Um flexível baixo custo sistema hidropônico para avaliar as respostas de planta para pequenas moléculas em condições estéreis

Um sistema de hidroponia in vitro simples, versátil e de baixo custo foi otimizado com sucesso, permitindo experimentos em larga escala em condições estéreis. Este sistema facilita a aplicação de produtos químicos em solução e sua absorção eficiente pelas raízes para estudos moleculares, bioquímicos e fisiológicos. Demonstramos que esse sistema foi altamente eficiente na obtenção de plântulas homogêneas ao longo do desenvolvimento inicial, bem como na separação de raízes e parte aérea utilizando sementes de arabidopsis thaliana.

Os itens a seguir são necessários para construir o sistema hidropônico e cultivar plantas sob condições estéreis e controladas. etanol a 7%, solução de alvejante a 10%, polissorbato 20, meio MS incluindo vitaminas. MES mono-hidratado, ágar, hidróxido de potássio

Capa de fluxo laminar, placa quente, câmara de crescimento. Caixas plásticas descartáveis, placas de Petri de vidro estéril, fita adesiva, pontas de pipeta estéreis de 200 e 300 microlitros, tesouras, pipeta multicanal de 300 microlitros, pipeta de 200 microlitros, lâmina de bisturi, pinças e racks de ponta de pipeta de 200 microlitros. É crucial que a ponta da pipeta plana tenha uma área a ser preenchida com o meio sólido.

Esterilize os racks de pontas de pipeta sem tampas que serão usados como minitanques na autoclave a 121 graus por 20 minutos. Para evitar contaminação, todos os materiais citados anteriormente foram esterilizados em autoclave. Quando isso não foi possível, como no caso das caixas plásticas descartáveis, os materiais foram limpos com etanol a 7% antes de entrar na capela de fluxo laminar.

Se o exaustor permitir, a luz UV pode ser ligada por 10 minutos antes da montagem do sistema hidropônico. Sele a superfície superior da ponta da pipeta com a fita adesiva. Se possível, deixe-os sob luz ultravioleta por 10 minutos.

Em seguida, adicione 108 microlitros de meio sólido derretido em cada poço usando uma pipeta multicanal. Se você estiver preparando muitos tanques, use uma placa quente para evitar que o meio MS se solidifique. Deixe o meio solidificar completamente, cerca de 30 minutos.

Durante o período de solidificação, a luz UV pode ser ligada. Encha a caixa de pontas completamente com meio de cultura líquido. Garanta o compacto próximo entre meios sólidos e líquidos.

Remova as fitas adesivas da superfície superior da ponta da pipeta e encaixe-a no rack com cuidado. O sistema hidropônico agora está pronto para receber as sementes esterilizadas. A esterilização com alvejante líquido descrita aqui é um método prático para esterilizar sementes.

Em primeiro lugar, coloque 500 sementes de arabidopsis em um microtubo de 1,5 ml. Use quantos microtubos forem necessários de acordo com o número de plantas necessárias para o experimento. Lave as sementes com etanol a 7% por dois minutos com agitação.

Remova o etanol com cuidado. Adicione um ml de solução de alvejante a 10% contendo dois microlitros de detergente polissorbato 20. Agite por cinco minutos.

Remova a solução com cuidado. Por fim, enxágue as sementes com água destilada esterilizada até que todo o resíduo de alvejante seja completamente removido, aproximadamente cinco vezes. Este protocolo é viável para arabidopsis, no entanto, este sistema também pode ser usado para outras espécies vegetais.

Para tanto, o referido procedimento de esterilização deve ser modificado de acordo com a necessidade da espécie. Após a esterilização superficial, as sementes foram imersas em água destilada estéril e estratificadas a quatro graus no escuro por cinco dias para sincronizar a germinação. Corte levemente a extremidade da ponta da pipeta de 200 microlitros com o auxílio de um bisturi estéril.

Pipetar as sementes de arabidopsis no meio de cultura sólido na superfície superior da ponta da pipeta plana. Tome cuidado para que o meio não se solte do plano, caso contrário as sementes ficarão sombreadas e as mudas não crescerão adequadamente. Armazene o maior número possível de mini-tanques dentro de uma caixa de plástico descartável para manter uma alta umidade e o ambiente livre de microorganismos.

Sele a caixa de plástico descartável com fita adesiva. Os sistemas hidropônicos estão agora prontos para entrar na câmara de crescimento. Este sistema hidropônico foi desenvolvido inicialmente para facilitar a administração de produtos químicos às plantas, como compostos marcados com isótopos, que em geral são muito caros para serem aplicados em experimentos de larga escala.

Como prova de conceito, usamos o inibidor competitivo de ATP AZD8055, que visa especificamente o local de ligação do ATP da proteína quinase alvo da rapamicina. A TOR quinase é um importante regulador que integra a detecção de nutrientes e a sinalização de energia para promover a proliferação e o crescimento celular. A fim de avaliar as respostas primárias da inibição do TOR mediada pelo AZD, sementes de arabidopsis foram cultivadas hidroponicamente até o estágio de desenvolvimento desejado sob um período fotográfico de 12 horas.

Meio fresco contendo dois AZD micromolar ou 0,05% DMSO como controle foram recolocados nos tanques hidropônicos no final da noite. As mudas foram colhidas em diferentes momentos após o tratamento, separadas em raízes e brotos congelados em nitrogênio líquido, moídos em um pó fino e armazenados a 80 graus negativos até o uso. O padrão de fosforilação da proteína ribossômica S6 quinase, RPS6, um dos alvos bem conhecidos da via TOR.

O immunoblotting mostra a quantidade de RPS6 total e fosforilada nas raízes, gráfico A, e brotos, gráfico B. A repressão da fosforilação na presença de ADZ855 ocorreu logo 30 minutos após o tratamento medicamentoso em ambas as raízes e brotos, demonstrando que, nas condições experimentais utilizadas, o ADZ também se mostrou um potente inibidor de TOR que reprime rapidamente sua atividade quinase. Linhagens transgênicas de arabidopse com expressão reduzida do gene TOR ou componentes do complexo TOR apresentam um fenótipo claro de excesso de amido. A análise qualitativa do amido usando a solução de Lugol revela o padrão esperado de acúmulo e degradação do amido durante o ciclo.

As mudas que não receberam aplicação do MSO ou AZD855 não apresentaram maior acúmulo de amido em suas folhas no final da noite, e o acúmulo de amido nas plantas controle, o MSO, foi consistente com a literatura. Além disso, as plantas tratadas com AZD apresentaram maior quantidade de amido remanescente no final da noite quando comparadas às mudas controle. Esses resultados indicam a utilidade do sistema hidropônico proposto no cultivo de mudas mimetizando condições fisiológicas.

O amido se acumula nas folhas durante o dia e é remobilizado durante a noite para sustentar as atividades metabólicas. Em condições normais, apenas uma pequena fração do amido, entre 5 e 10% da quantidade total após o final do dia, permanece no final da noite. Esses resultados são testados que o fenótipo de amidos observado sob repressão de TOR ocorre em todo o ciclo.

Plantas cultivadas hidroponicamente foram comparadas com mudas cultivadas em substrato hortícola sob condições climáticas muito semelhantes quanto ao nível de expressão do ácido abscísico com fator de ligação ao elemento responsivo três, gene ABF3, mostrado na figura 5-A. A expressão de ABF3 se correlaciona diretamente com os níveis internos de ABA, uma classe de hormônios amplamente conhecida como marcador devido ao seu papel em múltiplas respostas abióticas ao estresse. Embora as plantas cultivadas hidroponicamente tenham apresentado um aumento significativo na expressão de ABF3 quando comparadas às plantas cultivadas em solo, os níveis de expressão de asparagina sintetase um ASN1 não foram afetados pelos tratamentos MSO ou AZD mostrados na figura 5-B.

No entanto, a expressão da trealose fosfato sintase cinco, TPS5, mais aumento significativo após oito horas de repressão do TOR. ASN1 e TPS5 respondem a níveis baixos e altos de açúcar, respectivamente, sugerindo que essas plantas não foram experimentadas em estresse genético. Temos conseguido usar este sistema para avaliar a aplicação de pequenas moléculas em plantas.

Em resumo, este sistema hidropônico possui muitas vantagens porque é muito rápido e fácil de montar, e tem um baixo custo, pois os principais componentes são baratos e podem ser amplamente reutilizados. Além disso, este sistema é versátil, permitindo o estudo de plântulas intactas ou distinções ao longo do desenvolvimento das plantas, e é altamente escalável, permitindo o cultivo de um grande número de plantas em uma área muito pequena.