Name: Cultura do tecido ovariano Visualizar fenômenos no ovário de Mouse (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-19T14:30:00.000+00:00
Duration: 4 min 30 s
Description: Aprenda cultura de tecido ovariano para estudar desenvolvimento folicular e atresia em camundongos. Este método permite observação em tempo real de processos ovarianos em condições controladas de laboratório.

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Agradecemos o Dr. Naojiro Minami (Kyoto University) para fornecer os ratos Oog1pro3.9 . Esta pesquisa foi apoiada pelos JSPS (KAKENHI # JP15H06275) e a Fundação Nitto.

Ratos foram alojados em um quarto do ambiente controlado a 23 ± 1 ° C, com um ciclo escuro h luz/12 de 12 h. Protocolos de cuidados com animais e experimentos foram conduzidos em conformidade com as orientações para a experimentação Animal da universidade médica de Aichi e foram aprovados pelo Comitê de uso e cuidado Animal incumbente.
1. preparação do meio de cultura e pratos
<ol><li>Para preparar o meio de cultura básico, adicionar soro fetal bovino (FBS, 5% v/v), FSH (100 MUI/mL), LH (10 mU/mL) e a penicilina-estreptomicina (penicilina, 100 U/mL; estreptomicina, 100 mg/mL) para alfa média essencial mínima (MEM-alfa) e mistura em tubos de 50 mL. Nota: Volumes totais dos necessários meios de cultura variam entre experiências, mas 1 mL de meio de cultura é geralmente suficiente para pratos de cultura de vidro-fundo de 3,5 cm.</li>
	<li>Despeje a alíquotas de 1 mL de meio de cultura mista em pratos de cultura de vidro-fundo de 3,5 cm e definir lugar 30 mm celular cultura inserções em pratos. Pré-aquecer pratos em uma incubadora (5% de CO2 e 37 ° C) e mídia.</li>
</ol>2. preparação do tecido ovariano
<ol><li>Tampão de pre-quente fosfato salino (PBS) (−) e alfa-MEM contendo 5% FBS, 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 mg/mL em uma incubadora (5% de CO2 e 37 ° C). Nota: Cerca de 3 mL de PBS (−) de alíquotas por ovário são suficientes para uso durante as dissecções de ovário, e alíquotas de 1 mL de MEM-Alfa são suficientes para armazenamento temporário de um único ovário em pratos de 3,5 cm.</li>
	<li>
Impostos especiais de consumo ovários dos 4 semana de idade ratos fêmeas do ICR (nomeado após o Instituto de pesquisa do câncer) e aparar os tecidos ao redor do ovário usando uma tesoura e pinça sob um microscópio estereoscópico. Reservar os ovários removidos em meio de cultura (ver passo 2.1) até o uso.
	<ol>
<li>Lugar único ovários em papel de filtro umedecidos com pré aquecido PBS (−) (consulte a etapa 2.1) e fatia em 4 pedaços, usando uma lâmina de micrótomo sob um microscópio estereoscópico. Nota: Os ovários de camundongos 4 semana de idade do ICR são cerca de 2 mm de diâmetro. O número de peças depende do tamanho do ovário; no entanto, cerca de 500 µm e espessura peças permitem observações de folículo adequada (em pedaços mais grossos do que 500 mm, a transparência do tecido é diminuída; em pedaços mais finos do que 500 mm, muitos folículos antrais são quebrados e perdidos).</li>
		<li>Após a dissecação, coloque os espécimes de ovário fatiado no meio de cultura previamente aquecido em pratos de 3,5 cm (consulte a etapa 2.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ovário cultura de tecidos
<ol><li>Deixar aproximadamente 0,5 µ l de meio de cultura por fatias finas de tecido ovariano na inserção da cultura de pilha onde o tecido será definida usando uma micropipeta.</li>
	<li>Coloque cada espécime fatiado em uma gota de meio de cultura sobre as inserções de cultura de células usando uma pinça.</li>
	<li>Cultura de tecidos de ovário em 5% CO2 a 37 ° C.</li>
	<li>Substitua o meio de cultura fresco médio pré-aquecido em 2 dias. Nota: A agenda de mudanças médias para a cultura de seções de ovário de ratos 4 semana de idade do ICR é apresentada na Figura 1.<ol>
<li>Para reproduzir o aumento de LH, trate culturas ovários de camundongos ICR 4 semana de idade, com o meio contendo 100 mU/mL FSH e LH por 12 h a cada 4 dias (Figura 1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. microscópio imagens de ovários culturas
<ol><li>Iniciar os ovários culturas de imagem após o dia 1, quando os tecidos tenham aderido sobre as inserções de cultura de células e realizar análises de microscópio confocal ou invertido em intervalos de 24 h para permitir o crescimento de folículos suficientes entre os pontos de tempo. Nota: A microscopia Confocal é superior à microscopia invertida para a observação de folículos nos ovários toda cultos.</li>
</ol>5. imagem Time-Lapse de ovários culturas
<ol><li>
Otimize as condições de imagem lapso de tempo, incluindo a intensidade do laser e tempos de exposição, para o sistema da imagem latente (tabela 1).
	<ol>
<li>Selecione amostras emparelhadas ovário de ratos único para uso como grupos tratamento e controle. Varie a intensidade do laser e tempo de exposição para conseguir as melhores imagens (tabela 1).</li>
		<li>Compare o crescimento do folículo sob cada condição de cultura medindo áreas folículo em imagens de amostras de controle em intervalos de 24 h e em Time-Lapse amostras de imagem (consulte a etapa 6). Simultaneamente, contar o número de oócitos ovulados em cada conjunto de ovário e escolher as condições óptimas de lapso de tempo da imagem latente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Capture imagens em intervalos de 30 min, usando o sistema de imagens lapso de tempo, sob determinadas condições (tabela 1).</li>
</ol>6. análise de crescimento do folículo
<ol><li>
Para analisar o desenvolvimento do folículo, medir as áreas do folículo em imagens capturadas utilizando software ImageJ (http://resbweb.nih.gov/ij/).
	<ol>
<li>Inicialmente, defina a escala da imagem clicando em "Como definir a escala" sob "Analisar" na barra de ferramentas. Insira os comprimentos do lado da imagem capturada e os números correspondentes de pixels nos campos em branco de "Distância conhecida" e "Distância em pixels", respectivamente.</li>
		<li>Clique em "Mão livre" na barra de ferramenta e delinear os folículos nas imagens capturadas de campo brilhante.</li>
		<li>Clique em "Medida" em "Analisar" na barra de ferramentas. Nota: Se outros dados de medição são desejados, clique em "Definir medição" sob "Analisar" na barra de ferramenta e marque as caixas apropriadas na lista.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. análise do desenvolvimento folicular usando ratos transgénicos
<ol><li>Colete os ovários de fatia pós-natal dias 0 e 4 (P0 e P4) feminino de ratos transgênicos contendo os transgenes Oog1pro3.9 e R26-H2B-mCherre cultura em inserções conforme descrito em etapas 1.1 – 3.2, exceto não o P0 e ovários P4.</li>
	<li>Substitua o meio de cultura com meio fresco, previamente aquecido em pratos de 3,5 cm na incubadora, contendo 5% CO2 a 37 ° C a cada 2 dias. Nota: A concentração de LH no meio de cultura de ovários P0 e P4 pode permanecer constante porque não ocorrem picos de LH em camundongos P0 e P4.</li>
	<li>Defina o microscópio para visualizar apenas folículos primários AcGFP1 positivo em culta P4 ovários (tabela 1). Nota: Apenas primordiais e primários folículos estão presentes em ovários de fêmeas de rato de P4.</li>
	<li>Capturar imagens de culto P0 Oog1pro3.9/ ovários de camundongos transgênicosR26-H2B-mCherry em intervalos de 30 min usando as configurações usadas para ovários P4 (ver passo 5.2).</li>
	<li>Rastrear e analisar o desenvolvimento folicular usando sinais AcGFP1 e H2B-mCHerry.</li>
</ol>

<ol><li>Myers, M., Britt, K. L., Wreford, N. G., Ebling, F. J., Kerr, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+quantifying+follicular+numbers+within+the+mouse+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">Methods for quantifying follicular numbers within the mouse ovary.</a> Reproduction. 127 (5), 569-580 (2004).</li>
<li>Adams, G. P., Jaiswal, R., Singh, J., Malhi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+in+understanding+ovarian+follicular+dynamics+in+cattle%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">Progress in understanding ovarian follicular dynamics in cattle.</a> Theriogenology. 69 (1), 72-80 (2008).</li>
<li>Palma, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+biotechnology+of+follicle+development%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+World+J%22%5BJournal%5D)">Biology and biotechnology of follicle development.</a> Sci World J. , (2012).</li>
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<li>Spears, N., de Bruin, J. P., Gosden, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+establishment+of+follicular+dominance+in+co-cultured+mouse+ovarian+follicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Reprod+Fertil%22%5BJournal%5D)">The establishment of follicular dominance in co-cultured mouse ovarian follicles.</a> J Reprod Fertil. 106 (1), 1-6 (1996).</li>
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<li>Nilsson, E. E., Skinner, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kit+ligand+and+basic+fibroblast+growth+factor+interactions+in+the+induction+of+ovarian+primordial+to+primary+follicle+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Kit ligand and basic fibroblast growth factor interactions in the induction of ovarian primordial to primary follicle transition.</a> Mol Cell Endocrinol. 214 (1-2), 19-25 (2004).</li>
<li>Abe, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+conditional+reporter+mouse+lines+at+ROSA26+locus+for+live+cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Establishment of conditional reporter mouse lines at ROSA26 locus for live cell imaging.</a> Genesis. 49 (7), 579-590 (2011).</li>
<li>Lan, Z. J., Xu, X., Cooney, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+oocyte-specific+expression+of+Cre+recombinase+activity+in+GDF-9-iCre%2C+Zp3cre%2C+and+Msx2Cre+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Differential oocyte-specific expression of Cre recombinase activity in GDF-9-iCre, Zp3cre, and Msx2Cre transgenic mice.</a> Biol Reprod. 71 (5), 1469-1474 (2004).</li>
<li>Payer, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+stella-GFP+transgenic+mice%3A+a+novel+tool+to+study+germ+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Generation of stella-GFP transgenic mice: a novel tool to study germ cell development.</a> Genesis. 44 (2), 75-83 (2006).</li>
<li>Ohinata, Y., Sano, M., Shigeta, M., Yamanaka, K., Saitou, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive%2C+non-invasive+visualization+of+primordial+germ+cell+development+in+mice+by+the+Prdm1-mVenus+and+Dppa3-ECFP+double+transgenic+reporter%5BTitle%5D)+AND+%22Reproduction%22%5BJournal%5D)">A comprehensive, non-invasive visualization of primordial germ cell development in mice by the Prdm1-mVenus and Dppa3-ECFP double transgenic reporter.</a> Reproduction. 136 (4), 503-514 (2008).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Neste estudo, desenvolvemos dois novos métodos para o estudo do desenvolvimento folicular em ovários de rato. O primeiro método envolve a cultura de tecidos de ratos adultos ovário fatiado seguido por análises do desenvolvimento folicular, e o segundo envolve o uso de time-lapse de imagem para visualizar o início do desenvolvimento folicular durante a fase independente de gonadotrofinas. Anteriormente, usamos o presente método de cultura de tecido do ovário para avaliar o efeito de fator inibitório de leucemia e progeste...

Ovários de rato fêmea contenham vários milhares de folículos1e ovulação periódica amadurece aproximadamente dez ovócitos em cada ciclo de cio. Os folículos são classificados em vários estádios de desenvolvimento: primordial, primária, secundária, antral e folículos de Graaf, dependendo da forma da camada granulosa celular ao redor de cada oócito. A maioria dos folículos primordiais são dormentes, e alguns deles são ativados e crescem em folículos primários em cada ciclo de cio2. Após a fase folicular secundária, desenvolvimento folicular é principalmente regulado por gonadotrofinas, foliculares estimulante hormônio (FSH) e hormônio luteinizante (LH). No entanto, desenvolvimento do folículo primário e primordial é independente de gonadotrofinas, e os mecanismos de regulação que regem esses estágios permanecem mal inderstood3,4,5. Além de hormônios e fatores de crescimento, o folículo primário e primordial é regulado pelas interações entre folículos6,7. Portanto, realizamos análises de dinâmica de folículo nos tecidos do ovário de rato e investigou os mecanismos de regulação associados usando culturas de tecido ovariano8,9,10.
Neste documento, apresentamos dois métodos de modelo de cultura de tecido ovariano. O primeiro é usado para analisar o desenvolvimento do folículo por medição de superfícies foliculares, e a segunda é usada para estudar o mecanismo regulatório durante o início do desenvolvimento folicular de primordial para a fase de folículo secundário com ratos transgénicos. Para análise do desenvolvimento do folículo, utilizado principalmente ovários de camundongos fêmeas 4 semana de idade porque permitem fácil visualização dos folículos. Para induzir a ovulação periódica e o desenvolvimento de modelos em vivo do folículo, nós reproduzido o aumento de LH e ovulação observada, atresia do folículo e secreção de estradiol em condições de cultura de tecidos. Imagens dos ovários cultivadas foram capturadas, e os processos de desenvolvimento do folículo foram analisados por mudanças de rastreamento na área folicular. No entanto, nas análises de microscopia de campo claro, a distinção entre folículos primários primordiais e no início era clara. Assim, desenvolvemos um método para detectar pequenos folículos e distinguir entre o primordial, primário, e culta de folículo secundário em tecidos ovarianos usando Oogenesin1 (Oog1) pro3. 9 e ovários de camundongos transgênicos R26-H2B-mCherry nos dias 0 e 4 após nascimento11. Oog1 expressão é detectável em oócitos após a entrada em meiose e aumenta gradualmente com o desenvolvimento do folículo, permitindo a observação da transição do primordial de folículos primários usando imagens de lapso de tempo do tecido do ovário culta11 ,12. Embora métodos morfológicos foram usados para estudar os fatores que ativam dormente folículos primordiais13,14,15,16, desenvolvimento do folículo fisiológicas nos ovários é difícil de observar, e os efeitos dos vários fatores permanecem descaracterizados. Os métodos de cultura presente foram projetados para resolver esta escassez nas análises em tempo real dos fatores de alvo.
No presente estudo, nós controladas desenvolvimento folicular usando um método de imagem de lapso de tempo e caracteriza-se o processo de desenvolvimento do folículo. Nossos novos métodos para oferecer uma ferramenta sem precedentes para investigar a fisiologia dos ovários.

<table><tbody><tr><td>Hormônio folículo estimulante da hipófise humana</td><td>SIGMA</td><td>F4021</td><td></td></tr><tr><td>Hormônio lutenizante da hipófise equina</td><td>SIGMA</td><td>L9773</td><td></td></tr><tr><td>Solução de penicilina-estreptomicina</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>168-23191</td><td></td></tr><tr><td>MEM a, GlutaMax, sem nucleotídeos</td><td>Thermo Fisher</td><td>32561037</td><td></td></tr><tr><td>prato de fundo de vidro</td><td>MatTek</td><td>P35G-0-10-C</td><td>Prato de 35 mm, lamínula nº 0, diâmetro de vidro de 10 mm</td></tr><tr><td>Inserção de cultura de células Millicell</td><td>Merck Millipore</td><td>PICM0RG50</td><td>Diâmetro: 315 mm, tamanho do poro: 0,4 mm, material: placas de cultura de células PTTE hidrofílicas</td></tr><tr>de<td>3,5 cm</td><td>greiner bio-one</td><td>627160</td><td></td></tr><tr><td>50ml / tubo de centrífuga com tampa de vedação tripla</td><td>IWAKI</td><td>2345-050</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas descartáveis de baixo perfil 819</td><td>Leica</td><td>14035838925</td><td></td></tr><tr><td>LSM 710</td><td>Microscópio confocal</td><td>Carl Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>CellVoyager, CV1000</td><td>Yokogawa Electric Corporation</td><td></td><td>Aquisição de imagens com lapso de tempo</td></tr><tr><td>BZ-X700</td><td>KEYENCE</td><td></td><td>Aquisição de imagens com lapso de tempo</td></tr></tbody></table>

cultura do tecido ovariano visualizar fenômenos no ovário de mouse

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

As fêmeas de mamíferos ovulam periodicamente um número quase constante de oócitos durante cada ciclo de cio. Para sustentar tal regularidade e periodicidade, regulamento ocorre no nível do eixo hipotálamo-hipófise-gonadal e no desenvolvimento de folículos nos ovários. Apesar dos estudos ativos, mecanismos de desenvolvimento do folículo não são claros, devido as diversas etapas envolvidas desde a ativação do folículo primordial dormente a ovulação e devido a complexidade de regulamento que difere em cada fase folicular. Para investigar os mecanismos do desenvolvimento folicular e a dinâmica dos folículos durante todo o ciclo do estro, desenvolvemos um modelo de cultura de tecido ovariano de mouse que pode ser usado para observar o desenvolvimento folicular usando um microscópio. Desenvolvimento sistemático folicular, ovulação periódica e atresia do folículo podem ser reproduzidos no modelo do culto do ovário, e as condições de cultura podem ser moduladas experimentalmente. Aqui, vamos demonstrar a utilidade desse método no estudo dos mecanismos de regulação do desenvolvimento folicular e outros fenômenos no ovário.

A Figura 1 mostra o protocolo para mudanças nos meios de comunicação durante a cultura de tecido ovariana. Seguir este programa, os ovários de camundongos ICR 4 semanas de idade foram cultivadas e fotografada em intervalos de 24 horas usando microscopia confocal (Figura 2). Durante a cultura de tecidos de ovário durante 3 semanas, mais folículos antrais e secundários foram degenerou por atresia do folículo e alguns eram ovularam ...

Culturas de tecido ovarianos podem ser usadas como modelos de atresia de folículo, ovulação e desenvolvimento do folículo e indicar mecanismos reguladores de processos dinâmicos de ovário.

Cultura do tecido ovariano Visualizar fenômenos no ovário de Mouse

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de pesquisa do ovário sobre o desenvolvimento do folículo, atresia e operação do folículo. A principal vantagem desta técnica é que podemos reproduzir os fenômenos ovarianos sob condições de cultura controladas para a observação em tempo real. Para preparar os ovários de um camundongo do Instituto de Pesquisa do Câncer de quatro semanas para cultura: Use tesouras e pinças para aparar o tecido circundante dos ovários sob um microscópio estéreo e coloque os ovários limpos em um prato de meio de cultura fresco.Quando todos os ovários tiverem sido aparados, transfira os ovários individuais para um pedaço de papel de filtro umedecido com PBS a 37 graus Celsius e use uma lâmina de micrótomo para cortar cada ovário em quatro pedaços. Transfira as fatias para um prato de 3,5 centímetros de meio de cultura a 37 graus Celsius e use uma micropipeta para adicionar uma gota de cerca de 0,5 micrômetro de meio de cultura em uma inserção de cultura de células por seção de tecido ovariano. Em uma segunda placa de cultura de células com fundo de vidro de 3,5 centímetros contendo um milímetro de meio:Usando uma pinça, transfira uma amostra de tecido para cada gota e coloque a placa em uma incubadora de cultura de células.Substitua o sobrenadante no prato por meio de cultura fresco a 37 graus Celsius a cada dois dias e trate os ovários com 100 miliunidades por mililitro de FSH e LH por 12 horas a cada quatro dias. Comece a imagem dos ovários cultivados a cada 24 horas após um dia de cultura para permitir o crescimento folicular suficiente entre as sessões de imagem; captura de imagens em intervalos de 30 minutos usando um sistema de imagem com lapso de tempo nas condições experimentais apropriadas. Para analisar o desenvolvimento do folículo ovariano:Abra as imagens no ImageJ e abra o menu de análise para selecionar a escala definida.Insira os comprimentos laterais das imagens capturadas e os números correspondentes de pixels nos campos distância conhecida e distância em pixels, respectivamente. Em seguida, use a ferramenta à mão livre para delinear os folículos e clique em medir. Durante um período de cultura de fatias de tecido ovariano de três semanas, a maioria dos folículos antrais e secundários são degenerados pela atresia folicular e alguns são ovulados.Alguns folículos se desenvolvem em grupos durante cada ciclo de pico de LH. Embora o momento da ovulação e o número de oócitos ovulados sejam diferentes entre os ovários de camundongos, a ovulação de ovários cultivados ocorre predominantemente dentro de 48 horas após cada pico de LH. Observe que nem todos os oócitos ovulados liberam os primeiros corpos polares após a ovulação.Os folículos primordiais e primários estão presentes simultaneamente nos ovários de camundongos pós-natais do quarto dia. Considerando que, apenas folículos primordiais estão presentes nos ovários pós-natais do dia zero. No entanto, os folículos primários tornam-se detectáveis em ovários pós-parto cultivados após 30 a 40 horas de cultura, conforme demonstrado.Os folículos primordiais e primários também podem ser distinguidos nos ovários cultivados isolados de animais transgênicos mCherry pelos núcleos positivos mCherry das células da granulosa; permitindo o rastreamento dos estágios do folículo nas culturas de fatias de ovário. Espero que esta técnica abra caminho para pesquisadores no campo da tecnologia reprodutiva explorarem novas técnicas para tratamento de fertilidade.

ovarian-tissue-culture-to-visualize-phenomena-in-mouse-ovary

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Cultura de células normais em seu contexto tridimensional representa um método alternativo para estudar os eventos iniciais necessárias para a transformação celular e tumorigênese. Este método é usado para crescer ovariano normal e células oviductal para estudar os eventos iniciais na formação de câncer de ovário.

Hidrogéis alginato para Tridimensional Cultura Órgão de ovários e tubas uterinas

Este protocolo descreve a cultura primária / co-cultura de tecido ovariano rato, usando ovários de camundongos recém-nascidos e folículos ovarianos individuais de ratos pré-púberes. As técnicas de cultura de suportar o desenvolvimento de uma forma altamente fisiológico, que permita a investigação do efeito de agentes extrínsecos no ovário, e das interacções entre os folículos do ovário.

Cultura e Co-Culture of Mouse ovários e folículos ovarianos

Aqui, apresentamos um protocolo para quantificar os folículos nos ovários culturas de ratos jovens sem seccionamento serial. Usando a imunofluorescência todo órgão e tecido de compensação, seccionamento físico é substituído com seccionamento óptico. Este método de preparação da amostra e visualização mantém a integridade do órgão e facilita a quantificação automatizada de células específicas.

Toda montagem de imunofluorescência e quantificação de folículo de ovários Mouse culta

Na cultura in vitro do córtex ovariano bovino e o efeito da dieta nutricional passo da escada no microambiente ovariano é apresentado. As peças do córtex ovariano foram cultivadas por sete dias e foram avaliados esteroides, citocinas e fases folículos. O tratamento da dieta Stair-Step teve aumento da esterogênese, resultando na progressão do folículo na cultura.

Cultura do tecido do córtex ovariano bovino

Aqui, apresentamos um protocolo otimizado para imagens de ovários inteiros para análises quantitativas e qualitativas utilizando imunosscopia de montagem integral, microscopia multifotínica e visualização e análise 3D. Este protocolo acomoda um processamento de alto rendimento, confiável e repetível que é aplicável para toxicologia, diagnóstico clínico e ensaios genômicos da função ovariana.

Imunofluorescência total do ovário, compensação e microscopia multifotínica para análise quantitativa 3D da reserva ovariana em desenvolvimento em mouse

Descrevemos métodos para isolar células somáticas ovarianas de camundongos a partir de uma fração rica em estroma do ovário e para gerar organoides somáticos ovarianos de camundongos usando uma abordagem sem andaimes.

Sondando o Microambiente Ovariano: Métodos para Isolamento, Cultura 2D e Cultura Organoide de Células Somáticas Ovarianas de Camundongos

Aqui apresentamos um protocolo que fornece uma ferramenta para examinar mecanismos regulatórios de genes específicos durante o desenvolvimento do hipocampo. O emprego de eletroporação ex utero e cultura de fatias organotípicas permite a regulação positiva e descendente da expressão de genes de interesse em células individuais e segue seu destino durante o desenvolvimento.

Ex Utero Eletroporação e Organotípicas Cultura Slice of Mouse Hippocampal Tissue

O objetivo deste protocolo é para descrever um deficitária e ganhar-de método de função que é aplicável para identificar neogenin como um receptor específico de estágio que leva a trofectoderma e diferenciação massa celular interna de embriões de ratos pré-implantação.

Deficitária e Abordagem de ganho de função para Investigar celular precoce Destino Determinantes na pré-implantação embriões de camundongos

Este trabalho demonstra uma nova abordagem para avaliar a proliferação, diferenciação e potencial de formação de vasos de células-tronco endoteliais vasculares (VESCs) através do transplante de almofada de gordura mamária, seguido de preparação de tecido total para a observação microscópica. Também é apresentada uma estratégia de rastreamento de linhagem para investigar o comportamento de VESC in vivo .

Uma nova técnica de transplante de almofada de gordura mamária para visualizar a geração de vasos de células vasculares endoteliais vasculares

Aqui, apresentamos um protocolo para imagens ao vivo da fusão do palato secundário do mouse usando microscopia confocal. Este protocolo pode ser usado em combinação com uma variedade de linhas de mouse repórter fluorescentes e com inibidores de via para visão mecanicista. Este protocolo pode ser adaptado para imagens ao vivo em outros sistemas de desenvolvimento.

Imagem ao vivo do mouse Fusão do palato secundário

Aprenda cultura de tecido ovariano para estudar desenvolvimento folicular e atresia em camundongos. Este método permite observação em tempo real de processos ovarianos em condições controladas de laboratório.

Cultura do tecido ovariano Visualizar fenômenos no ovário de Mouse

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