preparação de fatias de cérebro-hipófise saudáveis de medaka de peixe o modelo. A abordagem representa várias vantagens em comparação com as culturas de células dissociadas primário. Primeiro, as células são gravadas em um ambiente relativamente preservado em relação ao dissociar as condições de cultura celular. Em segundo lugar, preparações de fatia nos permitem estudar vias indiretas, mediadas por célula-célula comunicação 22, que não é possível em condições de cultura de células dissociadas. Além disso, demonstraremos como realizar gravações eletrofisiológicas sobre as fatias de tecido obtidos utilizando a técnica de perfurada células inteiras remendo-braçadeira com anfotericina B como o agente de formação de poros.
Medaka é um pequeno peixe de água doce nativo da Ásia, encontrada principalmente no Japão. A fisiologia, embriologia e genética do medaka têm sido muito estudadas por mais de 100 anos, 31, e é um modelo de pesquisa comumente usado em muitos laboratórios. De particular importância para este papel é a organização morfológica distinta do complexo hipotálamo-hipófise em peixes teleósteos: Considerando que em mamíferos e aves, os neurônios do hipotálamo liberar os neuro-hormônios regulam as células endócrinas da hipófise para o sistema portal da Eminência mediana, há uma projeção nervosa direta dos neurônios hipotalâmicas para as células endócrinas da hipófise em peixes teleósteos 32. Assim, corte cuidadosamente conduzido de cérebro-hipófise é de particular importância no peixe, que nos permite investigar características eletrofisiológicas das células da hipófise em uma rede de cérebro-hipófise bem preservada e em particular como na hipófise células controlar sua excitabilidade e, assim, a homeostase de Ca2 + .

<table><tbody><tr><td>Vibratome</td><td>Leica</td><td>VT1000 S</td><td></td></tr><tr><td>Cola cirúrgica</td><td>WPI</td><td>VETBOND</td><td>3M Vetbond Adesivo de tecido</td></tr><tr><td>Lâminas de aço inoxidável</td><td>Campden Instruments</td><td>752-1-SS</td><td></td></tr><tr><td>moldes de metal</td><td>SAKURA</td><td>4122</td><td></td></tr><tr><td>harpa de aço</td><td>Warner instruments</td><td>64-1417</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>SIGMA</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>Ultrapure LMP agarose</td><td>invitrogen</td><td>166520-100</td><td></td></tr><tr><td>patch pipetas</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF150-110-10HP</td><td>Borosilicato com filamento O.D.:1,5 mm, I.D.:1,10 mm</td></tr><tr><td>Microscópio Slicescope</td><td>Scientifica</td><td>pro6000</td><td></td></tr><tr><td>P-Clamp10</td><td>Molecular Devices</td><td>#1-2500-0180</td><td>software digitalizador</td></tr><tr><td>Digidata 1550A1</td><td>Amplificador Molecular Devices</td><td>DD1550</td><td></td></tr><tr><td>Multiclap 700B Headstage CV-7B</td><td>Molecular Devices</td><td>1-CV-7B</td><td></td></tr><tr><td>GnRH</td><td>Bachem</td><td>4108604</td><td>H-Glu-His-Trp-Ser-His-Gly-Leu-Ser-Pro-Gly-OH sal de trifluoroacetato&nbsp;</td></tr><tr><td>extrator de pipetas</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>anfotericina B</td><td>SIGMA</td><td>A9528</td><td>antibiótico formador de poros</td></tr><tr><td>polietilenomina&nbsp;</td><td>SIGMA</td><td>P3143</td><td>50% PEI solução</td></tr><tr><td>microfiler seringa</td><td>WPI</td><td>MF28/g67-5</td><td></td></tr><tr><td>vidro para a ponte de ágar</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF200-116-15</td><td>Borosilicato com filamento O.D.:2.0 mm, I.D.:1.16 mm</td>Software</tr><tr><td></td><td></td><td>Micro-Manager</td> Polido a fogo <td>Software de Microscopia de Código Aberto</td></tr><tr><td>optiMOS sCMOS câmera</td><td>Qimaging</td><td>&nbsp; 01-OPTIMOS-R-M-16-C</td><td></td></tr><tr><td>sonicator</td><td>Elma</td><td>D-7700 singen</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SiGMA</td><td>S3014</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SiGMA</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>SiGMA</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>D-Glicose</td><td>SiGMA</td><td>G5400</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>SiGMA</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>SiGMA</td><td>C8106</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>SiGMA</td><td>84097</td><td></td></tr><tr><td>D-manitol</td><td>SiGMA</td><td>63565</td><td></td></tr><tr><td>MES-ácido</td><td>SIGMA</td><td>M0895</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>SIGMA</td><td>A2153</td><td></td></tr></tbody></table>

fatias de cérebro-hipófise saudáveis para investigações eletrofisiológicas das células da hipófise em peixes teleósteos

Healthy Brain-pituitary Slices for Electrophysiological Investigations of Pituitary Cells in Teleost Fish

Foram realizadas investigações eletrofisiológicas das células da hipófise em numerosas espécies de vertebrados, mas muito poucos em peixes teleósteos. Entre estes, a maioria clara foram realizada na dissociadas as células primárias. Para melhorar a nossa compreensão de como teleósteos células da hipófise, comportar-se em um ambiente mais biologicamente relevante, este protocolo mostra como preparar fatias de cérebro-hipófise viáveis usando o medaka pequenos peixes de água doce (Oryzias latipes). Fazendo as fatias de cérebro-pituitária, pH e pressão osmótica de todas as soluções foram ajustados aos valores encontrados em fluidos do corpo dos peixes de água doce, vivendo a 25 a 28 ° C. Após a preparação da fatia, o protocolo demonstra como realizar gravações eletrofisiológicas, usando a técnica de perfurada remendo-braçadeira de células inteiras. A técnica patch-clamp é uma ferramenta poderosa com resolução temporal sem precedentes e sensibilidade, permitindo a investigação das propriedades elétricas das células inteira intactas até canais iônicos único. Remendo perfurado é o único que mantém o ambiente intracelular intacto impedindo que elementos reguladores no citosol sendo diluído pela solução de eletrodo de pipeta de remendo. Em contraste, ao realizar gravações de células inteiras tradicionais, observou-se que as células da hipófise medaka rapidamente perdem a capacidade de disparar potenciais de ação. Entre as várias técnicas de perfuração disponíveis, este protocolo demonstra como realizar a perfuração da membrana remendada usando o fungicida anfotericina b.

Este protocolo demonstra um protocolo passo a passo de como conseguir confiança gravações eletrofisiológicas de células da hipófise (gonadotróficas), usando uma linha de transgénicos medaka [Tg (CLB- hrGfpII)] onde o alvo células (Lh-produzindo gonadotropes) são etiquetados com proteína verde fluorescente (GFP).
Inicialmente, as investigações eletrofisiológicas foram realizadas usando a configuração de células inteiras....

O artigo descreve um protocolo otimizado para fazer fatias de tecido cerebral-hipófise viável, usando o medaka peixes teleósteos (Oryzias latipes), seguido por gravações eletrofisiológicas de células da hipófise, usando a técnica de remendo-braçadeira com o configuração de remendo perfurada.

Fatias de cérebro-hipófise saudáveis para investigações eletrofisiológicas das células da hipófise em peixes teleósteos

Electrophysiological investigations of pituitary cells have been conducted in numerous vertebrate species, but very few in teleost fish. Among these, the ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neuroendocrinologia. Por exemplo, como as células da hipófise se comunicam, respondem ao fator de liberação do cérebro? A principal vantagem desta técnica é que, em comparação com esta primeira cultura de células primárias, este procedimento permite a investigação de células em um ambiente mais intacto.Embora este método possa fornecer informações sobre as propriedades elétricas das células produtoras de hormônio luteinizante em Medaka. Com apenas pequenos ajustes, também pode ser usado para outros tipos de células ou para outras espécies de peixes. Enquanto segura um peixe teleósteo sacrificado com uma pinça forte esterilizada com etanol sob um microscópio de dissecação, corte os dois nervos ópticos atrás dos olhos com uma pinça afiada e quebre os ossos do crânio do lado posterior para o anterior.Use a pinça para descascar o crânio e cortar a medula espinhal. Agarrando suavemente a medula espinhal com a pinça, vire o cérebro da orientação posterior para a anterior e coloque o órgão em um prato cheio de meio extracelular gelado e sem cálcio. Em seguida, preencha um porão de metal de um vírgula cinco a dois centímetros cúbicos com agarose líquida e coloque o molde no gelo.Pouco antes de a agarose se solidificar, use a pinça para pegar suavemente o cérebro pela medula espinhal, seque a pinça com um pedaço de papel de laboratório e coloque o cérebro na agarose. Em seguida, misture rapidamente a agarose para diluir quaisquer vestígios de meio celular extra deixados no tecido e ajuste a orientação do cérebro dentro do molde conforme necessário. Quando a agarose estiver solidificada, use uma lâmina de bisturi para aparar um bloco quadrado de agarose ao redor do tecido e use cola cirúrgica para prender a amostra em um suporte de amostra de vibratomo.Encha a cubeta do suporte do vibratomo com meio extracelular gelado e sem cálcio e coloque o suporte no vibratome. Usando uma alta frequência e uma baixa velocidade, corte o bloco de agarose para fazer seções parassagitais de 150 micrômetros, colocando a seção selecionada nas câmaras de registro de grampo contendo três mililitros de solução extracelular gelada e sem cálcio. É importante mover-se rapidamente depois que o cérebro for adicionado à agarose, pois o tecido secará se for deixado na agarose moldada por muito tempo e terá acesso limitado ao ar antes de ser seccionado.Quando todas as seções tiverem sido obtidas, coloque uma harpa de grade na seção de tecido e substitua o meio extracelular livre de cálcio por meio extracelular contendo cálcio suplementado com albúmen de soro bovino. Em seguida, deixe o tecido descansar por 10 minutos. Para configurar o patch-clamp, coloque a câmara de gravação com a fatia da hipófise cerebral no estágio do microscópio de gravação do patch-clamp e use a objetiva 10X para localizar a glândula pituitária.Coloque o eletrodo de aterramento através da ponte de ágar 2% no banho de meio celular extra e use a objetiva 40X para localizar uma célula saudável. Defina o amplificador para voltage clamp modo e abra a janela de teste de vedação. Selecione a configuração do banho e use um pulso de cinco milivolts para monitorar a resistência da pipeta.Encha a ponta da pipeta com meio intracelular livre de antifúngicos antes de usar uma seringa de micropreenchimento para adicionar solução intracelular suplementada com anfotericina B na seção posterior da pipeta de adesivo. Use uma seringa de um mililitro para adicionar uma pressão de ar ligeiramente positiva na pipeta de remendo para evitar a contaminação da ponta da pipeta e avaliar a resistência da pipeta de remendo. Se nenhuma partícula estiver presa à ponta da pipeta, use os micromanipuladores para guiar a pipeta de conexão até a célula.Reajustar a pipeta quando ela estiver alguns mícrons acima da célula, de modo que a ponta da pipeta toque a célula a um terço da distância do meio da célula. Para tocar na célula, libere a pressão e aplique uma sucção suave para fazer uma vedação. É essencial aplicar o gigaseal rapidamente, pois a pressão positiva dentro da pipeta de adesivo resultará em vazamento de solução antifúngica após cerca de um minuto, danificando as células.Quando a vedação estiver no lugar, mude imediatamente para a janela de conexão no software patch-clamp e ajuste o potencial de retenção entre 50 e 60 milivolts negativos. Zere a capacitância rápida composta pela pipeta de vidro e mude para a janela da célula para começar a monitorar a resistência de acesso, zerando a capacitância da membrana no software do amplificador após acesso suficiente. Mude para o alicate de corrente e ajuste o valor correto das correntes capacitivas rápidas da pipeta na janela I-Clamp e verifique o potencial de membrana resultante.Em seguida, com a célula firmemente presa a um tecido com potencial de membrana abaixo de 40 milivolts negativos, inicie os registros experimentais de acordo com o protocolo do fabricante. Os potenciais de ação podem ser acionados em um subconjunto de células hipofisárias usando cinco a nove injeções de corrente de picoampere de um potencial de repouso entre 50 e 60 milivolts negativos. Esses potenciais de ação têm um resumo rápido e, após cerca de quatro a seis minutos, os potenciais de ação desencadeados não são mais alcançáveis.Mudando para a configuração de adesivo perfurado usando anfotericina B, potenciais de ação espontâneos podem ser observados em cerca de 50% das células registradas e os potenciais de ação podem ser acionados em 95% dessas células sem rundown observável, mesmo após até uma hora de registros. O hormônio liberador de gonadotrofina um, sopro ejetado nas células na configuração de adesivo perfurado, revela uma resposta bifásica, durante a qual as células são hiperpolarizadas na primeira fase da resposta, resultando na liberação de cálcio dos estoques internos seguida pela despolarização das células e aumento da frequência de disparo do potencial de ação de um a dois hertz para três hertz na segunda fase. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que todas as soluções devem ser adaptadas à fisiologia do organismo experimental que você está usando, neste caso, Medaka, e você precisa ter atenção especial ao pH, pois esse valor varia entre as espécies que vivem em diferentes temperaturas.

healthy-brain-pituitary-slices-for-electrophysiological

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Usamos a técnica patch-clamp para medir GABA-activated single-channel correntes (GABAA canais, receptores GABAA) e as correntes sinápticas e tônico que eles geram em neurônios. Ativação dos canais diminui a excitabilidade neuronal na saúde e na...

GABA-activated Correntes canal único e Tonic em fatias de cérebro de rato

Aqui nós descrevemos um protocolo para a preparação de agar-embedded fatias da retina que são adequados para eletrofisiologia e Ca2 + imagem. Este método permite que um estudo de fita do tipo sinapses em microcircuitos da retina usando direto de patch-clamp gravações de um único terminais nervosos pré-sinápticos.

Patch-clamp medidas de capacitância e Ca 2 + Imaging nos terminais nervosos da retina único em Fatias

Neste vídeo, vamos demonstrar como para registrar a atividade elétrica dos neurônios individuais identificados em uma preparação do cérebro inteiro, o que preserva os circuitos neurais complexos. Usamos peixe transgênico no qual hormônio liberador de gonadotrofinas (GnRH) neurônios são geneticamente marcadas com uma proteína fluorescente para identificação na preparação cérebro intacto.

Registro da atividade elétrica dos neurônios identificados no cérebro intacto de peixes transgénicos

Os procedimentos são descritos para realizar registros simultâneos do potencial ou corrente de membrana e alterações da concentração de cálcio intracelular. Os neurônios do núcleo supraquiasmático são preenchidos com o indicador de cálcio bis-fura-2 usando um eletrodo de patch clamp na configuração de patch clamp de célula inteira.

Registro eletrofisiológico simultâneo e imagem de cálcio de neurônios do núcleo supraquiasmático

Este artigo descreve como um peixe-zebra adulto podem ser imobilizados, entubado, e usado para experimentos in vivo eletrofisiológicos para permitir gravações e manipulação da atividade neural em um animal intacto.

Gravação eletrofisiológica no cérebro de Intacta Zebrafish Adulto

Aqui descrevemos um protocolo para preparar e manter as culturas de células da hipófise primário de medaka (Oryzias latipes). As condições otimizadas no presente protocolo considerar parâmetros importantes, tais como temperatura, pH e pressão osmótica imitando as condições fisiológicas dos peixes, possibilitando resultados fisiologicamente mais significativos.

Preparação de uma cultura de célula primária de alta qualidade do peixe Pituitaries

Aqui, apresentamos protocolos para a preparação de cortes cerebrais agudos contendo o núcleo geniculado lateral e a investigação eletrofisiológica da função das sinapses retinogeniculado e corticogeniculado. Este protocolo fornece uma maneira eficiente de estudar sinapses com a probabilidade de liberação alta e de baixa liberação nas mesmas fatias cerebrais agudas.

Investigações eletrofisiológicas de Retinogeniculate e função do Synapse de Corticogeniculate

O artigo descreve um protocolo rápido para a rotulagem de vasos sanguíneos em um peixe teleósteo por perfusão cardíaca de DII diluído em fixador, usando Medaka (Oryzias latipes) como um modelo e focando no cérebro e tecido hipofisário.

Rotulagem de vasos sanguíneos no cérebro Teleost e pituitária usando a perfusão cardíaca com um DiI-fixative

Uma nova técnica sem fio para a gravação de sinais neurais extracelulares do cérebro de peixinho dourado livremente natação é apresentado. O dispositivo de gravação é composto por dois tetródos, um microdrive, um registrador de dados neurais e uma caixa impermeável. Todas as peças são feitas medida, exceto para o registrador de dados e seu conector.

Gravação eletrofisiológica sem fio dos neurônios por tetrodes móveis em peixes livremente da natação

O protocolo apresentado descreve o transporte e a preparação de tecido hipocampal humano ressecado com o objetivo final de usar fatias cerebrais vitais como uma ferramenta de avaliação pré-clínico para potenciais substâncias antiepilépticas.

Preparação de fatias hipocampais humanas agudas para gravações eletrofisiológicas

Aprenda a preparar fatias de cérebro-hipófise viáveis de Oryzias latipes para análise eletrofisiológica com patch-clamp perfurado. Este método permite estudar a comunicação celular e respostas a fatores cerebrais em contexto fisiológico mais intacto.

Fatias de cérebro-hipófise saudáveis para investigações eletrofisiológicas das células da hipófise em peixes teleósteos

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