Name: Definidos Xeno-free e livre de alimentador condições de cultura para a geração de humanos iPSC-derivado da retina célula modelos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Aprenda a gerar organoides retinianos e células epiteliais pigmentadas a partir de iPSCs humanos. Este método simplifica a diferenciação celular para pesquisa em doenças retinianas e medicina regenerativa.

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Os autores gostaria de agradecer aos membros da equipe do Goureau para sua entrada durante o set-up dos métodos descritos aqui e G. Gagliardi e M. Garita para sua leitura crítica. Este trabalho foi apoiado por concessões do ANR (GPiPS: ANR-2010-RFCS005; SightREPAIR: ANR-16-CE17-008-02), a associação de França de Retina e a transferência de tecnologia empresa Lutech SATT. Também foi realizada no quadro do LABEX LIFESENSES (ANR-10-LABX-65) suportado pela ANR dentro do programa de d'Avenir de Investissements (ANR-11-IDEX-0004-02).

O protocolo descrito neste documento segue as diretrizes do Comitê de ética de pesquisa do Institut de la Vision. O Institut de la Vision foi autorizada a manipulação de espécime humano de acordo com o actual regulamento francês. Manipulação de amostra segue a proteção de dados do paciente em conformidade com os princípios de Helsínquia e regulamentações nacionais após a aprovação ética do "Comité de Protection des Personnes (CPP) de V".
1. preparação de meios de cultura e pratos
<ol><li>
Meios de cultura
	<ol>
<li>Usar meio de iPSC, um meio quimicamente definido, dedicado à cultura de células-tronco pluripotentes no alimentador-free condições16. Prepare 500 mL de meio de acordo com o protocolo do fabricante.</li>
		<li>Médio de iPSC Basal (Bi) de uso, o iPSC quimicamente definido meio sem fator de crescimento fibroblástico 2 (FGF2) ou fator de crescimento transformador Beta (TGFß).</li>
		<li>Preparar 500 mL de meio de Bi suplementado com suplemento 1% N2 (BiN2 médio), 10 unidades/mL de penicilina e 10 mg/mL de estreptomicina.</li>
		<li>Prepare 500 mL de proneural baseado em N2 medium (médio ProN2) composto de mistura de DMEM:Nutrient F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-glutamina), 1% MEM aminoácidos não essenciais, suplemento 1% N2, 10 unidades/mL de penicilina e 10 mg/mL de estreptomicina.</li>
		<li>Preparar proneural B27-baseado meio (meio ProB27) composto de mistura de DMEM:Nutrient F-12 (DMEM/F12, 1:1, L-glutamina), 1% MEM aminoácidos não essenciais, suplemento de 2% B27, 10 unidades/mL de penicilina e 10 mg/mL de estreptomicina.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparação de navio de cultura
	<ol>
<li>
Para a cultura humana iPSC
		<ol>
<li>Prepare-se 10 mL de uma solução de vitronectina contendo 5 μg/mL de vitronectina na 1X PBS. Em 10 mL de 1X PBS, adicione 100 µ l de solução-mãe vitronectina descongeladas (100 x).</li>
			<li>Distribua 2 mL da solução vitronectina por placa de cultura de 6 cm, correspondente a 0,5 µ g/cm2. -Incube por 1h à temperatura ambiente (RT). Remova a solução vitronectina por aspiração usando um sistema de vácuo-aspiração ou uma pipeta de 5 mL.</li>
			<li>Adicione 4 mL de meio de iPSC por prato de 6 cm.</li>
			<li>Incube os pratos em uma incubadora de cultura celular em 37 ° C e 5% de CO2 por um período mínimo de 30 min antes de usar.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para cultura celular RPE (hiRPE) humana derivado de iPSC</li>
		<li>Use uma matriz de qualificado de células-tronco pluripotentes ou substrato para revestimento de poços, de acordo com o protocolo do fabricante. Adicione suficiente matriz ou substrato para cobrir a superfície inteira de crescimento. Por exemplo, colocar 300 µ l de matriz por bem em placa de 24 e 3 mL de matriz em um balão de2 cm T-25.</li>
		<li>Incubar os vasos revestidos de cultura por um período mínimo de 1 h a 37 ° C. Remova a matriz usando uma pipeta de 5 mL ou sistemas de vácuo-aspiração.</li>
		<li>Adicionar 1 mL de meio de ProN2 por bem em placas de 24 poços e retornar a embarcação de cultura para a incubadora para um mínimo de 30 min para aquecer e equilibrar o meio. Para balões de2 cm T-25, consulte a etapa 5.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. manutenção e expansão do humano iPSCs
<ol><li>
Manutenção de iPSCs humana
	<ol>
<li>Prepare-se 3 mL de meio de iPSC em um tubo de 15 mL e mantê-lo em RT para um mínimo de 15 min antes do uso. Prepare um prato de 6 cm revestido, conforme descrito no ponto 1.2.1.</li>
		<li>Descongelar uma amostra criogênica de iPSCs humana de um tanque de nitrogênio líquido ou de um congelador de-150 º C por incubação em banho-maria a 37 ° C por 30 s.</li>
		<li>Desinfecte cuidadosamente o frasco criogênico usando um spray de solução desinfetante. Transferir o descongeladas iPSCs humana do criotubo para o tubo de 15 mL contendo 3 mL do meio de iPSC pré aquecido no RT</li>
		<li>Centrifugar o tubo a 110 x g por 3 min. Retire o sobrenadante por aspiração usando um sistema de vácuo-aspiração ou uma pipeta de 5 mL.</li>
		<li>Ressuspender as células com 1 mL de meio de iPSC de um prato de cultura vitronectina revestido de 6 cm, com uma pipeta 2 mL e transferir as células volta ao prato. Devolver o prato para a incubadora a 37 ° C e 5% de CO2 por um período mínimo de 24 h antes de mudar o meio. Nota: Um inibidor ROCK, como Y-27632 a 10 µM, pode ser adicionado ao meio de iPSC nos pratos de cultura de 6 cm para reduzir a apoptose.</li>
		<li>Mudar o meio dia e passar as iPSCs humana toda semana.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Passagem de iPSCs humana
	<ol>
<li>Passe o iPSC humana em uma confluência de 70-80%, classicamente após 7 dias em cultura.</li>
		<li>Prepare pratos de 6 cm para a passagem, conforme descrito na etapa 1.2.1. Retire os pratos com confluentes iPSCs meio de iPSC e adicione 2 mL de uma solução de dissociação para 6 min no RT Nota: O tempo de incubação varia de acordo com os clones de iPSC. Tente uma incubação de 6 min como ponto de partida.</li>
		<li>Remova a solução de dissociação usando sistemas de vácuo-aspiração ou uma pipeta de 5 mL e adicione 2 mL do meio de iPSC pré aquecido em RT. Ressuspender as colônias de iPSC pipetando-los acima e abaixo de 5-10 x com uma pipeta de 1.000 µ l. Atenção: Evite dissociação única célula de pipetagem excessiva.</li>
		<li>Transferi 30 a 200 µ l de aglomerados de ressuspensão de célula em uma nova placa de cultura de 6 cm. Retorne os pratos para a incubadora de cultura celular em 37 ° C e 5% de CO2 por um período mínimo de 24 h antes de mudar o meio. Nota: O volume de aglomerados de ressuspensão celular necessária para a passagem depende dos clones de iPSC.</li>
		<li>Mudar o meio dia e passar as iPSCs humana toda semana.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. geração de Organoids da retina
<ol><li>Inicie a diferenciação de iPSC, seguindo o protocolo esquematizado na figura 1A , quando as colónias atingir uma confluência de 60-70% (figura 1B).</li>
	<li>Prepare-se 4 mL de meio de Bi por prato de 6 cm. Aquecer o meio Bi a 37 ° C. Altere o meio de iPSC para médio de Bi. Observe este tempo como dia 0 (D0).</li>
	<li>Em D2, mudar as culturas em meio de Bi para um BiN2 médio, previamente aquecido a 37 ° C. Altere o meio de cada 2-3 dias.</li>
	<li>Identificar emergent auto-formação organoids da retina por botões de neuroepithelium, como mostrado na Figura 1 -1E. Nota: Estes primeiros organoids da retina, correspondente em seu estágio do desenvolvimento para a Copa de óptica, pode ser manualmente isolados para experimentação a jusante.</li>
</ol>4. a maturação de Organoids da retina
<ol><li>No D28, prepare-se bem-6 placas contendo 4 mL/poço das ProB27 inicialmente suplementado com 10 ng/mL de FGF2 (figura 1A). Nota: Adicione FGF2 imediatamente antes que a mídia é adicionada às placas. Cuidado: Não filtro FGF2.</li>
	<li>Recupere as estruturas da retina manualmente os pratos de 6 cm. Para fazer isso, isolar as estruturas fazer estrias perpendiculares com a agulha ao redor do botão neuroepithelial, conforme mostrado na Figura 1Ee separe o organoids riscando-os delicadamente com a agulha.</li>
	<li>Aspire organoids de 10-15, usando uma pipeta de 1.000 µ l e transferi-los em um único poço da placa de 6-poços contendo meio de ProB27.</li>
	<li>Manter o organoids da retina em condições de cultura flutuante no meio de ProB27 em uma incubadora de cultura celular em 37 ° C e 5% de CO2. Metade do meio de mudar a cada 2-3 dias. Nota: Trate o organoids com FGF2 até D35.</li>
	<li>No D35, retire metade do meio e adicione meio fresco de ProB27 escaldado a 37 ° C, sem FGF2.</li>
	<li>Metade do meio de mudar a cada 2-3 dias durante o tempo necessário para obter os tipos de célula da retina desejada de acordo com o surgimento de tipos de células da retina, como ilustrado na Figura 2.</li>
</ol>5. geração e amplificação de iPSC-derivado RPE (hiRPE) células de origem humana
<ol><li>
Geração de células humanas hiRPE
	<ol>
<li>Envolver as iPSCs em diferenciação, quando as colónias atingir uma confluência de 60-70%, seguindo o protocolo esquematizado na Figura 3A.</li>
		<li>Preparar 4 mL por prato de 6 cm do meio Bi e aquecer o meio Bi a 37 ° C. Altere o meio de iPSC para médio de Bi. Observe este tempo como dia 0 (D0).</li>
		<li>Em D2, mudar as culturas em meio de Bi para um meio BiN2 previamente aquecido a 37 ° C. Altere o meio de cada 2-3 dias.</li>
		<li>D28, altere o meio para um meio fresco de ProN2 previamente aquecido a 37 ° C, conforme representado na Figura 3A. Nota: Este passo pode ser feito após a colheita de organoides descrita na etapa 4.</li>
		<li>Mude o meio ProN2 cada 2-3 dias.</li>
		<li>A D42, identifica células hiRPE emergentes pela observação de manchas pigmentadas como mostrado na Figura 3B. Nota: A pigmentação das células hiRPE aparece entre D35 para D56 dependendo dos clones de iPSC.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Amplificação de células hiRPE
	<ol>
<li>No D42, prepare uma placa de 24 previamente revestido com a matriz, conforme descrito na etapa 1.2.2 e contendo 1 mL de meio de ProN2 por bem. Coloque a placa por 15 min na incubadora a 37 ° C e 5% CO2 antes de usar.</li>
		<li>Recupere os patches hiRPE manualmente o prato de 6 cm. Para isolar os patches, fazer uma faixa perpendicular com a agulha ao redor do epitélio pigmentado e separe a folha por arranhá-lo suavemente com a agulha. Aspirar 10 manchas pigmentadas utilizando uma pipeta de 1.000 µ l e transferi-los em um único poço da placa de 24 poços.</li>
		<li>Mantenha os patches hiRPE ProN2 médio em uma incubadora de cultura celular em 37 ° C e 5% CO2 por 48 h antes de mudar o meio. Observe esta passagem de célula hiRPE como 0 (hiRPEp0). Altere o meio de cada 2-3 dias com ProN2 médio.</li>
		<li>Quando as células são confluentes, passe as células hiRPEp0.<ol>
<li>Retire o meio usando sistemas de vácuo-aspiração e lave cada bem 1 x com 1 mL de PBS usando uma pipeta de 5 mL.</li>
			<li>Descartar a PBS usando sistemas de vácuo-aspiração, adicionar 200 µ l por alvéolo de tripsina 0,25% e incube-lo por um período mínimo de 15 min em uma incubadora a 37 ° C. Adicione 800 µ l de meio ProB27 para inactivar a tripsina. Nota: Não é recomendado o uso de ProN2 meio de parar a atividade de tripsina.</li>
			<li>Dissocia a folha de hiRPE células pipetando-lo acima e para baixo. Coloque a suspensão de células em um tubo de 15 mL e centrifugue por 5 min a 110 x g. Nota: Uma lavagem adicional pode ser feita com ProN2 médio para remover o excesso de ProB27 médio.</li>
			<li>Remover o sobrenadante e suavemente Ressuspender as células em 2 mL do meio de ProN2 pré aquecido a 37 ° C. Conte as células com um contador de célula.</li>
			<li>Levar a 1,25 milhões de células e colocá-los em um frasco de2 matriz-revestido da T-25 cm (consulte a etapa 2.2.2) contendo 5 mL de meio ProN2 pré aquecido a 37 ° C. Observe esta passagem de célula hiRPE como 1 (hiRPEp1).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Manter as células de hiRPE no meio de ProN2 em uma incubadora de cultura celular em 37 ° C e 5% CO2 por 48 h antes de mudar o meio.</li>
		<li>Mude os meios de comunicação a cada 2-3 dias. Quando as células de hiRPEp1 chegarem a confluência, execute a seguinte passagem ou criopreservação.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. criopreservação de Organoids da retina e células hiRPE
<ol><li>
Para organoids toda da retina
	<ol>
<li>Selecione o organoids da retina de 5 a 20 usando uma pipeta de transferência e colocá-los em um frasco criogênico. Remova qualquer excesso com uma pipeta de 1.000 µ l de meio sem tocar o organoids na parte inferior do tubo e adicionar 250 µ l de meio frio criopreservação (ver Tabela de materiais).</li>
		<li>Congele os frascos em um recipiente de congelação baseada em isopropanol a-80 ° C durante um período mínimo de 4 h. transferência os frascos congelados para um congelador de-150 º C ou tanque de nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Para as células hiRPE
	<ol>
<li>Na passagem 1, dissocia as células hiRPE quando as células são confluentes. Nota: Não é recomendada uma criopreservação de células hiRPEp0.</li>
		<li>Aspire o meio do balão de T-25 cm2 usando sistemas de vácuo-aspiração e lavá-lo 1x com 3 mL de PBS usando uma pipeta de 5 mL.</li>
		<li>Remover a PBS usando sistemas de vácuo-aspiração, adicionar 1 mL de tripsina 0,25% e incube-lo por um período mínimo de 15 min em uma incubadora a 37 ° C. Adicione 5 mL de meio de ProB27 para parar a atividade de tripsina. Nota: Não é recomendado o uso de ProN2 médio para inactivar a tripsina.</li>
		<li>Dissocia a folha de hiRPE células pipetando-lo acima e para baixo com uma pipeta de 10 mL. Conte as células com contador de célula. Coloque a suspensão de células em um tubo de 15 mL e centrifugue por 5 min a 110 x g. Nota: Uma lavagem adicional pode ser executada com ProN2 médio para remover o excesso de ProB27 médio.</li>
		<li>Aspirar o sobrenadante usando vácuo-aspiração e ressuspender delicadamente as células para obter 2 milhões de células em 250 µ l de meio de criopreservação.</li>
		<li>Transferência de 250 µ l de suspensão de células por frasco criogênico. Congele os frascos em um recipiente de congelação baseada em isopropanol a-80 ° C por um período mínimo de 4h.</li>
		<li>Transferi os frascos congelados para um freezer de-150 º C ou um tanque de nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. descongelamento de Organoids da retina e células hiRPE
<ol><li>
Descongelamento de toda retina organoids
	<ol>
<li>Médio de ProB27 aquecido a 37 ° C (2ml será necessário para cada frasco criogênico).</li>
		<li>Congelador de-150 º C ou do tanque de nitrogênio líquido, descongele um frasco criogênico contendo organoids da retina em banho-maria a 37 ° C por 30 s. desinfectar o frasco criogênico com cuidado usando um spray de solução desinfetante.</li>
		<li>Abrir o frasco e adicione 1 mL de meio de ProB27 previamente aquecido. Transferi o organoids para um tubo de 1,5 mL com uma pipeta de transferência.</li>
		<li>Retire o meio suavemente pipetando-lo sem tocar as estruturas da retina no fundo do tubo. Lave o organoids 1 mais uma vez com 1 mL do meio de ProB27 previamente aquecido.</li>
		<li>Aspirar o organoids com uma pipeta de transferência e colocá-los em 1 bem de uma placa de 6 contendo ProB27 médio pré aquecido e equilibrado numa incubadora a 37 ° C e 5% de CO2. Nota: Coloque organoids da retina de 10-15 por alvéolo de uma placa de 6.</li>
		<li>Metade do meio de mudar a cada 2-3 dias durante o tempo necessário para obter os tipos de células da retina desejada de acordo com o seu surgimento, conforme descrito na Figura 2.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Descongelamento das células hiRPE
	<ol>
<li>Médio de ProN2 aquecido a 37 ° C (8 mL será necessário para cada frasco criogênico).</li>
		<li>-150 º C congelador ou do tanque de nitrogênio líquido, descongele uma amostra criogênica de células hiRPEp1 por uma incubação em banho-maria a 37 ° C por 30 s. desinfectar o frasco criogênico cuidadosamente usando spray de solução desinfetante.</li>
		<li>Abra o tubo e adicionar 1 mL de meio de ProN2 previamente aquecido e transfira a suspensão de células para um tubo de 15 mL contendo 2 mL do meio de ProN2 previamente aquecido. -Centrifugar durante 5 min à 110 x g.</li>
		<li>Remover o sobrenadante e suavemente Ressuspender as células em 2 mL do meio de ProN2 pré aquecido a 37 ° C.</li>
		<li>Conte as células com um contador de célula.</li>
		<li>Pegue a 1,25 milhões de células e colocá-los o matriz revestidos T-25 cm2 balão (ver passo 2.2.2) contendo 5 mL de meio ProN2 pré aquecido a 37 ° C. Nesta fase, note a passagem 2 (hiRPEp2).</li>
		<li>Manter as células de hiRPEp2 no meio de ProN2 na incubadora de cultura celular em 37 ° C e 5% CO2 por 48 h antes de mudar o meio.</li>
		<li>Mude os meios de comunicação a cada 2-3 dias. Quando as células hiRPE alcançar confluência, execute a seguinte passagem ou criopreservação. Nota: Depois de 2 semanas na cultura, 8 milhões hiRPE células podem ser coletadas para novas experimentações.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Reichman, S., Slembrouck, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+storable+retinal+organoids+and+retinal+pigmented+epithelium+from+adherent+human+ips+cells+in+xeno-free+and+feeder-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human ips cells in xeno-free and feeder-free conditions.</a> Stem Cells. 35, 1176-1188 (2017).</li>
<li>Chen, G., Gulbranson, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+conditions+for+human+iPSC+derivation+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture.</a> Nature Methods. 8, 424-429 (2011).</li>
<li>Croze, R. H., Buchholz, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROCK+inhibition+extends+passage+of+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+pigmented+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">ROCK inhibition extends passage of pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium.</a> Stem Cells Translational Medicine. 3, 1066-1078 (2014).</li>
<li>Eberle, D., Schubert, S., Postel, K., Corbeil, D., Ader, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+integration+of+transplanted+CD73-positive+photoreceptor+precursors+into+adult+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Increased integration of transplanted CD73-positive photoreceptor precursors into adult mouse retina.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52, 6462-6471 (2011).</li>
</ol>

Sacha Reichman, Olivier Goureau e José-Alain Sahel são inventores na pendente patentes relacionadas com a geração de células da retina a partir células-tronco pluripotentes humanas.

Este protocolo descreve como produzir as células RPE e organoids da retina, contendo RGCs da retina e fotorreceptores, de células-tronco pluripotentes humanas em condições de livre de xeno e alimentador. Compatível com o processo de boas práticas de fabricação (BPF), o método cultivado aqui apresentada permite uma grande produção de iPSC-derivado de células da retina como RPE células RGCs e fotorreceptores para o desenvolvimento de terapias baseadas em células-tronco e drogas abordagens de descoberta para o tratamento fu...

A retina é uma parte integrante do sistema nervoso central (SNC) e tem uma capacidade limitada para regenerar espontaneamente após uma lesão traumática ou doenças. Portanto, patologias degenerativas, causando a perda definitiva de células da retina, como a degeneração macular relacionada à idade (DMRI), retinite pigmentosa (RP), glaucoma e retinopatia diabética, normalmente levam a cegueira irreversível. Resgatando a retina degenerada é um grande desafio para o qual terapias baseadas em células-tronco, com o objetivo de substituir as células danificadas ou perdidas são uma das mais promissoras abordagens1,2,3. Células-tronco pluripotentes como células-tronco embrionárias humanas (CES) células ou células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (iPSCs) têm a capacidade de ser expandido indefinidamente em cultura, e eles têm potencial para produzir quaisquer tipos de células. Avanços em nossa compreensão do desenvolvimento da retina e a melhoria do in vitro protocolos para diferenciação de iPSC humana resultaram na geração de retina organoids7,8,9, 10,11,12. Todas as principais células da retina, incluindo células ganglionares da retina (RGCs), fotorreceptores e células da retina pigmentadas epiteliais (RPE), tem sido com sucesso diferenciadas da humana CES e iPSCs4,5, 6. baseado no método desenvolvido por Eiraku et al SFEB (cultura dos agregados do embryoid do corpo-como isento de soro) 13, auto formação de organoids da retina pode ser obtida ESC ou iPSC-derivado do embryoid corpo-como agregados em componentes de matriz extracelular definidos a7,10,14. Mas estes protocolos são complexas, que exigem um grande número de passos não é sempre compatíveis com a grande produção de células para abordagens terapêuticas ou triagem de drogas. Assim, a escolha do método para a produção de células da retina humanas é crítica e o método precisa ser robusto, escalável e eficiente.
Aqui, com base na nossa anterior publicação15, descrevemos cada passo para uma simples e eficiente geração de células da retina através da retina organoides auto formação de aderentes iPSCs humana cultivada em uma condição livre de alimentador e xeno. A partir de culturas de rotina de iPSCs humana aderente, este protocolo requer apenas um simples meio sucessivo mudando para permitir a geração de células iPS-derivado de RPE (hiRPE) e neuroretinal estruturas em 4 semanas. Após um isolamento manual, hiRPE pode ser expandido e as estruturas da retina podem ser cultivadas como flutuante organoids onde as células progenitoras da retina são capazes de se diferenciar em todos os tipos de células da retina em ordem sequencial consistente com o humano na vivo retinogenesis. Finalmente, para o avanço de pesquisa ou clínica tradução, descrevemos um método de criopreservação, permitindo o armazenamento a longo prazo do organoids inteiro da retina e células hiRPE sem afetar suas características fenotípicas e funcionalidade.

<table><tbody><tr><td>Vitronectina (VTN-N) Proteína Humana Recombinante, Revestimento</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A14700</td><td></td></tr><tr><td>Ttruncado CTS Vitronectina (VTN-N) Proteína Humana Recombinante, Truncado</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A27940</td><td>Revestimento</td></tr><tr><td>Essential 8 Médio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1517001</td><td>médio</td></tr><tr><td>Essential 6 Médio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1516401</td><td>médio</td></tr><tr><td>CTS (Cell Therapy Systems) N-2 Suplemento</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1370701</td><td>suplemento CTS</td></tr><tr><td>N-2 Suplemento (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17502048</td><td>suplemento</td></tr><tr><td>B-27 Suplemento (50X), suplemento</td><td>de 17504044</td><td></td><td>ThermoFisher Scientific</td> sem soro</tr><tr><td>CTS B-27 Supplement, XenoFree</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1486701</td><td>suplemento CTS</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11320074</td><td>meio</td></tr><tr><td>MEM Solução de Aminoácidos Não Essenciais (100X)</td><td>Suplemento</td><td>de 11140035</td> <td>ThermoFisher Scientific</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina (10.000 U/mL)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15140122</td><td>antibiótico</td></tr><tr><td>CellStart CTS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1014201</td><td>Matrix CTS</td></tr><tr><td>Geltrex hESC-Qualified, Pronto para Uso, Fator de Crescimento Reduzido Matriz de Membrana Basal</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A1569601</td><td>Matrix</td></tr><tr><td>Reagente de Dissociação Celular Suave</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7174</td><td>solução de dissociação</td></tr><tr><td>Cryostem Mídia de congelamento</td><td>clinisciences</td><td>05-710-1D Meio de</td><td>criopreservação</td></tr><tr><td>Fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2)</td><td>Preprotech</td><td>100-18B</td><td>FGF2</td></tr><tr><td>Fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2) livre de animais</td><td>Preprotech</td><td>AF-100-18B</td><td>FGF2 Agulha AGANI livre Xeno</td></tr><tr><td>23G</td><td>Terumo</td><td>AN*2332R1</td><td>Frasco</td></tr><tr><td>de Agulha 25 cm&sup2; Falcon tratado com cultura de tecidos</td><td></td><td>353109</td><td>T-25 cm&sup2;</td></tr><tr><td>Placa de 24 poços tratada com cultura de tecidos</td><td>Costar</td><td>3526</td><td>Placa de 24 poços Placa de</td></tr><tr><td>6 poços Placa de 6 poços tratada com cultura de tecidos</td><td>Costar</td><td>3516</td> de <td>6 poços</td></tr></tbody></table>

definidos xeno-free e livre de alimentador condições de cultura para a geração de humanos ipsc-derivado da retina célula modelos

Defined Xeno-free and Feeder-free Culture Conditions for the Generation of Human iPSC-derived Retinal Cell Models

A produção de células especializadas de células-tronco pluripotentes fornece uma ferramenta poderosa para desenvolver novas abordagens para a medicina regenerativa. O uso de células-tronco pluripotentes induzidas pelo homem (iPSCs) é particularmente atraente para estudos de doenças neurodegenerativas, incluindo distrofias da retina, onde modelos de iPSC-derivado de células da retina marcam um grande passo em frente para compreender e lutar contra a cegueira. Neste trabalho, descrevemos um protocolo simples e escalável para gerar, maduro e cryopreserve organoids da retina. Baseado nas alterações de médio, a principal vantagem deste método é evitar múltiplas e comumente necessárias etapas demoradas em uma diferenciação guiada de iPSCs. Imitando as primeiras fases do desenvolvimento da retina por sucessivas mudanças de meios definidos em culturas de iPSC humana aderente, este protocolo permite a geração simultânea de automoldável estruturas neuroretinal e da retina pigmentada (RPE) as células epiteliais em um maneira eficiente e reproduzível em 4 semanas. Estas estruturas contendo células progenitoras da retina (RPCs) podem ser facilmente isoladas para maturação ainda mais em uma condição de cultura flutuante, permitindo a diferenciação de RPCs nos sete tipos de célula da retina presentes na retina humana adulta. Além disso, descrevemos os métodos rápidos para a criopreservação de organoids da retina e as células RPE para armazenamento a longo prazo. Combinados, os métodos descritos aqui será útil para produzir e banco iPSC-derivado da retina células ou tecidos para a investigação básica e clínica.

O primeiro passo para a diferenciação de iPSC humana cultivada em condições de alimentador-livre16 é para desligar máquinas de auto-renovação usando meio de Bi para incentivar uma diferenciação espontânea (figura 1A). Em seguida, no D2, o meio de Bi é complementado com um suplemento de N2 para guiar diferenciando as células de iPSCs para as linhagens neurais e da retina. Este processo leva ao aparecimento de botões de neuroretinal no p...

A produção de células especializadas da retina, de células-tronco pluripotentes é um ponto de viragem no desenvolvimento da terapia baseada em células-tronco para doenças da retina. O presente documento descreve um método simples para uma eficiente geração de organoids da retina e Epitélio pigmentado da retina para pesquisa básica, translacional e clínica.

Definidos Xeno-free e livre de alimentador condições de cultura para a geração de humanos iPSC-derivado da retina célula modelos

The production of specialized cells from pluripotent stem cells provides a powerful tool to develop new approaches for regenerative medicine. The use of ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas sobre a diferenciação de células-tronco pluripotentes no campo da retina, como a geração de diferentes tipos de células da retina a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos ou células iPS. A principal vantagem desta técnica é que a célula iPS humana aderente pode ser usada diretamente para a geração de organoides da retina, passando embrióide para a formação apenas por mudança sucessiva de meio de cultura. A engenheira de laboratório Amelie Slembrouck-Brec demonstrará o método para gerar e isolar organoides retinianos e a engenheira de laboratório Celine Nanteau demonstrará a estratégia para a produção de células epiteliais pigmentadas da retina ou RPE.Inicie a diferenciação celular iPS seguindo este esquema, que pode ser encontrado no protocolo de texto quando as colônias atingirem 60 a 70% de confluência. Prepare quatro mililitros de meio iPS basal por prato de seis centímetros e aqueça o médio a 37 graus Celsius. Em seguida, altere o meio da célula iPS para o meio iPS basal.Observe desta vez como Dia Zero. No segundo dia, troque as culturas no meio iPS basal para um meio iPS N-2 basal previamente aquecido a 37 g

defined-xeno-free-feeder-free-culture-conditions-for-generation-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

O protocolo a seguir fornece instruções para a adaptação humana tronco pluripotentes induzidas (iPS) células para alimentação livre de cultura usando completa KnockOut Feeder livre de substituição de soro médio (KSR-FF). Uma vez adaptado, instruções para a manutenção contínua também são fornecidos.

Alimentador livre adaptação, Cultura e Passaging de células iPS humanas usando Completa KnockOut Alimentador-Free substituição Serum Médio

Xenopus laevis proporciona um sistema de modelo ideal para o estudo da especificação célula destino e função fisiológica de células individuais da retina em cultura celular primária. Aqui apresenta-se uma técnica para dissecar os tecidos da retina e geração de culturas de células primárias que têm imagem para a actividade de cálcio e analisados ​​por hibridação in situ.

Dissecção, Cultura, Análise e de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Tecido embrionário da retina

As células do epitélio pigmentar da retina (RPE) derivadas de células-tronco podem ser usadas para várias aplicações, incluindo terapias baseadas em células para degeneração da retina, modelagem de doenças e estudos de medicamentos. Aqui apresentamos um protocolo simples para derivar RPE de forma reprodutível de células-tronco.

Derivação eficiente do epitélio pigmentar da retina células de células-tronco

A derivação robusta das células do tronco pluripotente humano induzido (hiPS) foi conseguida utilizando a reprogramação mediada por vetores de vírus Sendai não-integrante (SeV) de fibroblastos dérmicos. A manutenção da célula hiPS e a expansão clonal foram realizadas usando condições de cultura sem xeno e quimicamente definidas com matriz de laminina humana recombinante 521 (LN-521) e meio Essential E8 (E8).

Derivação livre de integração de células-tronco pluripotentes induzidas por seres humanos com Laminin 521 Matrix

Aqui, nós apresentamos um protocolo para formar precisamente o endotélio hemogenic das pilhas de haste pluripotentes humanas em uma condição do alimentador-e do Xeno-livre. Este método terá amplas aplicações na modelagem de doenças e triagem para compostos terapêuticos.

Diferenciação do endotélio hemogênico de células-tronco pluripotentes humanas em um alimentador-e condição definida livre de Xeno

O objetivo do protocolo é comparar diferentes condições de revestimento de matriz extracelular (ECM) para avaliar como o revestimento diferencial afeta a taxa de crescimento de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). Em particular, pretendemos estabelecer condições para obter o crescimento ideal das culturas de iPSC.

Medindo a confluência de iPSCs usando um sistema automatizado de imagem.

Aqui descrevemos um sistema de indução organoide de retina otimizado, que é adequado para várias linhas de células-tronco pluripotentes humanas para gerar tecidos retinais com alta reprodutibilidade e eficiência.

Sistema de indução organoide da retina para derivação de tecidos retinais 3D de células-tronco pluripotentes humanas

Este protocolo descreve um método eficiente de diferenciar hiPSCs em clusters de campos oculares e gerar organoides neuro-retinianos usando condições de cultura simplificadas envolvendo sistemas de cultura aderentes e de suspensão. Outros tipos de células oculares, como o EPR e o epitélio corneano, também podem ser isolados de campos oculares maduros em culturas de retina.

Geração de Organoides da Retina a partir de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos Saudáveis e Específicas de Doenças da Retina

Este protocolo descreve como gerar células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) a partir de células T periféricas humanas em condições livres de alimentador usando uma combinação de vetores de vírus matrigel e Sendai contendo fatores de reprogramação.

Geração de pluripotentes induzidas a partir de células-tronco periférico humano T células usando Sendai Virus em condições livres de Alimentador

Este trabalho descreve um protocolo in vitro de diferenciação para produzir pigmentadas, melanócitos maduros a partir de células-tronco pluripotentes humanas através de uma crista neural e melanoblasto estágio intermediário usando um protocolo sem alimentador de 25 dias.

Derivação sem alimentador de melanócitos a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Aprenda a gerar organoides retinianos e células epiteliais pigmentadas a partir de iPSCs humanos. Este método simplifica a diferenciação celular para pesquisa em doenças retinianas e medicina regenerativa.

Definidos Xeno-free e livre de alimentador condições de cultura para a geração de humanos iPSC-derivado da retina célula modelos (Vídeo) | JoVE Journal

Definidos Xeno-free e livre de alimentador condições de cultura para a geração de humanos iPSC-derivado da retina célula modelos

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