Name: Purificação e reconstituição de TRPV1 para análise espectroscópica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Aprenda a purificar e reconstituir o canal iônico TRPV1 para análise espectroscópica por ressonância paramagnética eletrônica. Este método permite obter quantidades miligramáticas de proteína funcional para estudos estruturais.

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Nós somos muito gratos ao Dr. H. Mchaourab para fornecer acesso aos espectrómetros EPR e veados e Dr. T. Rosenbaum para fornecer o plasmídeo de TRPV1 cisteína-menos completo.

<ol><li>Liao, M., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+TRPV1+ion+channel+determined+by+electron+cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the TRPV1 ion channel determined by electron cryo-microscopy.</a> Nature. 504, 107-112 (2013).</li>
<li>Cao, E., Liao, M., Cheng, Y., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+distinct+conformations+reveal+activation+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in distinct conformations reveal activation mechanisms.</a> Nature. 504, 113-118 (2013).</li>
<li>Gao, Y., Cao, E., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+structures+in+nanodiscs+reveal+mechanisms+of+ligand+and+lipid+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRPV1 structures in nanodiscs reveal mechanisms of ligand and lipid action.</a> Nature. , (2016).</li>
<li>Yang, F., Xiao, X., Cheng, W., Yang, W., Yu, P., Song, Z., Yarov-Yarovoy, V., Zheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+mechanism+underlying+capsaicin+binding+and+activation+of+the+TRPV1+ion+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural mechanism underlying capsaicin binding and activation of the TRPV1 ion channel.</a> Nat Chem Biol. 11, 518-524 (2015).</li>
<li>Bae, C., Anselmi, C., Kalia, J., Jara-Oseguera, A., Schwieters, C. D., Krepkiy, D., Won Lee, C., Kim, E. H., Kim, J. I., Faraldo-Gomez, J. D., Swartz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+mechanism+of+activation+of+the+TRPV1+channel+by+a+membrane-bound+tarantula+toxin%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the mechanism of activation of the TRPV1 channel by a membrane-bound tarantula toxin.</a> Elife. 5, (2016).</li>
<li>Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+architecture+of+the+KvAP+voltage-dependent+K%2B+channel+in+a+lipid+bilayer%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Molecular architecture of the KvAP voltage-dependent K+ channel in a lipid bilayer.</a> Science. 306, 491-495 (2004).</li>
<li>Cordero-Morales, J. F., Jogini, V., Lewis, A., Vasquez, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+driving+forces+determining+potassium+channel+slow+inactivation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular driving forces determining potassium channel slow inactivation.</a> Nat Struct Mol Biol. 14, 1062-1069 (2007).</li>
<li>Cordero-Morales, J. F., Cuello, L. G., Zhao, Y., Jogini, V., Cortes, D. M., Roux, B., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+gating+at+the+potassium-channel+selectivity+filter%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of gating at the potassium-channel selectivity filter.</a> Nat Struct Mol Biol. 13, 311-318 (2006).</li>
<li>Basak, S., Schmandt, N., Gicheru, Y., Chakrapani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+and+dynamics+of+a+lipid-induced+potential+desensitized-state+of+a+pentameric+ligand-gated+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Crystal structure and dynamics of a lipid-induced potential desensitized-state of a pentameric ligand-gated channel.</a> Elife. 6, (2017).</li>
<li>Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+structural+mechanism+for+MscS+gating+in+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers.</a> Science. 321, 1210-1214 (2008).</li>
<li>Perozo, E., Kloda, A., Cortes, D. M., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+principles+underlying+the+transduction+of+bilayer+deformation+forces+during+mechanosensitive+channel+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Physical principles underlying the transduction of bilayer deformation forces during mechanosensitive channel gating.</a> Nat Struct Biol. 9, 696-703 (2002).</li>
<li>Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open+channel+structure+of+MscL+and+the+gating+mechanism+of+mechanosensitive+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels.</a> Nature. 418, 942-948 (2002).</li>
<li>Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+rearrangements+underlying+K%2B-channel+activation+gating%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating.</a> Science. 285, 73-78 (1999).</li>
<li>Goehring, A., Lee, C. H., Wang, K. H., Michel, J. C., Claxton, D. P., Baconguis, I., Althoff, T., Fischer, S., Garcia, K. C., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nat Protoc. 9, 2574-2585 (2014).</li>
<li>Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography-based+thermostability+assay+for+membrane+protein+precrystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening.</a> Structure. 20, 1293-1299 (2012).</li>
<li>Gonzales, E. B., Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pore+architecture+and+ion+sites+in+acid-sensing+ion+channels+and+P2X+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pore architecture and ion sites in acid-sensing ion channels and P2X receptors.</a> Nature. 460, 599-604 (2009).</li>
<li>McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Motion+of+spin-labeled+side+chains+in+T4+lysozyme.+Correlation+with+protein+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics.</a> Biochemistry. 35, 7692-7704 (1996).</li>
<li>Columbus, L., Kalai, T., Jeko, J., Hideg, K., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motion+of+spin+labeled+side+chains+in+alpha-helices%3A+analysis+by+variation+of+side+chain+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Molecular motion of spin labeled side chains in alpha-helices: analysis by variation of side chain structure.</a> Biochemistry. 40, 3828-3846 (2001).</li>
<li>Zou, P., McHaourab, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+sensitivity+and+extended+range+of+distance+measurements+in+spin-labeled+membrane+proteins%3A+Q-band+double+electron-electron+resonance+and+nanoscale+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers.</a> Biophys J. 98, L18-L20 (2010).</li>
<li>Vasquez, V., Sotomayor, M., Cortes, D. M., Roux, B., Schulten, K., Perozo, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+architecture+of+membrane-embedded+MscS+in+the+closed+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional architecture of membrane-embedded MscS in the closed conformation.</a> J Mol Biol. 378, 55-70 (2008).</li>
<li>Autzen, H. E., Myasnikov, A. G., Campbell, M. G., Asarnow, D., Julius, D., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+human+TRPM4+ion+channel+in+a+lipid+nanodisc%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structure of the human TRPM4 ion channel in a lipid nanodisc.</a> Science. 359, 228-232 (2018).</li>
<li>Efremov, R. G., Gatsogiannis, C., Raunser, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Nanodiscs+as+a+Tool+for+High-Resolution+Structure+Determination+of+Membrane+Proteins+by+Single-Particle+Cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Lipid Nanodiscs as a Tool for High-Resolution Structure Determination of Membrane Proteins by Single-Particle Cryo-EM.</a> Methods Enzymol. 594, 1-30 (2017).</li>
<li>Guo, J., She, J., Zeng, W., Chen, Q., Bai, X. C., Jiang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structures+of+the+calcium-activated%2C+non-selective+cation+channel+TRPM4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structures of the calcium-activated, non-selective cation channel TRPM4.</a> Nature. 552, 205-209 (2017).</li>
<li>McGoldrick, L. L., Singh, A. K., Saotome, K., Yelshanskaya, M. V., Twomey, E. C., Grassucci, R. A., Sobolevsky, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opening+of+the+human+epithelial+calcium+channel+TRPV6%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Opening of the human epithelial calcium channel TRPV6.</a> Nature. 553, 233-237 (2018).</li>
<li>Dang, S., Feng, S., Tien, J., Peters, C. J., Bulkley, D., Lolicato, M., Zhao, J., Zuberbuhler, K., Ye, W., Qi, L., Chen, T., Craik, C. S., Nung Jan, Y., Minor, D. L. Jr, Cheng, Y., Yeh Jan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structures+of+the+TMEM16A+calcium-activated+chloride+channel%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structures of the TMEM16A calcium-activated chloride channel.</a> Nature. , (2017).</li>
<li>Velisetty, P., Stein, R. A., Sierra-Valdez, F. J., Vasquez, V., Cordero-Morales, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Purification+of+the+Pain+Receptor+TRPV1+for+Spectroscopic+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Expression and Purification of the Pain Receptor TRPV1 for Spectroscopic Analysis.</a> Sci Rep. 7, 9861(2017).</li>
<li>Salazar, H., Llorente, I., Jara-Oseguera, A., Garcia-Villegas, R., Munari, M., Gordon, S. E., Islas, L. D., Rosenbaum, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+N-terminal+cysteine+in+TRPV1+determines+activation+by+pungent+compounds+from+onion+and+garlic%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A single N-terminal cysteine in TRPV1 determines activation by pungent compounds from onion and garlic.</a> Nat Neurosci. 11, 255-261 (2008).</li>
<li>Cao, E., Cordero-Morales, J. F., Liu, B., Qin, F., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1+channels+are+intrinsically+heat+sensitive+and+negatively+regulated+by+phosphoinositide+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">TRPV1 channels are intrinsically heat sensitive and negatively regulated by phosphoinositide lipids.</a> Neuron. 77, 667-679 (2013).</li>
<li>Braman, J., Papworth, C., Greener, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-directed+mutagenesis+using+double-stranded+plasmid+DNA+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Site-directed mutagenesis using double-stranded plasmid DNA templates.</a> Methods Mol Biol. 57, 31-44 (1996).</li>
<li>Gracheva, E. O., Cordero-Morales, J. F., Gonzalez-Carcacia, J. A., Ingolia, N. T., Manno, C., Aranguren, C. I., Weissman, J. S., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ganglion-specific+splicing+of+TRPV1+underlies+infrared+sensation+in+vampire+bats%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ganglion-specific splicing of TRPV1 underlies infrared sensation in vampire bats.</a> Nature. 476, 88-91 (2011).</li>
<li>Guan, B., Chen, X., Zhang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-electrode+voltage+clamp%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-electrode voltage clamp.</a> Methods Mol Biol. 998, 79-89 (2013).</li>
<li>Jarecki, B. W., Makino, S., Beebe, E. T., Fox, B. G., Chanda, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+Shaker+potassium+channels+produced+by+cell-free+translation+upon+injection+into+Xenopus+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Function of Shaker potassium channels produced by cell-free translation upon injection into Xenopus oocytes.</a> Sci Rep. 3, 1040(2013).</li>
<li>Jeschke, G., Polyhach, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurements+on+spin-labelled+biomacromolecules+by+pulsed+electron+paramagnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance.</a> Phys Chem Chem Phys. 9, 1895-1910 (2007).</li>
<li>Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dead-time+free+measurement+of+dipole-dipole+interactions+between+electron+spins%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins.</a> J Magn Reson. 142, 331-340 (2000).</li>
<li>Mishra, S., Verhalen, B., Stein, R. A., Wen, P. C., Tajkhorshid, E., McHaourab, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformational+dynamics+of+the+nucleotide+binding+domains+and+the+power+stroke+of+a+heterodimeric+ABC+transporter%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Conformational dynamics of the nucleotide binding domains and the power stroke of a heterodimeric ABC transporter.</a> Elife. 3, e02740(2014).</li>
<li>Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spin+labeled+cysteines+as+sensors+for+protein-lipid+interaction+and+conformation+in+rhodopsin%5BTitle%5D)+AND+%22Photochem+Photobiol%22%5BJournal%5D)">Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin.</a> Photochem Photobiol. 56, 1019-1033 (1992).</li>
<li>Caterina, M. J., Schumacher, M. A., Tominaga, M., Rosen, T. A., Levine, J. D., Julius, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+capsaicin+receptor%3A+a+heat-activated+ion+channel+in+the+pain+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The capsaicin receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway.</a> Nature. 389, 816-824 (1997).</li>
<li>McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+the+fourth+dimension+of+membrane+protein+structure%3A+insight+into+dynamics+from+spin-labeling+EPR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy.</a> Structure. 19, 1549-1561 (2011).</li>
<li>Jeschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DEER+distance+measurements+on+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Phys+Chem%22%5BJournal%5D)">DEER distance measurements on proteins.</a> Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).</li>
<li>Jeschke, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distance+measurements+in+the+nanometer+range+by+pulse+EPR%5BTitle%5D)+AND+%22Chemphyschem%22%5BJournal%5D)">Distance measurements in the nanometer range by pulse EPR.</a> Chemphyschem. 3, 927-932 (2002).</li>
<li>Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+determination+of+pair+distance+distributions+by+pulsed+ESR+using+Tikhonov+regularization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Magn+Reson%22%5BJournal%5D)">The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization.</a> J Magn Reson. 172, 279-295 (2005).</li>
<li>He, Y., Wang, K., Yan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+recombinant+expression+systems+for+structure+determination+of+eukaryotic+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">The recombinant expression systems for structure determination of eukaryotic membrane proteins.</a> Protein Cell. 5, 658-672 (2014).</li>
<li>Ghimire, H., McCarrick, R. M., Budil, D. E., Lorigan, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Significantly+improved+sensitivity+of+Q-band+PELDOR%2FDEER+experiments+relative+to+X-band+is+observed+in+measuring+the+intercoil+distance+of+a+leucine+zipper+motif+peptide+%28GCN4-LZ%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Significantly improved sensitivity of Q-band PELDOR/DEER experiments relative to X-band is observed in measuring the intercoil distance of a leucine zipper motif peptide (GCN4-LZ).</a> Biochemistry. 48, 5782-5784 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

As tecnologias atuais para a expressão e purificação de proteínas de membrana mamíferos tornaram possível obter quantidades suficientes de proteína para estudos espectroscópicos14,15,16,42. Aqui, nós adaptamos essas tecnologias para expressar, purificar, reconstituir e realizar análises espectroscópicas em TRPV1.
Entre os passos críticos no protocolo, abaixo são as q...

Com os recentes avanços na microscopia single-particle cryo-elétron (cryo-EM), estruturas de canal de íon mamíferos foram obtidas numa taxa extraordinária. Particularmente, estudos estruturais dos canais de íon polimodais, tais como o transiente do receptor potencial vanilloid 1 (TRPV1), forneceram mais compreensão de sua ativação mecanismos1,2,3, 4 , 5. no entanto, informações dinâmicas sobre canais iônicos, incorporado em um ambiente de membrana serão necessárias compreender seus mecanismos de associada e ligação de drogas polimodais.
Ressonância paramagnética eletrônica (EPR) e espectroscopia de ressonância (veado) elétron-elétron duplo forneceu alguns dos modelos mecanicistas mais definitivos para o íon canais6,7,8,9 , 10 , 11 , 12 , 13. essas abordagens foram restringidas ao exame de procariotas e íon archeal canais que produzem uma grande quantidade de proteínas purificadas de detergente quando overexpressed em bactérias. Com o desenvolvimento da produção de proteínas eucariotas membrana no inseto e células de mamífero para caracterização estrutural e funcional14,15,16, é agora possível obter bioquímicos quantidades de proteínas purificadas de detergente para estudos espectroscópicos.
Os sinais EPR e cervos surgem de um rótulo de paramagneticspin (SL) (ou seja, methanethiosulfonate) anexado a um resíduo de single-cisteína da proteína. Os rótulos rotação relatam três tipos de informações estruturais: movimento, acessibilidades e distâncias. Esta informação permite determinar se os resíduos estão enterrados dentro da proteína ou são expostos à membrana ou ambiente aquoso na apo e Estados ligados de ligante13,17,18,19. No contexto de uma estrutura de alta resolução (quando disponível), os dados do EPR e veados fornecem uma coleção de restrições para a derivação de modelos dinâmicos em seu ambiente nativo enquanto monitora transição associada reversível (ou seja, fechado, aberto, sensibilizada e insensíveis). Além disso, as regiões flexíveis que podem ser difícil determinar por cristalografia de raios x ou cryo-EM podem ser obtidas usando esses conjuntos de dados ambientais para atribuir estruturas secundárias, bem como a localização dentro da proteína20. Estruturas de Cryo-EM obtidos em lipídios nanodiscs fornecido informações valiosas sobre o canal de íon canais3,21,22,23,24, 25; no entanto, abordagens espectroscópicas poderiam fornecer informação dinâmica dos Estados conformacionais (por exemplo, mudanças térmicas) que pode ser difícil de determinar usando cryo-EM.
Muitas dificuldades devem ser superadas para implementar EPR e veados, incluindo a falta de função da proteína ao remover todos os resíduos de cisteína (especialmente abundantes em mamíferos canais), rendimento de baixa proteína, instabilidade de proteínas durante a purificação e depois girar rotulagem e a agregação da proteína em detergente ou lipossomas. Aqui, nós projetamos protocolos para superar estas barreiras críticas e obtiveram informações de espectros de veado e EPR para um receptor sensorial dos mamíferos. O objetivo aqui é descrever metodologias para a expressão, purificação, rotulagem e reconstituição de um rato de cisteína-menos mínimo funcional TRPV1 (eTRPV1) construir para análises espectroscópicas. Esta metodologia é adequada para essas proteínas de membrana que mantém sua função apesar da remoção de resíduos de cisteína ou que contêm cisteína, formando ligações de bissulfeto. Esta coleção de protocolos poderia ser adaptada para a análise espectroscópica de outros canais de íon dos mamíferos.

<table><tbody><tr><td>Kit de Mutagênese Dirigida ao Local QuikChange Lightning</td><td>Agilent Technologies</td><td>210519-5</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol (Isopropanol)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A416</td><td></td></tr><tr><td>Albumina Soro Bovino (BSA)</td><td>GoldBio.com</td><td>A-420-10</td><td></td></tr><tr><td>Resina de amilose</td><td>NEB</td><td>E8021L</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinina</td><td>GoldBio.com</td><td>A-655-25</td><td></td></tr><tr><td>Asolectina do Sistema de Expressão de</td> Baculovírus <td>Bac-to-Bac Sigma</td><td>11145</td><td></td></tr><tr><td></td><td>da Soja Invitrogen Life Technologies</td><td>10359016</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads SM-2 Adsorventes&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas de vidro borossilicato (3,5 '') (injeção de oócitos)</td>Pipetas de vidro de borosilicato <td>Drummond Scientific</td><td>3-000-203 G/X</td><td></td></tr><tr><td>(gravações de oócitos)</td><td>Instrumento Sutter</td><td>B150-110-10HP</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 2H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicilina (Dissódico)</td><td>GoldBio.com</td><td>C-103-5</td><td></td></tr><tr><td>Reagente Cellfectin</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10362-010</td><td></td></tr><tr><td>cellSens</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Fisher Scientific</td><td>C606SK</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase Tipo 1</td><td>Worthington-Biochem</td><td>LS004196</td><td></td></tr><tr><td>Critiseal</td><td>VWR</td><td>18000-299</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Maltose Monohidratada</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP684</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-Docecil-B-D-Maltopiranosídeo)</td><td>Anatrace</td><td>D310S</td><td></td></tr><tr><td>Meio de alta glicose (Dulbecco' s Águia Modificada' s Médio)</td><td>Sigma</td><td>D0572&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Colunas de dessalinização PD-10 descartáveis</td><td>GE Healthcare</td><td>45-000-148</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>O2783</td><td></td></tr><tr><td>Soro bovino fetal</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10082-147</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 AM</td><td>Life Technologies</td><td>F-14201</td><td></td></tr><tr><td>GenCatch Plus Kit de mini-preparação de DNA plasmídeo</td><td>Epoch Life Science, Inc</td><td>2160250</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Limpeza de PCR GenCatch</td><td>Epoch Life Science, Inc</td><td>2360050</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Gentamicina</td><td>Lonza</td><td>17-518Z</td><td></td></tr><tr><td>Capilar de vidro (25 &micro; l)</td> <td>VWR</td><td>53432-761</td><td></td></tr><tr><td>Frasco de Vidro 2800 mL</td><td>Pyrex USA</td><td>4423-2XL</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP229</td><td></td></tr><tr><td>HEK293S GnTl-ATCC</td><td></td> <td>CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>IPTG (isopropil-tio-B-galactosídeo)</td><td>GoldBio.com</td><td>I2481C25</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de canamicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>LB Caldo, Miller</td><td>Fisher bioReagentes</td><td>BP1426</td><td></td></tr><tr><td>Hemissulfato de Leupeptina</td><td>GoldBio.com</td><td>L-010-5</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamina 2000</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP214</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4 7H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP213</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE T7 Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1344</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Fisher bioReagentes</td><td>BP2936</td><td></td></tr><tr><td>MTSL (1-Oxil-2,2,5,5-tetrametilpirrolidin-3-il) Metil Metanotiosulfonato</td><td>Toronto Research Chemicals, Inc</td><td>O873900</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Life Technologies</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>Pestatina A</td><td>GoldBio.com</td><td>P-020-5</td><td></td></tr><tr><td>Ácido Plurônico F-127 (20%)</td><td>PromoKine&nbsp; &nbsp;</td><td>CA707-59004</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>GoldBio.com</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Poli-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Rneasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Capilares selados</td><td>VitroCom</td><td>pedido</td><td></td>especial</tr><tr><td>SF-900 II SFM (meio de célula de inseto)</td> <td>Gibco, Life Technologies</td><td>10902-088</td><td></td></tr><tr><td>Sf9 Células (Adaptadas ao SFM)</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>11496-015</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de Lipídio Polar de Soja</td><td>Avanti Polar Lipids, Inc</td><td>541602C</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Fisher Scientific</td><td>S25590</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 Aumento 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>29091596</td><td></td></tr><tr><td>TCEP HCl</td><td>GoldBio.com</td><td>TCEP1</td><td></td></tr><tr><td>Cloridrato de Tetraciclina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP152</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Difco</td><td>0123-01</td><td></td></tr><tr><td>X-gal</td><td>GoldBio.com</td><td>X4281C</td><td></td></tr><tr><td>Oócitos Xenopus</td><td>Nasco</td><td>LM00935M</td><td></td></tr><tr><td>XL1 - Células Competentes Azuis</td><td>Agilent Technologies, Inc</td><td>200249</td><td></td></tr><tr><td>Levedura Coluna</td> de cromatografia <td>Extract Difco</td><td>0127-01-7</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pack</td><td>Bio-Rad</td><td>7321010</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Géis pré-moldados sem manchas</td><td>Bio-Rad</td><td>17000436</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1 Vetor de expressão</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10360-014</td><td></td></tr><tr><td>DH10Bac Células competentes</td><td>Invitrogen Life Technologies</td><td>10361-012</td><td></td></tr><tr><td>Selante de tubo capilar Critiseal</td><td>Leica Microsystems</td><td>02-676-20</td><td></td></tr><tr><td>ABI Modelo 3130XL Analisadores Genéticos</td><td>Applied Biosystems</td><td>4359571</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta de transferência</td><td>Fishebrand</td><td>13-711-9AM</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr></tbody></table>

purificação e reconstituição de trpv1 para análise espectroscópica

Purification and Reconstitution of TRPV1 for Spectroscopic Analysis

Canais de íon polimodais transduce vários estímulos de diferentes naturezas em alostéricos alterações; essas conformações dinâmicas estão desafiando para determinar e permanecem em grande parte desconhecidos. Com os recentes avanços na luz derramamento de single-particle cryo-elétron microscopia (cryo-EM) sobre as características estruturais dos sítios de ligação do agonista e o mecanismo de ativação de vários canais iônicos, o palco está montado para uma análise aprofundada e dinâmica de seus gating mecanismos, utilizando abordagens espectroscópicas. Técnicas espectroscópicas como ressonância paramagnética eletrônica (EPR) e ressonância elétron-elétron duplo (veado) foram restringidas ao estudo dos canais de íon procarióticas que pode ser purificado em grandes quantidades. A exigência de grandes quantidades de proteínas de membrana estável e funcional tem dificultado o estudo dos canais de íon mamíferos usando essas abordagens. EPR e veados oferecem muitas vantagens, incluindo a determinação da estrutura e mudanças dinâmicas das regiões de proteína celular, embora em baixa resolução, que pode ser difíceis de obter por cristalografia de raios x ou cryo-EM, e monitoramento gating reversível transição (ou seja, fechado, aberto, sensível e insensível). Aqui, nós fornecemos protocolos para a obtenção de miligramas de funcional detergente-solubilizado transient receptor potencial cação canal membro da subfamília V 1 (TRPV1) que pode ser rotulado por espectroscopia de EPR e veados.

Caracterização funcional do mínimo cisteína-menos TRPV1 construir (eTRPV1) e Single-cisteína mutantes
O primeiro passo para estudos espectroscópicos é engenheiro e caracterizar construções de cisteína-menos proteína (Figura 2A) que são funcionais e produzem quantidades bioquímicas de proteínas. eTRPV1 é funcional, conforme determinado pela imagem latente de Ca2 + e TEVC (<strong class="xfig"...

Este artigo descreve métodos específicos para obter quantidades bioquímicas de detergente-solubilizado TRPV1 para análises espectroscópicas. Os protocolos combinados fornecem ferramentas bioquímicas e biofísicas que podem ser adaptadas para facilitar estudos estruturais e funcionais para os canais de íon mamíferos em um ambiente controlado por membrana.

Purificação e reconstituição de TRPV1 para análise espectroscópica

Polymodal ion channels transduce multiple stimuli of different natures into allosteric changes; these dynamic conformations are challenging to determine ...

Aqui no laboratório, achamos que o uso de uma abordagem espectroscópica pode ajudar a responder a perguntas-chave na família de canais iônicos do potencial receptor transitório. Como determinar as mudanças informacionais dinâmicas associadas à ativação polimodal. A principal vantagem deste protocolo é que permite miligrama de canal iônico remanescente puro e funcional para ressonância paramagnética eletrônica e epitroscopia de ressonância eletrônica dupla.Este método pode fornecer informações sobre as mudanças conformacionais compatíveis com o gating térmico e independente da luz de 3B1. Também pode ser aplicado a outros canais de viagem, como 3B2, por exemplo. Comece este procedimento com primers de mutagênese de design com ferramentas online.Preparar a reação de PCR conforme descrito no protocolo de texto e centrifugar a mistura. Coloque os tubos no termociclador e execute a mutagênese por PCR usando os parâmetros de PCR listados no protocolo de texto. Em seguida, adicione dois microlitros da enzima DPN1 à reação e misture.Incube as reações a 37 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, execute a transformação adicionando 75 microlitros de células competentes de E.Coli descongela

purification-and-reconstitution-of-trpv1-for-spectroscopic-analysis

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Nós descrevemos um protocolo simples para identificar proteínas cerebrais que se ligam ao terminal de todo o comprimento C da ATP-gated P2X2 receptores. A extensão e aplicação sistemática desta abordagem para todos os receptores P2X deverá levar a uma melhor compreensão da sinalização do receptor P2X.

Proteômica para identificar proteínas Interagindo com P2X2 Canais Ligand-Gated Cation

Isotachophoresis (ITP) é uma separação eletrocinética robusto e técnica de pré-concentração com aplicações que vão desde a detecção da toxina da preparação da amostra. Revemos os princípios físicos de ITP ea metodologia de aplicar esta técnica para dois exemplos de aplicações específicas: separação e detecção de moléculas pequenas e purificação de ácidos nucleicos a partir de lisados ​​de cultura de células.

On-chip Isotachophoresis para separação dos íons e purificação de ácidos nucléicos

Termoforese microescala (MST) pode ser amplamente utilizado para a determinação da afinidade de ligação sem purificação da proteína alvo a partir de lisados ​​celulares. O protocolo envolve a sobre-expressão da proteína GFP fundida, a lise das células em condições não desnaturantes, e detecção de sinal MST na presença de várias concentrações do ligando.

Método de purificação de proteína livre de Determinação Affinity Binding por termoforese Microscale

Para complementar os métodos habitualmente utilizados para estudar TRPV4 de, dois métodos são descritos: O mecanosensibilidade pode ser estudada por Ca 2 +-aequorina luminometria em leveduras transgénicas após desafio com hipo-osmótico. Ele também pode ser examinada em TRPV4-ARN injectado oócitos de Xenopus a-célula inteira de dois eléctrodos de aperto de voltagem ou remendo grampo em no modo de célula ou excisadas.

Luminométricos levedura e Xenopus ovócitos eletrofisiológicos Exames do mecanosensibilidade Molecular de TRPV4

As principais etapas da função da proteína, em particular as mudanças conformacionais da espinha dorsal e as reações de transferência de prótons, geralmente ocorrem na escala de tempo de microssegundos a milissegundos. Esses processos dinâmicos podem ser estudados por espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier de varredura em etapas resolvida no tempo, em particular para proteínas cuja função é desencadeada pela luz.

Transferência de prótons e Proteína Conformação Dynamics em fotossensíveis Proteínas por Time-resolvido Passo-scan-Fourier Transform Infrared Spectroscopy

A reconstituição da proteína transmembranar, KvAP, em vesículas unilamelares gigantes (GUVs) é demonstrada por dois métodos de desidratação-re-hidratação - eletroformação, e inchaço assistida-gel. Em ambos os métodos, vesículas pequenas unilamelares que contêm a proteína são fundidos em conjunto para formar GUVs que pode, em seguida, ser estudadas por microscopia de fluorescência e de patch-clamp electrofisiologia.

Reconstituição de uma proteína transmembrana, a voltagem-Ion Channel, KvAP, em Gigante Unilamelares Vesicles para microscopia e de Patch Estudos Grampo

Este manuscrito descreve como conduzir ensaios baseados em Transferência de Energia de Ressonância de Förster (FRET) (molécula única) para medir a dinâmica de ligação entre o receptor de antígeno de célula T (TCR) e moléculas de MHC carregadas com peptídeos antigênicos à medida que ocorrem dentro da sinapse imunológica de uma célula T em contato com uma bicamada lipídica planar funcionalizada.

Medição de TCR-pMHC Binding<em&gt; In Situ</em&gt; Usando a microscopia Ensaio de FRET

Estudar canais iônicos através de um sistema heterólogo expressar tornou-se uma técnica nuclear em pesquisa biomédica. Neste texto, apresentamos um método eficiente tempo para conseguir uma expressão de canal iónico com força controlada através da realização de transfecção transiente, sob o controlo de um promotor indutível.

Controlável Expressão Ion Canal através de transfecção transiente Induzível

Este protocolo descreve técnicas utilizadas para determinar as estruturas do canal de íon pela microscopia cryo-elétron, incluindo um sistema de baculovirus usado eficientemente expressar genes em células de mamíferos, com esforço mínimo e toxicidade, extração de proteínas, purificação, e verificação de qualidade, preparação da amostra grade e triagem, bem como coleta de dados e processamento.

Expressão e purificação de TRPC3 os humanos sensíveis lipídico cação canal para determinação estrutural por microscopia de Single-particle Cryo-elétron

Com base no mecanismo de montagem do complexo proteico INAD, neste protocolo, foi desenvolvida uma purificação de afinidade modificada mais estratégia de concorrência para purificar o canal endogenso Drosophila TRP.

Purificação dos canais potenciais do receptor transitório Endogenous Drosophila

Este protocolo descreve uma abordagem de processamento de imagem baseada em iSCAT e rastreamento de partículas únicas que permite a investigação simultânea da massa molecular e o comportamento difuso de macromoléculas interagindo com membranas lipídicas. Instruções passo a passo para preparação da amostra, conversão em massa para contraste, aquisição de filmes e pós-processamento são fornecidas juntamente com direções para evitar possíveis armadilhas.

Rastreamento de partículas sensíveis à massa para caracterizar dinâmicas de macromolécula associadas à membrana

Aprenda a purificar e reconstituir o canal iônico TRPV1 para análise espectroscópica por ressonância paramagnética eletrônica. Este método permite obter quantidades miligramáticas de proteína funcional para estudos estruturais.

Purificação e reconstituição de TRPV1 para análise espectroscópica

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