Análise das células do epitélio do pigmento da retina humana, diferenciação e manutenção: um modelo de doença-em-um-prato de mutações BEST1

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo das doenças retinianas relacionadas ao canal iônico sobre os mecanismos moleculares das mutações BEST1 e a patologia das bestrofinopatias. A principal vantagem dessa técnica é que ela contorna a dificuldade de obter diretamente células RPE de humanos. As implicações dessa técnica se estendem à terapia de bestrofinopatias, incluindo a doença de Best, pois as células RPE podem ser usadas tanto para fins de pesquisa quanto para terapias de reposição celular.

Quando a cultura de hPSC atingir a confluência, substitua o meio de cultura por quatro mililitros de meio de diferenciação por poço de uma placa de seis poços. Após duas semanas de cultivo, suplementar o meio de diferenciação com 100 nanogramas por mililitro de ativina-A humana, trocando o meio suplementado três vezes por semana por mais 14 dias. No dia 29, mude para o meio de diferenciação não suplementado por mais oito a 10 semanas até que os aglomerados de células RPE pigmentadas apareçam.

Para isolar as células RPE pigmentadas, primeiro segure pipetas Pasteur de vidro individuais de nove polegadas horizontalmente sobre a chama de um bico de Bunsen, cerca de dois terços do comprimento da parte fina da pipeta. Quando o vidro aquecido ficar macio, afaste rapidamente as duas extremidades para formar uma ponta semelhante a um microraspador na nova extremidade da pipeta. Pulverize as pipetas puxadas com etanol a 70% e deixe-as secar ao ar em uma capela de cultura de células.

Quando as pipetas estiverem prontas, lave cada poço da cultura de diferenciação com PBS e adicione um mililitro de tripsina a 0,05% suplementado com uma unidade por microlitro de colagenase a cada poço. Após 20 a 30 minutos a 37 graus Celsius, pare a digestão com dois mililitros de meio RPE a 37 graus Celsius por poço de uma placa de seis poços e coloque a placa em um microscópio stage. Usando uma pipeta puxada, bata suavemente nos aglomerados de EPR pigmentados.

Assim que as células se desprenderem do fundo do poço, use uma micropipeta de 20 microlitros para transferir células dissociadas para poços individuais de uma nova placa de cultura de células contendo meio RPE. Quando aproximadamente 5.000 células RPE forem adicionadas a cada poço de uma placa de 12 poços, aumente o volume final para dois mililitros com meio RPE fresco e cultive as células hPSC-RPE isoladas por mais seis a oito semanas até que uma monocamada de células RPE maduras pigmentadas e em forma de paralelepípedo seja observada. 24 a 72 horas antes do patch clamp, lave as células pigmentadas da monocamada com dois mililitros de PBS e, após remover o PBS, adicione um mililitro de 0,05% de tripsina mais uma unidade por microlitro de colagenase às células em cada poço de uma placa de 12 poços por um período de incubação de oito minutos a 37 graus Celsius.

Quando as células começarem a se desprender, use uma micropipeta de um mililitro para lavar suavemente as células do fundo do poço e agrupar a suspensão celular em um tubo cônico de 15 mililitros. Adicione um mililitro de solução de tripsina-colagenase a 37 graus Celsius ao poço. Incube por mais oito minutos a 37 graus Celsius, depois lave as células restantes do fundo do poço e combine a suspensão celular com o mesmo tubo cônico de 15 mililitros.

Incube as células em um banho seco de 37 graus Celsius por oito minutos e, em seguida, use uma micropipeta de um mililitro para triturar suavemente as células de 10 a 15 vezes. Depois de incubar e triturar as células mais duas vezes, adicione cinco mililitros de meio RPE a 37 graus Celsius à suspensão de célula única e peletize as células por centrifugação. Ressuspenda o pellet no volume apropriado para semear em placas pré-revestidas com lamínulas de 10 a 20% de confluência e execute o patch clamp de célula inteira de acordo com os protocolos padrão.

Após o isolamento bem-sucedido, mais de 90% das células na população de passagem zero devem amadurecer para exibir a morfologia celular de EPR. Com a abordagem de doença em um prato baseada em hPSC-RPE, cada mutação BEST1 específica do paciente pode ser caracterizada de forma abrangente por sua expressão proteica, tráfego de membrana e função do canal iônico para obter informações críticas para elucidar os mecanismos patológicos do EPR. Deve-se notar que algumas mutações do BEST1 podem afetar sua expressão proteica, portanto, outros marcadores de EPR bem estabelecidos também devem ser verificados.

A diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas leva de três a seis meses, dependendo da linhagem de células-tronco pluripotentes humanas e do tipo de mutação, e o isolamento das células pluripotentes humanas diferenciadas pode ser concluído em duas horas se for realizado corretamente. Ao tentar dividir as células para o patch clamp, é importante lembrar de triturar as células com muito cuidado para evitar a morte celular em excesso. Após este procedimento, outros métodos, como cultura de células RPE 3D, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais sobre como o transporte de íons nas membranas apical e basal das células RPE é afetado por mutações BEST1.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores no campo das doenças degenerativas da retina explorarem os fenótipos fisiológicos e os mecanismos patológicos das células RPE derivadas do paciente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como diferenciar células-tronco pluripotentes em células do epitélio pigmentar da retina e preparar as células RPE para o patch clamp de células inteiras.