Name: Purificação eficiente e desenvolvimento de ensaio baseado no LC-MS/MS para dez-onze translocação-2 5-metilcitosina dioxigenase (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Aprenda a purificar a enzima TET2 humana ativa sem marcação usando cromatografia de troca iônica em uma única etapa. Este método permite analisar a atividade enzimática e seus produtos por LC-MS/MS para estudos epigenéticos avançados.

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Esta pesquisa foi financiada pelo departamento de defesa sob a forma de um prêmio Idea (W81XWH-13-1-0174), Anemia aplástica e MDS Foundation Grant, e grant UMRB M.M. Authors agradecer Mohit Jaiswal e Subhradeep Bhar clonagem inicial de TET2 no vetor pDEST14.

1. clonagem e purificação de dioxigenase TET2 humana sem marcas de formatação
<ol><li>Clonagem humana TET2 dioxigenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) para o vetor de destino de pDEST14 usando a técnica de recombinação site-specific como descrito anteriormente,22. Nota: Estudos anteriores demonstraram que o domínio C-terminal TET2 dioxigenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) é o mínimo domínio cataliticamente ativo21,23. Para expressar o domínio de dioxigenase TET2 não marcado usando o vetor de pDONR221, Shine Dalgarno e Kozak sequências foram incorporadas no primer para a frente durante PCR (tabela 1).</li>
	<li>Para a transformação bacteriana, adicionar 1 µ l de vetor de expressão pDEST14 recombinante contendo formatação humana TET2 dioxigenase (TET2 1129-1936, Δ1481-1843) para 100 µ l de quimicamente competentes de Escherichia coli BL21 (DE3) células em um tubo de 1,7 mL. Manter a mistura no gelo pelo menos 15 minutos, seguido de choque térmico a 42 ° C por 30 s num banho de água.<ol>
<li>Imediatamente após o choque térmico, manter as células no gelo por período mínimo de 2 min. Em seguida, adicione 250 µ l de caldo super ideal com repressão catabolite (S.O.C mídia) às células. Incube as células bacterianas para 1 h a 37 ° C em uma coqueteleira.</li>
		<li>Após a incubação, spin para baixo as células por centrifugação do tubo a 9.000 x g por 1 min. Discard 70% sobrenadante pipetando e dissolva a pelota na esquerda sobre meios de comunicação.</li>
		<li>Espalhe a suspensão de células numa placa de ágar Luria caldo (LB) contendo 100 ampicilina µ g/mL. Incubar a placa para 16 h a 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Selecione uma colônia isolada e inoculá-lo em 10 mL de mídia LB-ampicilina em um tubo de 50 mL. Incube o tubo a 37 ° C em uma coqueteleira para pernoite. Em seguida, use 100 µ l de cultura do tubo de 50 mL para inocular 100ml de mídia LB-ampicilina. Incubar o frasco a 37 ° C, um agitador a 180 rpm e usá-lo como cultura primária. No dia seguinte, use 6 mL cada de principal cultura para inocular 15 frascos, cada contendo mídia 600ml LB-ampicilina. Agora, Incube 15 frascos a 37 ° C, um agitador a 180 rpm. Nota: Para verificar clones transformados, realize digestão de sequenciamento ou restrição de DNA com o ADN do plasmídeo isolado.</li>
	<li>Para verificar a densidade de cultura bacteriana, medir sua OD600 usando um espectrofotômetro. Depois que a cultura atinge uma densidade de 0,8 em OD600, induzir a expressão da proteína de TET2 com 300 µ l de 1 M (concentração final de 0,5 mM de 600ml) IPTG em cada balão e crescer ainda mais a cultura para 16 h a 17 ° C.</li>
	<li>Após 16 h, transferi a cultura bacteriana para garrafas de centrífuga. Centrifugar a cultura bacteriana, expressando a enzima TET2 a 5.250 x g durante 45 min. uso a pelota bacteriana para a purificação de TET2. Nota: Executar todas as etapas de purificação de proteínas restantes no gelo ou a 4 ° C.</li>
	<li>Resuspenda o pellet bacteriano em 100 mL de MES de 50 mM (2-(N-Morpholinos) ácido etanesulfónico) buffer, pH 6 e proceda à sonicação por 5 × 30 s, a potência 20 com 60 intervalos de resfriamento s.</li>
	<li>Girar o lisado a 5.250 x g durante 45 min. recolher o sobrenadante contendo a enzima TET2 solúvel e passa por 0,45 µm filtros antes de carregar um sistema FPLC. Nota: Nestas experiências, a enzima TET2 era muito estável, mas se for necessário um protease inibidor cocktail contendo 1 mM benzamidina-HCl, fluoreto de fenilmetilsulfonil de 1 mM (PMSF) e 0,5 mM 1,10 -o- fenantrolina podem ser adicionado à célula de lisado de prevenir a degradação da enzima TET2. Evite usar EDTA ou EGTA o inibidor cocktail como estes podem interferir com a cromatografia de permuta catiónica a seguir.</li>
	<li>Juntar 30 mL de uma resina de troca de cátion forte em uma coluna FPLC. Equilibrar a coluna com 10 volumes de cama de tampão de lavagem (tampão MES de 50 mM, pH 6) à taxa de fluxo constante de 0,3 mL/min, usando um sistema FPLC.</li>
	<li>Carregar o esclareceu lisado na coluna pre-equilibrada e lavagem com volumes de cama ∼10 de tampão de lavagem até que o fluxo através de torna-se claro.</li>
	<li>Eluir TET2 usando um 0-100% gradiente do tampão de lavagem para o buffer de eluição (tampão MES de 50 mM, pH 6, 1 M NaCl), em 15 volumes de cama seguido de exploração no tampão de eluição de 100% para volumes de duas camas. Nota: Coletar amostras (100 µ l cada) de célula lisada antes e depois da coluna carregando juntamente com todas as frações de eluição e analisar em 10%, solução de SDS-PAGE.</li>
	<li>As frações que contêm a proteína TET2 do pool, congelar-seco, dissolver pálete de enzima em 10 mL de água e loja a-80 ° C.</li>
</ol>2. 5mC oxidação por TET2 dioxigenase
<ol><li>Execute todas as reações de desmetilação em triplicado com 3 µ g de substrato (25-mer ADN encalhado dobro, tabela 2).<ol>
<li>Adicione 100 µ g de enzima purificada de TET2 em 50 µ l de tampão de reação total contendo 50 mM HEPES (pH 8.0), 200 µM Filipa4, 2mm 2OG (2-do oxoglutarate/α-cetoglutarato) e ascorbato de 2mm e incubar a 37 ° C, durante 1 h21.</li>
		<li>Saciar TET2 catalisada por reações de oxidação com 5 µ l de 500 mM de EDTA.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após têmpera TET2 reações, prepare amostras para análise de LC-MS/MS, separando o DNA da mistura de reação TET2 usando colunas de purificação oligo.<ol>
<li>Adicione 100 µ l de tampão de ligação oligo a 55 µ l de reação extinta.</li>
		<li>Em seguida, adicione 400 µ l de etanol 100% à mistura. Passe esta mistura por meio de uma coluna de ligação de oligo.</li>
		<li>Lave o DNA acoplado com tampão de lavagem 750 µ l e eluir em 20 água µ l.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Digerir o DNA isolado com 2 unidades de DNase eu e 60 unidades de nuclease S1 a 37 ° C, durante 12 h para produzir nucleosídeo-monophosphates individual.</li>
	<li>Após digestão, acrescente 2 unidades de bezerro intestinal da fosfatase alcalina (CIAP) nas amostras e incube por adição de 12 h a 37 ° C para remover os grupos fosfato terminal do nucleoside-monophosphates para obter nucleosídeos.</li>
	<li>Quantificar todos os nucleosídeos, especialmente modificados metiladas, usando o método de LC-MS/MS descrito abaixo.</li>
</ol>3. desenvolvimento de ensaio quantitativo de LC-MS/MS-baseado
<ol><li>Preparar a solução estoque de 100 µM de todos os nucleosídeos modificados citosina [5-metil-2 '-deoxycytidine (5mdC), 5-hidroximetil-2 '-deoxycytidine (5hmdC), 5-formil-2 '-deoxycytidine (5fdC) e 5-carboxi-2 '-deoxycytidine (5cadC)] e DNA normal bases (adenina, timina, citosina e guanina) em água de qualidade para HPLC para o desenvolvimento do método LC-MS/MS.</li>
	<li>Otimizar parâmetros de MS/MS nucleosídeo dependentes através da infusão de soluções estoque, um de cada vez, no espectrômetro de massa a uma taxa de fluxo de 10 µ l/min em EMS modo scan. Otimizar seguindo parâmetros: Declustering potencial (DP), entrada potencial (EP), colisão célula entrada potencial (CEP), energia de colisão (CE) e colisão célula saída potencial (CXP) para cada nucleosídeo de DNA usando automatizada otimização quantitativa característica do software.</li>
	<li>Otimize parâmetros de MS/MS fonte dependente por injectar 10 µ l de solução-mãe usando um gradiente com 25% de solvente B em uma taxa de fluxo de 0,3 mL/min, onde solvente A é acetato de amônio 10 mM (pH 4.0) e solvente B é 20% acetonitrila com acetato de amônio 10 mM (pH 4.0). Otimizar seguindo parâmetros: cortina de gás (CUR): 10-50, temperatura: 0-600 ° C, 1 fluxo do gás (GS1): 0-50, 2 de fluxo de gás (GS2): 0-50, Collisionally ativado dissociação (CAD): baixa-média-alta, íon pulverizar tensão (IS): 4000-5500 para cada nucleosídeo do ADN usando manual recurso de otimização quantitativa do software no modo FIA (análise de injeção de fluxo).</li>
	<li>Para separar todas as oito nucleosídeos de DNA, realizar cromatografia líquida, usando o seguinte gradiente: 0% solvente B (0-2 min), 0-20% de solvente B (2-5 min), 20-60% solvente B (5-9 min), solvente de 0-60% B (9-10 min) e então equilibrar com solvente A por 5 min com um caudal de 0.3 mL/min em uma coluna C18 (tamanho de partícula: 5 µm, Pore tamanho: 120 Å).</li>
	<li>Usando os parâmetros ideais MS/MS (passo 3.2 e 3.3), juntamente com o gradiente de cromatografia líquida acima mencionados (passo 3.4), determinar a linearidade de resposta, limite de detecção (LOD) e limite inferior de quantificação (LLOQ) usando um dupla diluição serial de uma mistura padrão de 100 µM, contendo todos os oito nucleosídeos. Desenhe curvas padrão para todos os oito nucleosídeos de DNA.</li>
	<li>Detectar e quantificar todos os nucleosídeos, especialmente modificados metiladas, produzidos na etapa 2.4 usando o método de LC-MS/MS e curvas padrão.</li>
</ol>

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<li>Smith, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+sequencing+of+the+TET2+gene+in+355+MDS+and+CMML+patients+reveals+low-abundance+mutant+clones+with+early+origins%2C+but+indicates+no+definite+prognostic+value%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Next-generation sequencing of the TET2 gene in 355 MDS and CMML patients reveals low-abundance mutant clones with early origins, but indicates no definite prognostic value.</a> Blood. 116, 3923-3932 (2010).</li>
<li>Moran-Crusio, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet2+loss+leads+to+increased+hematopoietic+stem+cell+self-renewal+and+myeloid+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tet2 loss leads to increased hematopoietic stem cell self-renewal and myeloid transformation.</a> Cancer Cell. 20, 11-24 (2011).</li>
<li>Quivoron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET2+inactivation+results+in+pleiotropic+hematopoietic+abnormalities+in+mouse+and+is+a+recurrent+event+during+human+lymphomagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">TET2 inactivation results in pleiotropic hematopoietic abnormalities in mouse and is a recurrent event during human lymphomagenesis.</a> Cancer Cell. 20, 25-38 (2011).</li>
<li>Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+of+Tet2+in+mice+leads+to+dysregulated+hematopoietic+stem+cells+and+subsequent+development+of+myeloid+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Deletion of Tet2 in mice leads to dysregulated hematopoietic stem cells and subsequent development of myeloid malignancies.</a> Blood. 118, 4509-4518 (2011).</li>
<li>Ko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ten-Eleven-Translocation+2+%28TET2%29+negatively+regulates+homeostasis+and+differentiation+of+hematopoietic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Ten-Eleven-Translocation 2 (TET2) negatively regulates homeostasis and differentiation of hematopoietic stem cells in mice.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, 14566-14571 (2011).</li>
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</ol>

Os autores têm a declarar, sem interesses financeiros.

Mutações no gene TET2 são algumas das alterações genéticas mais frequentemente detectadas em pacientes com diversas malignidades hematopoiéticas. Até à data centenas de mutações TET2 diferentes, que incluem o absurdo, deslocamento de quadro e mutações missense, foram identificados em pacientes12. Pacientes com mutações TET2 mostram níveis baixos de 5hmC genômica na medula óssea, em comparação com aqueles com wt-TET214. TET2 mutantes bater-em experimentos t...

A posição de C5 de bases citosina dentro dinucleotídeos CpG é o site de metilação predominante (5mCpG) em genomas de mamíferos1. Além disso, uma série de estudos recentes revelaram extensa C5 methylation do cytosine (5mC) em sites não-CpG (5mCpH, onde H = A, T, ou C)2,3. modificação de 5mC serve como um silenciador transcriptional em retrotransposons endógena e gene promotores3,4,5. Metilação do DNA no 5mC também tem um papel importante na inactivação do cromossoma X, impressão de gene, reprogramação nuclear e expressão de genes tecido-específica a5,6,7. Metilação de citosina na posição C5 é efectuada pelas metiltransferases do DNA e mutações nestas enzimas causam defeitos significativos do desenvolvimento8. A remoção de marcas de 5mC são iniciadas por TET1-3 5mC oxidases9,10. Estes dioxygenases TET-família converter 5mC em 5-Hidroximetilcitosina (5hmC), 5-formylcytosine (5-fC) e 5-carboxylcytosine (5caC) por oxidação sequencial passos11,12,13. Finalmente, a timina-DNA glycosylase substitui 5fC ou 5caC de citosina não modificada usando o reparo de excisão de base via11.
O gene humano que TET2 foi identificado como um gene frequentemente mutado em diversas malignidades hematopoiéticas incluindo mielodisplásica síndromes (MDS)14,15,16, MDS-mieloproliferativa (Neoplasias MDS-MPN) e a leucemia mieloide aguda (LMA) provenientes de MDS e MDS-MPN16. Os níveis de 5hmC modificação na medula óssea DNA são mais baixos em pacientes com mutações TET2 em comparação com aqueles com tipo selvagem (wt)-TET214. Um número de grupos desenvolveram modelos de rato TET2-nocaute para elucidar seu papel na hematopoiese normal e transformação mieloide17,18,19,20. Estes ratos com mutações no gene TET2 foram inicialmente normal e viável, mas se manifesta diversas malignidades hematopoiéticas, medida que envelheciam, causando sua morte precoce. Estes estudos mostraram o importante papel desempenhado pelo wt-TET2 na diferenciação hematopoiética normal. Estes modelos de rato, heterozigotos as células-tronco hematopoiéticas (TET2+ /- linfócitos) e homozigotos TET2- / - linfócitos tinham uma vantagem competitiva sobre linfócitos homozigotos wt-TET2 no repovoamento linhagens hematopoiéticas como ambos TET2+ /- e TET2- / - linfócitos desenvolveu diversas malignidades hematopoiéticas17,18. Estes estudos demonstram essa haploinsuficiência do TET2 dioxigenase altera o desenvolvimento dos linfócitos e resulta em malignidades hematopoiéticas.
Semelhante a camundongos com mutações no gene TET2, a maioria dos pacientes de leucemia manifesto haploinsuficiência TET2 dioxigenase atividade. Estas mutações somáticas principalmente heterozigotas incluem mutações quadro-shift e absurdo, dispersadas por todo o corpo de gene TET2 enquanto mutações missense que são mais agrupado no domínio dioxigenase12. Até à data, pouco caracterização de wt - e mutante-TET2 é relatada na literatura principalmente devido às dificuldades com a produção de dioxigenase TET2 e seu ensaio21. Aqui, nós relatamos uma simples purificação de etapa única de nativo TET2 dioxigenase usando cromatografia de troca iónica. Além disso, um ensaio quantitativo de LC-MS/MS foi otimizado e usado para medir a atividade enzimática de nativo TET2 dioxigenase.

<table><tbody><tr><td>HEPES</td><td>Carbosynth</td><td>FH31182</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de ferro (II) heptahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8633</td><td></td></tr><tr><td>&alfa;-ácido cetoglutárico (ácido 2-oxoglutárico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1750</td><td></td></tr><tr><td>Ácido L-ascórbico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético sal dissódico di-hidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1542</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila</td><td>Fisher Scientific</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Água de grau HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>7732-18-5</td><td></td></tr><tr><td>Oligo limpo e concentrador</td><td>Zymo Research</td><td>D4061</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>S1 Nuclease</td><td>Thermo Scientific</td><td>ENO321</td><td></td></tr><tr><td>CIAP (fosfatase alcalina intestinal de bezerro)</td> <td>New England Biolabs</td><td>M0290S</td><td></td></tr><tr><td>LB Media</td><td>Affymetrix</td><td>J75852</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Carbosynth</td><td>EI05931</td><td></td></tr><tr><td>MES [2-(N-Morfolino) ácido etanossulfônico monohidratado]</td> <td>Carbosynth</td><td>FM37015</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>SP Sepharose</td><td>Fisher Scientific</td><td>45-002-934</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deoxy-5-metilcitidina</td><td>TCI</td><td>D3610</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deoxy-5-hidroximetialcitidina</td><td>TCI</td><td>D4220</td><td></td></tr><tr><td>2'-Desoxicitidina-5-ácido carboxílico, sal de sódio</td><td>Berry & AMP; Associados</td><td>PY 7593</td><td></td></tr><tr><td>5-Formi-2'-desoxicitidina</td><td>Berry & Associados</td><td>PY 7589</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deoxicitidina</td><td>Berry & Associates</td><td>PY 7216</td><td></td></tr><tr><td>Carbosynth</td><td>2'-Deoxyadenosine</td><td>ND04011</td><td></td></tr><tr><td>Carbosynth</td><td>2'-Deoxyguanosine</td><td>ND06306</td><td></td></tr><tr><td>2'-Deoxythymidine</td><td>VWR Life Science</td><td>97061-764</td><td></td></tr><tr><td>Tecnologia de gateway</td><td>Thermo Fisher</td><td>11801016</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Beckman Allegra X-15R&nbsp;</td><td>Beckman Coulter</td><td>392932</td><td></td></tr><tr><td>Sonic Dismembrator 550</td><td>Fisher Scientific</td><td>XL2020</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; Sistema FPLC KTA</td><td>Pharmacia (GE Healthcare)</td><td>18116468</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de liofilização FreeZone 4.5</td> Colunas de purificação <td>Labconco</td><td>7750020</td><td></td></tr><tr><td>Zymo Oligo&nbsp;</td><td>Zymo Research</td><td>D4061</td><td></td></tr><tr><td>BDS Hypersil C18 coluna</td><td>Keystone Scientific, INC</td><td>105-46-3</td><td></td></tr><tr><td>3200 Espectrômetro de massa Q-Trap</td><td>AB Sciex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HPLC&nbsp;</td><td>HPLC Shimadzu&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coluna XK16/20 FPLC</td><td>Pharmacia (GE Healthcare)</td><td>28988937</td><td></td></tr></tbody></table>

purificação eficiente e desenvolvimento de ensaio baseado no lc-ms/ms para dez-onze translocação-2 5-metilcitosina dioxigenase

Efficient Purification and LC-MS/MS-based Assay Development for Ten-Eleven Translocation-2 5-Methylcytosine Dioxygenase

O Regulamento epigenéticas transcrição mediado por 5-metilcitosina (5mC) tem desempenhado um papel crítico no desenvolvimento de eucariota. Desmetilação destas marcas epigenéticas é realizada pela oxidação sequencial por dez-onze translocação dioxygenases (TET1-3), seguida-se o reparo de excisão de base glycosylase-dependente de timina-DNA. Inativação do gene TET2 devido a mutações genéticas ou por outros mecanismos epigenéticos está associada um mau prognóstico em pacientes com diversos tipos de câncer, especialmente malignidades hematopoiéticas. Aqui, descrevemos uma purificação eficiente passo a passo de dioxigenase TET2 enzimaticamente ativo não marcado humano usando a cromatografia de permuta catiónica. Nós fornecemos mais uma abordagem de líquido espectrometria de massa em tandem-cromatografia (LC-MS/MS) que pode separar e quantificar as quatro bases de DNA normais (A, T, G e C), bem como as quatro bases citosina modificado (5-metil, 5-hidroximetil, formil-5 e 5-carboxila). Este ensaio pode ser usado para avaliar a atividade de tipo selvagem e mutante TET2 dioxygenases.

Modificação dinâmica de 5mC em DNA por TET-família dioxygenases tem um papel importante no Regulamento transcriptional epigenético. TET2 dioxigenase é frequentemente mutado em diversas malignidades hematopoiéticas12. Para investigar o papel da enzima TET2 no desenvolvimento normal e a doença, nós temos clonado seu domínio mínimo cataliticamente ativo sem qualquer marca de afinidade para o vetor de pDEST1422. A dioxigenase TET2 não marcado fo...

Aqui, apresentamos um protocolo para uma purificação eficiente passo a passo do ativo humano sem marcas de formatação a translocação de 10-11-2 (TET2) 5-metilcitosina dioxigenase usando cromatografia de permuta iónica e seu ensaio usando uma massa em tandem-cromatografia líquida espectrometria (LC-MS/MS)-com base em abordagem.

Purificação eficiente e desenvolvimento de ensaio baseado no LC-MS/MS para dez-onze translocação-2 5-metilcitosina dioxigenase

The epigenetic transcription regulation mediated by 5-methylcytosine (5mC) has played a critical role in eukaryotic development. Demethylation of these ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave na epigenética e no campo de desmetilação de 5-metilcittosina mediada por TET2, como uma análise da atividade de mutações TET2 normais e clínicas. A principal vantagem dessa técnica é que o TET2 nativo pode ser purificado em uma única etapa, e sua atividade pode ser analisada em termos de formação dos três produtos. Vários estudantes de pós-graduação estarão demonstrando o procedimento.A purificação da proteína será realizada por Chayan Bhattacharya, o ensaio TET2 de Aninda Sundary Dey, e a análise LC-MS/MS por Navid Ayon. Para transformação bacteriana, adicione um microlitro de células de expressão de destino recombinante pDEST 14 contendo dioxigenase tet2 humana não marcada a 100 microlitrais de células E.coli BL21 DE3 quimicamente competentes em um tubo de 1,7 mililitro. Após a incubação no gelo por pelo menos 15 minutos, o calor choque a mistura a 42 graus Celsius por 30 segundos em um banho de água.Imediatamente após o choque térmico, coloque as células de volta no gelo por um mínimo de dois minutos. Depois disso, adicione 250 microliters de caldo super ideal com repressão catabólica às células. Incubar as células bacterian

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Compostos de captura são trifuncional pequenas moléculas para reduzir a complexidade do proteoma por funcionais reversíveis interação molécula de proteína pequena seguido por foto-reticulação e purificação. Aqui usamos um Composto de captura...

Perfil de metiltransferases e Outros S-Adenosil- L Homocisteína-Proteínas de Ligação de captura por Espectrometria de Massa Compound (CCMS)

O EpiMark 5-HMC e 5-mC Kit de análise podem ser usados ​​para analisar e quantificar 5-metilcitosina e 5-hydroxymethylcytosine dentro de um locus spe específicos. O kit distingue 5 de 5 mC-HMC pela adição de glicose para o grupo hidroxila de 5-HMC através de uma reação enzimática utilizando β-glicosiltransferase (T4-BGT). Quando 5-HMC ocorre no contexto de CCGG, esta modificação converte um site MspI clivável para um site não-clivável.

Alta Sensibilidade de Detecção de 5 hydroxymethylcytosine-in Balb / C Tecido Cerebral

Alcançar um nível de compreensão dos processos celulares de sistemas é uma meta da biologia celular moderna. Descrevemos aqui as estratégias para jornalistas luciferase multiplexação de várias funções celulares de pontos finais para interrogar a função do gene usando genoma escala bibliotecas RNAi.

A plataforma de triagem baseada luciferase diversificadas para interrogar associados ao câncer transdução de sinal em células cultivadas

Descrevemos em detalhes dois protocolos de base química para cultivo de células-tronco embrionárias do mouse. Esse novo método utiliza mecanismos sinérgicos de promover oxidação mediada por Tet (vitamina C) e reprimindo a síntese de novo de 5-metilcitosina (por PD0325901) para manter o DNA hypomethylation e pluripotência das células-tronco embrionárias do mouse.

Um método alternativo de cultura para manter Hypomethylation genômico das células-tronco embrionárias Mouse usando MEK inibidor PD0325901 e vitamina C

Protocatechuato 3,4-dioxygenase (PCD) pode enzimática remover o oxigênio diatômico livre de um sistema aquoso usando seu ácido protocatechuic substrato (PCA). Este protocolo descreve a expressão, purificação e análise de atividade desta enzima de limpeza de oxigênio.

Expressão e purificação do protocatechuato de oxigênio sem nuclease 3,4-Dioxigenase

Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para um método de sequenciamento baseado em LC-MS que pode ser usado como um método direto para sequenciar RNA curto (&lt;35 nt por execução) sem um intermediário de cDNA e como um método geral para sequenciar diferentes modificações de nucleotídeos em um único estudo com precisão de base única.

2D-HELS MS Seq: Um método geral baseado em LC-MS para sequenciamento direto e de novo de misturas de RNA com diferentes modificações de nucleotídeos

As metiltransferases de DNA são potenciais alvos de drogas contra o câncer. Aqui, um protocolo é apresentado para avaliar pequenas moléculas para inibição da DNA metiltransferase. Este ensaio utiliza uma endonuclease para acoplar a metilação do DNA à geração de fluorescência e permite que a atividade enzimática seja monitorada em tempo real.

Ensaio de metilação de DNA acoplado à endonuclease à base de fluorescência contínua para triagem de inibidores da DNA metiltransferase

Um protocolo para a detecção sensível e quantitativa da atividade da topoisomerase 1 usando o ensaio de detecção de atividade enzimática aprimorada do círculo rolante é descrito. O método permite a detecção da atividade da topoisomerase 1 a partir de componentes purificados ou extratos celulares/teciduais. Este protocolo tem amplas aplicações em qualquer campo que envolva a detecção de atividade enzimática.

Detecção Simples e Rápida de Amplificação por Círculo de Rolamento da Atividade da Topoisomerase 1 em Amostras Biológicas Brutas

Aqui, apresentamos uma compilação de ensaios para medir diretamente a função mitocondrial em células de mamíferos, independentemente de sua capacidade de consumir oxigênio molecular.

Ensaios Independentes de Oxigênio para Medir a Função Mitocondrial em Mamíferos

O presente protocolo destaca um método modificado para detectar e quantificar ligações cruzadas DNA-proteína (DPCs) e suas modificações pós-traducionais (MPTs), incluindo ubiquitilação, SUMOilação e ADP-ribosilação induzida por inibidores de topoisomerase e por formaldeído, permitindo assim o estudo da formação e reparo de DPCs e suas MPTs.

Detecção quantitativa de ligações cruzadas DNA-proteína e suas modificações pós-traducionais

Um fluxo de trabalho analítico baseado em cromatografia líquida, espectrometria de mobilidade iônica aprisionada e espectrometria de massa por tempo de voo (LC-TIMS-ToF MS/MS) para alta confiança e análise "bottom-up" altamente reprodutível de modificações e identificação de histonas com base em parâmetros principais (tempo de retenção [TR], seção transversal de colisão [CCS] e relação massa-carga [m/z] precisa).

Triagem de modificação de histona usando cromatografia líquida, espectrometria de mobilidade iônica aprisionada e espectrometria de massa por tempo de voo

Aprenda a purificar a enzima TET2 humana ativa sem marcação usando cromatografia de troca iônica em uma única etapa. Este método permite analisar a atividade enzimática e seus produtos por LC-MS/MS para estudos epigenéticos avançados.

Purificação eficiente e desenvolvimento de ensaio baseado no LC-MS/MS para dez-onze translocação-2 5-metilcitosina dioxigenase

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