Montagem rápida, escalável e carregamento de proteínas bioativas e Imunoestimuladores em diversas Nanocarriers sintéticas através de Flash Nanoprecipitation

Acreditamos que o uso de nanoprecipitação flash para montar nanoestruturas complexas permitirá que pesquisadores que não têm ampla experiência em química, engenharia ou ciência de nanomateriais fabriquem sistemas avançados de entrega de medicamentos de forma independente para suas próprias aplicações e necessidades específicas. A principal vantagem dessa técnica é a geração de grandes volumes de diversas nanoestruturas em alta concentração, baixa polidispersidade e carregadas com moléculas bioativas, incluindo drogas de moléculas pequenas e proteínas, todas formadas sob condições estéreis. Geralmente, indivíduos novos na síntese de polímeros podem ter dificuldades porque o componente de sulfeto de polipropileno é altamente sensível à oxidação por exposição ao ar.

A demonstração visual desse método é crítica, pois as várias etapas de impacto são difíceis de aprender porque precisam ser executadas muito rapidamente em sucessão. Para esterilizar os jatos de impacto confinados, ou misturador CIJ, trabalhe dentro de um gabinete de segurança biológica para submergir o misturador com todas as peças desmontadas em hidróxido de sódio molar de ponto zero durante a noite. Remonte o misturador CIJ e flua água livre de endotoxinas através do misturador usando seringas luerlock, teste o ph da água e continue a fluir a água até que o ph seja registrado como neutro.

Para preparar a solução de impacto um, primeiro pese 20 miligramas do polímero sintetizado em um tubo de um vírgula cinco mililitros. Em seguida, adicione corantes hidrofóbicos, medicamentos ou outras cargas. Finalmente, adicione 500 microlitros de 100% tetrahidrofurano ao polímero e à carga, vórtice vigorosamente para dissolver.

Para preparar a solução de impacto dois, dissolva a carga hidrofílica a ser carregada dentro das vesículas de polímero em 500 microlitros de um tampão aquoso. Adicione 2,5 mililitros de um tampão aquoso de sua escolha a um reservatório de tamanho adequado. Agora, coloque o reservatório sob o misturador CIJ de forma que a saída do misturador entre diretamente no reservatório.

Carregue as soluções de impacto em seringas descartáveis de plástico separadas de um mililitro, colidindo as soluções umas contra as outras para formar simultaneamente nanoestruturas, inserindo seringas em adaptadores luerlock na parte superior do misturador CIJ. Em um movimento único, suave e rápido, pressione ambas as seringas simultaneamente e com a mesma força. Se vários impactos forem realizados, é fundamental que eles sejam feitos o mais rápido possível para reduzir a perda de solvente orgânico valtower.

Para realizar vários impactos, divida a solução de nanoestrutura nascente entre duas seringas e repita essa etapa até mais quatro vezes. Colete a vazão no reservatório aquoso cheio de tampão e mexa suavemente para garantir a mistura. Existem várias opções para remover a carga descarregada e o solvente orgânico.

A formulação nanocarreadora pode ser removida por meio de exclusão de excise ou coluna de dessalinização, por meio de um sistema de filtragem de fluxo tangencial, por meio de dessecação a vácuo ou por diálise, conforme demonstrado aqui. Dialise a formulação nanocarreadora no mesmo tampão aquoso e reservatório usado para impacto. Use tubos de corte de peso molecular apropriado por pelo menos 24 horas, com pelo menos duas trocas de tampão.

Uma vez que a carga descarregada tenha sido removida do solvente orgânico, concentre a formulação nanocarreadora usando um sistema concentrador de rotação seguindo as instruções do fabricante. Os nanocarreadores podem ser armazenados a quatro graus Celsius por semanas a meses. Antes do uso após o armazenamento, as formulações de nanocarreadores devem ser brevemente submetidas a vórtices.

Execute a fabricação de uma bomba de seringa de alta velocidade conforme descrito no protocolo de texto. Para usar o modo de execução automática, selecione execução automática no menu principal. O sistema solicitará que os usuários permitam que o motor posicione automaticamente a plataforma de expulsão da seringa no início da lâmina de precisão.

Certifique-se de que o caminho na frente e atrás da placa de metal esteja livre antes de prosseguir. Carregue o misturador CIJ na abertura retangular do carro de expulsão traseiro. Em seguida, carregue seringas plásticas de um mililitro como antes e monte as seringas nos conectores de isca fêmea do misturador CIJ.

Antes de operar o instrumento, defina a velocidade desejada do motor e verifique se o sistema está limpo conforme descrito no protocolo de texto. Para expelir os reagentes das seringas para o misturador CIJ, pressione o botão de execução na interface do software. Micrografias eletrônicas de transmissão criogênica representativas demonstram polimerossomos menores e mais monodispersos após impactos repetidos.

A análise dinâmica de espalhamento de luz confirmou um deslocamento para a esquerda da distribuição de tamanho dos polimerossomos após impactos repetidos. Após cinco impactos repetidos, o diâmetro médio e a polidispersidade dos polimerossomos correspondem aos das amostras extrudadas formadas por reidratação de filme fino. A nanoprecipitação flash pode ser usada para carregar uma variedade de pequenas moléculas hidrofóbicas e hidrofílicas e macromoléculas em polimerossomos.

Embora esse método possa fornecer informações sobre como as imunoterapias e as vacinas funcionam, ele também pode ser aplicado ao estudo de como os polímeros se automontam em nanoestruturas intrincadas. Seguindo este procedimento, outros métodos como administração intravenosa ou subcutânea em modelos animais podem ser realizados para determinar quais subconjuntos celulares internalizam as nanopartículas ou qual é a rota de depuração para diferentes nanoestruturas. As implicações dessa técnica se estendem à terapia de doenças cardíacas e câncer, bem como ao desenvolvimento de vacinas para doenças infecciosas, porque esses nanocarreadores podem direcionar vários medicamentos para células imunológicas muito específicas.