Name: Montagem rápida, escalável e carregamento de proteínas bioativas e Imunoestimuladores em diversas Nanocarriers sintéticas através de Flash Nanoprecipitation (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 57 s
Description: Aprenda a fabricar nanocarregadores sintéticos com nanoprecipitação flash para sistemas de liberação de fármacos. Este método permite que pesquisadores sem experiência em química criem estruturas estéreis com baixa polidispersidade.

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Reconhecemos que o suporte pessoal e instrumentação da instalação de biologia estrutural da Universidade de Northwestern. Reconhece-se o apoio da R.H. Lurie abrangente Cancer Center da Universidade do noroeste e as instalações de biologia estrutural Universidade Northwestern. O detector de elétrons direto Pauo K2 foi comprado com fundos fornecidos pelo consórcio biomédica de Chicago com o apoio dos fundos Searle em Chicago comunidade Trust. Agradecemos também as seguintes facilidades da Northwestern University: Centro Interdisciplinar de ciência superfície de Keck, o instrumento de biologia estrutural, a facilidade de imagem biológica, o centro de imagem Molecular Avançada e a analítica Núcleo de equipamentos bio-nanotecnologia. Esta pesquisa foi apoiada pela concessão do National Science Foundation do 1453576, os institutos nacionais de saúde diretor novo prêmio inovador 1DP2HL132390-01, o centro de regenerativa nanomedicina Catalyst Award e o prêmio de catalisador de McCormick de 2014. SDA foi apoiada em parte pelo NIH predoctoral biotecnologia formação Grant T32GM008449.

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<li>Gindy, M. E., Panagiotopoulos, A. Z., Prud'homme, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composite+block+copolymer+stabilized+nanoparticles%3A+simultaneous+encapsulation+of+organic+actives+and+inorganic+nanostructures%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Composite block copolymer stabilized nanoparticles: simultaneous encapsulation of organic actives and inorganic nanostructures.</a> Langmuir. 24 (1), 83-90 (2008).</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Nós fornecemos instruções detalhadas para a preparação rápida de polymersomes usando PEG17-bl- PPS35-SH como o copolímero de diblock. Polymersomes vesiculares são a morfologia de agregação primária montada para esta relação de PEG hidrofílica e hidrofóbico PPS bloco molecular peso. Quando invadiam várias vezes, eles têm um diâmetro e polidispersividade que corresponde a polymersomes extrudados através de uma membrana de nm 200 depois de ter sido formada através de hidratação de pel...

Nanocarriers permitir a entrega controlada de carga pequena e macromolecular, incluindo entidades activas que, se não encapsulado, seria altamente degradável ou muito hidrofóbico para administração na vivo. Das morfologias nanocarreador regularmente fabricadas, poliméricas vesículas análogas aos lipossomas (também chamados polymersomes) oferecem a capacidade de carregar simultaneamente hidrofílico e hidrofóbico carga1,2. Apesar de suas vantagens promissoras, polymersomes ainda são raros em aplicações clínicas devido, em parte, para vários desafios-chave em sua fabricação. Para uso clínico, formulações de polymersome precisam ser feitas em lotes em grande escala, estéril e consistentes.
Um número de técnicas pode ser usado para polymersomes forma de um copolímero de diblock, como poly(ethylene glycol) -bloco-poli (sulfeto de propileno) (PEG -bl- PPS), que incluem a dispersão solvente3, película fina reidratação1 , 4, microfluídica 5,6e hidratação direta7. Dispersão de solvente envolve tempos de incubação longa na presença de solventes orgânicos, que podem desnaturar algumas cargas bioativas, como proteínas. Reidratação de película fina não oferece controle sobre a polidispersividade do polymersomes formado, muitas vezes exigindo técnicas de extrusão caro e demorado para conseguir monodispersity aceitável. Além disso, ambos microfluids e hidratação direta são difíceis de escala para maiores volumes de produção. O nanocarreador diferentes métodos de fabricação, flash nanoprecipitation (FNP) oferece a capacidade de fazer em grande escala e reprodutíveis formulações8,9,10. Enquanto FNP foi anteriormente reservado para a formulação de nanopartículas de núcleo sólido, nosso laboratório recentemente expandiu o uso da FNP para incluir a formação consistente de diversas PEG -bl- PPS nanostructure morfologias11, 12, incluindo polymersomes11 e bicontinuous nanoesferas12. Descobrimos que a FNP foi capaz de formar monodisperso formulações de polymersomes sem a necessidade de extrusão, resultando em valores de índice de polidispersividade superior em comparação com não-extrudados polymersomes formada pela dispersão de reidratação e solvente de película fina 11. Bicontinuous nanoesferas, com seus grandes domínios hidrofóbicos, não foram capazes de ser formado por reidratação de película fina, apesar de formando sob várias condições de solventes com FNP12.
Aqui, nós fornecemos uma descrição detalhada para a síntese do PEG - copolímero de diblock - PPSblusada na formação de polymersome, o misturador de jatos (CIJ) do choque confinados usado para FNP, a FNP do protocolo em si e a implementação de um sistema automatizado para Reduza a variabilidade do usuário. Informações sobre como esterilizar o sistema suficiente para produzir formulações endotoxina-livre para uso na vivoe dados representativos sobre a caracterização de polymersomes formado pela FNP está incluído. Com esta informação, os leitores com interesse em utilizar polymersomes para in vitro e in vivo de trabalho será capazes de fabricar suas próprias formulações monodisperso estéril. Leitores com experiência em formulações nanocarreador e com expertise de síntese de polímero será capazes de testar rapidamente seus próprios sistemas de polímero usando FNP como uma alternativa potencial para suas técnicas de formulação atual. Além disso, os protocolos descritos neste documento podem ser usados como ferramentas educacionais para a formulação de nanocarriers nos cursos do laboratório de nanotecnologia.

<table><tbody><tr><td>CanaKit Raspberry Pi 3 Ultimate Starter Kit - Edição de 32 GB</td><td>Plataforma</td><td>de Rolamento Linear CanaKit UPC 682710991511</td><td></td></tr><tr><td>(Pequena) - 8mm de Diâmetro</td><td>Adafruit</td><td>1179</td><td></td></tr><tr><td>Movimento Linear 8 mm de Eixo, 330 mm de Comprimento, Cromado Cromado, Endurecido por Caixa, Métrico</td><td>VXB</td><td>kit11868</td><td></td></tr><tr><td>Guia/Suporte de Eixo de Trilho Linear - 8 mm de Diâmetro</td><td>Adafruit</td><td>1182</td><td></td></tr><tr><td>Slide de precisão de posição manual 4,5" de curso, capacidade de carga de 15 lb</td><td>McMaster-Carr</td><td>5236A16</td><td></td></tr><tr><td>MTPM-P10-1JK43 Motor DC Iron Horse</td><td>Iron Horse</td><td>MTPM-P10-1JK43</td><td></td></tr><tr><td>Tela LCD Touchscreen Oficial Raspberry Pi Foundation 7"</td><td>Raspberry Pi</td><td>B0153R2A9I (ASIN)</td><td></td></tr><tr><td>PicoBorg Reverse - Controle avançado do motor para Raspberry Pi</td><td>PiBorg</td><td>BURN-0011</td><td></td></tr><tr><td>Transportador Pololu com Sensor de Distância Digital GP2Y0D810Z0F Sharp 10cm</td><td>Pololu</td><td>1134</td><td></td></tr><tr><td>Ruland PSR16-5-4-A Acoplamento de Feixe de Parafuso de Fixação, Alumínio Polido, Polegada, 5/16" Diâmetro do Furo A, 1/4" Diâmetro do Furo B, 1" OD, 1-1/4" Comprimento, 44 lb-in Torque Nominal</td><td>Ruland</td><td>PSR16-5-4-A</td><td></td></tr><tr><td>Éter monometílico de polietilenoglicol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>202495</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de metanossulfonila</td><td>Sigma Aldrich</td><td>471259</td><td></td></tr><tr><td>Tolueno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>179418</td><td></td></tr><tr><td>Tolueno, Sigma Aldrich</td><td></td><td>anidro 244511</td><td></td></tr><tr><td>Trietilamina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Celite 545 (Terra de diatomáceas)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>419931</td><td></td></tr><tr><td>Diclorometano</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>320269</tr><tr><td>Éter dietílico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>296082</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimetilformamida, anidro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>227056</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato de potássio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>791776</td><td></td></tr><tr><td>Ácido tioacético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T30805</td><td></td></tr><tr><td>Tetrahidrofurano</td><td>Sigma Aldrich</td><td>360589</td><td></td></tr><tr><td>Alumínio óxido, neutro, ativado, Brockmann I</td><td>Sigma Aldrich</td><td>199974</td><td></td></tr><tr><td>Solução de metóxido de sódio, 0,5 M em metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>403067</td><td></td></tr><tr><td>Sulfeto de propileno</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P53209</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A6283</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320390</td><td></td></tr><tr><td>Solução de hidróxido de sódio 1,0 N</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2770</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de endotoxinas</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>SH30529.01</td><td></td></tr><tr><td>Tiras de pH de papel</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-640-508</td><td></td></tr><tr><td>Livre de endotoxinas Dulbecco's PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TMS-012</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de cintilação de vidro borossilicato</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-4</td><td></td></tr><tr><td>1 mL seringa totalmente em plástico</td><td>Thermo Scientific</td><td>S75101</td><td></td></tr><tr><td>Sepharose CL-6B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>CL6B200</td><td></td></tr><tr><td>Coluna de cromatografia líquida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4169</td><td></td></tr><tr><td>Misturador CIJ, HDPE</td><td>Custom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Solução de peróxido de hidrogênio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216763</td><td></td></tr><tr><td>HEK-Blue hTLR4</td><td>InvivoGen</td><td>hkb-htlr4</td><td></td></tr><tr><td>RAW-Blue Células</td><td>InvivoGen</td><td>raw-sp</td><td></td></tr><tr><td>QUANTI-Blue</td><td>InvivoGen</td><td>rep-qb1</td><td></td></tr><tr><td>PYROGENT Gel Clot LAL Ensaios</td><td>Lonza</td><td>N183-125</td><td></td></tr></tbody></table>

montagem rápida, escalável e carregamento de proteínas bioativas e imunoestimuladores em diversas nanocarriers sintéticas através de flash nanoprecipitation

Rapid, Scalable Assembly and Loading of Bioactive Proteins and Immunostimulants into Diverse Synthetic Nanocarriers Via Flash Nanoprecipitation

Nanomateriais apresentam uma ampla gama de opções para personalizar a entrega controlada de cargas moleculares simples e combinadas para aplicações terapêuticas e de imagem. Esta especificidade aumentada pode ter importantes implicações clínicas, incluindo diminuição de efeitos colaterais e doses mais baixas, com maior potência. Além disso, o em situ direcionamento controlada modulação de subconjuntos de célula específica pode melhorar investigações in vitro e em vivo dos fenômenos biológicos básicos e sonda função CÉL. Infelizmente, a experiência necessária em nanoescala ciência, química e engenharia muitas vezes proibir laboratórios sem experiência nestas áreas de fabricação e personalização de nanomateriais como instrumentos para suas investigações ou veículos para seus estratégias terapêuticas. Aqui, nós fornecemos os protocolos para a síntese e escalável montagem de um sistema de copolímero versátil tóxicos bloco favorável à formação facile e carregamento dos veículos de nanoescala para aplicações biomédicas. Nanoprecipitation flash é apresentado como uma metodologia para fabricação rápida de diversas nanocarriers de poly(ethylene glycol) -bl-copolímeros de poli (sulfeto de propileno). Estes protocolos permitirá laboratórios com uma vasta gama de conhecimentos e recursos para facilmente e fabricar reproducibly nanocarreador avançados sistemas de entrega para suas aplicações. Processam de concepção e construção de um instrumento automatizado que emprega uma bomba de seringa de alta velocidade para facilitar o nanoprecipitation flash e para permitir maior controle sobre a homogeneidade, tamanho, morfologia e carregamento de polymersome nanocarriers é descrito.

Aqui, apresentamos um protocolo simples para a formulação de nanocarriers capaz de carregar carga hidrofílica e hidrofóbica que são seguros para o rato na vivo e primatas não humanos administração11,13. Incluímos também um protocolo detalhado para a síntese do polímero usado em nossos resultados representativos, juntamente com uma descrição para a fabricação de um instrumento personalizado para o choque mecanicamente cont...

Nanomateriais fornecem mecanismos versátil de entrega terapêutico controlado para tanto a ciência básica e aplicações de translação, mas sua fabricação muitas vezes requer perícia que não está disponível em laboratórios mais biomédicos. Aqui, apresentamos os protocolos para a fabricação escalável e carregamento terapêutico de diversas nanocarriers Self montado usando flash nanoprecipitation.

Montagem rápida, escalável e carregamento de proteínas bioativas e Imunoestimuladores em diversas Nanocarriers sintéticas através de Flash Nanoprecipitation

Nanomaterials present a wide range of options to customize the controlled delivery of single and combined molecular payloads for therapeutic and imaging ...

Acreditamos que o uso de nanoprecipitação flash para montar nanoestruturas complexas permitirá que pesquisadores que não têm ampla experiência em química, engenharia ou ciência de nanomateriais fabriquem sistemas avançados de entrega de medicamentos de forma independente para suas próprias aplicações e necessidades específicas. A principal vantagem dessa técnica é a geração de grandes volumes de diversas nanoestruturas em alta concentração, baixa polidispersidade e carregadas com moléculas bioativas, incluindo drogas de moléculas pequenas e proteínas, todas formadas sob condições estéreis. Geralmente, indivíduos novos na síntese de polímeros podem ter dificuldades porque o componente de sulfeto de polipropileno é altamente sensível à oxidação por exposição ao ar.A demonstração visual desse método é crítica, pois as várias etapas de impacto são difíceis de aprender porque precisam ser executadas muito rapidamente em sucessão. Para esterilizar os jatos de impacto confinados, ou misturador CIJ, trabalhe dentro de um gabinete de segurança biológica para submergir o misturador com todas as peças desmontadas em hidróxido de sódio molar de ponto zero durante a noite. Remonte o misturador

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Este artigo descreve um método para sintetizar nanoprecipitation polímero baseado em nanopartículas usando dibloco co-polímeros. Vamos discutir a síntese de dibloco co-polímeros, a técnica nanoprecipitation e aplicações potenciais.

Formulação de nanopartículas poliméricas através da técnica de dibloco Nanoprecipitation

Neste artigo, um método de produção elevada é apresentada para a síntese de oligossacáridos e à sua fixação à superfície de nanopartículas de polianidrido para utilização posterior em alvejar receptores específicos em células apresentadoras de antigénio.

Alta capacidade de síntese de hidratos de carbono e funcionalização de nanopartículas polianidrido

Descrevemos técnicas baseadas em imagens de animais inteiros e citometria de fluxo para monitorar a expansão de células T CD8+ específicas do antígeno em resposta à imunização com nanopartículas em um modelo murino de vacinação.

Imaginologia todo animal e técnicas de citometria de fluxo para CD8 + respostas de células T Análise do antigénio específico da Nanoparticle após vacinação

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Preparação Facile da Internamente auto-montados Lipid partículas estabilizada por nanotubos de carbono

Utilizou-se homogeneização simples para preparar novas nanopartículas imitando lipoproteínas de alta densidade para encapsular o factor de crescimento nervoso. Desafios, protocolos detalhados para a preparação de nanopartículas, caracterização in vitro e estudos in vivo são descritos neste artigo.

Preparação e caracterização de novas nanopartículas simuladoras de HDL para encapsulação de fatores de crescimento nervoso

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Na interface de solventes orgânicos e aquosos, proteínas anfífilas sob medida se reúnem em estruturas supramoleculares complexas, como vesículas, fibras e coacervates desencadeadas por parâmetros ambientais. Os protocolos de montagem descritos produzem compartimentos baseados em membrana sérica (PMBCs) com propriedades ajustáveis, permitindo o encapsulamento de várias cargas.

Montagem dirigida de proteínas semelhantes à elastina em estruturas supramoleculares definidas e encapsulamento de carga in vitro

As nanopartículas lipídicas são desenvolvidas usando uma abordagem de plataforma de mistura microfluida para encapsulamento de mRNA e DNA.

Formulando e caracterizando nanopartículas lipídicas para entrega de genes usando uma plataforma de mistura microfluida

Aqui, um protocolo simples é apresentado para a produção de nanopartículas mRNA baseadas em polímeros poli (beta aminoester), fáceis de serem adaptados alterando o mRNA encapsulado. O fluxo de trabalho para sintetizar os polímeros, as nanopartículas e sua caracterização essencial in vitro também são descritos. Também é acrescentada uma prova de conceito em relação à imunização.

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Os nanogéis são uma plataforma de nanopartículas excelente e versátil para a entrega de produtos biológicos. Nanogéis poliméricos à base de polietilenoglicol responsivos a estímulos, capazes de encapsular cargas úteis à base de proteínas, foram sintetizados usando uma estratégia de co-nanopolimerização de reticulação de uma etapa em condições aquosas. A fabricação e caracterização ideais dessas novas nanopartículas são apresentadas aqui.

Síntese de Nanogéis Responsivos a Estímulos utilizando Reticulação Aquosa de Uma Etapa e Co-nanopolimerização

Um protocolo detalhado para sintetizar nanopartículas lipídicas (LNPs) usando tecnologias de misturador de jato de impacto confinado (CIJ), incluindo um CIJ de dois jatos e um misturador de vórtice de entrada múltipla de quatro jatos (μMIVM), é demonstrado. Os misturadores CIJ geram ambientes de micromistura turbulentos e reprodutíveis, resultando na produção de LNPs monodispersos.

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