Name: Uma tela de 2-híbrido de levedura em lote para comparar as interações da proteína (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-06T14:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 23 s
Description: Aprenda a realizar telas de 2-híbridos de levedura em lote para comparar perfis de interação proteica usando deep sequencing. Este método permite identificar interações diferenciais relevantes para processos moleculares e celulares.

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Agradecemos o pessoal dentro do Instituto de genética humana para sequenciamento e preparação de biblioteca NGS. Agradecemos Einat Snir por sua experiência na preparação de fragmentos de biblioteca genômica para a biblioteca do plasmídeo Y2H feita aqui. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health: R21 NIH EB021870-01A1 e pelo NSF Grant de projeto de pesquisa: 1517110.

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<li>Bruckner, A., Polge, C., Lentze, N., Auerbach, D., Schlattner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+two-hybrid%2C+a+powerful+tool+for+systems+biology%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">Yeast two-hybrid, a powerful tool for systems biology.</a> International Journal of Molecular Sciences. 10 (6), 2763-2788 (2009).</li>
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<li>Rajagopala, S. V., Hughes, K. T., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benchmarking+yeast+two-hybrid+systems+using+the+interactions+of+bacterial+motility+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Benchmarking yeast two-hybrid systems using the interactions of bacterial motility proteins.</a> Proteomics. 9 (23), 5296-5302 (2009).</li>
<li>James, P., Halladay, J., Craig, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+libraries+and+a+host+strain+designed+for+highly+efficient+two-hybrid+selection+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast.</a> Genetics. 144 (4), 1425-1436 (1996).</li>
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<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+USA%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences USA. 76 (9), 4350-4354 (1979).</li>
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<li>Harper, J. W., Adami, G. R., Wei, N., Keyomarsi, K., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+p21+Cdk-interacting+protein+Cip1+is+a+potent+inhibitor+of+G1+cyclin-dependent+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The p21 Cdk-interacting protein Cip1 is a potent inhibitor of G1 cyclin-dependent kinases.</a> Cell. 75 (4), 805-816 (1993).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a divulgar

Aqui nós fornecemos um guia de como realizar ensaios Y2H em lote usando métodos otimizados. Existem alguns passos críticos no procedimento para ajudar a garantir que a população de levedura que devem ser colocada sob seleção é representante da biblioteca de partida e que suficiente da população inicial de fermento é usado para se submeter a seleção para limitar a variabilidade . Importante, estes parâmetros são relativamente fáceis de alcançar ao lado de adaptar os métodos e materiais para um ensaio de Y2H tradicional, t...

Um entendimento completo dos processos biológicos de célula depende de encontrar as redes de interação de proteínas que fundamentam seus mecanismos moleculares. Uma abordagem para identificar as interações da proteína é ensaio fermento 2-híbrido (Y2H), que trabalha pela montagem de um fator de transcrição quimérico funcionamento uma vez que os dois domínios da proteína de interesse ligam para um outro1. Uma tela típica de Y2H é realizada através da criação de uma população de levedura que abriga tanto uma biblioteca de plasmídeos codificação interação proteínas fundidas a um ativador transcricional (ex., 'presas' a proteína de fusão) e um determinado 'isca' plasmídeo composto da proteína de interesse fundido a um domínio de ligação do DNA (por exemplo, o domínio de Gal4 DNA-ligando que vincula-se à sequência de ativação Gal4-upstream). Uma das principais vantagens da abordagem Y2H é que é relativamente fácil e barata para realizar em um laboratório típico equipada para trabalho rotineiro de biológica molecular2. No entanto, quando tradicionalmente realizada, um usuário amostras colônias individuais que surgem em seleção para uma interação positiva de Y2H. Isto limita severamente o número de clones 'presas' biblioteca que podem ser pesquisados. Este problema é agravado quando a abundância de uma particular interação presa é muito elevada em relação às outras, diminuindo a chance de detecção de interação de plasmídeos de rapina baixa abundância.
Uma solução para usando o princípio de Y2H em uma cobertura abrangente da proteoma é o uso de uma abordagem de matriz formatada no qual uma matriz contendo plasmídeos conhecido presas individuais pode ser interrogada digitalmente. No entanto, essa abordagem exige uma infra-estrutura que não é prontamente acessível ou rentável para os investigadores que estão interessados em definir a interactome de um pequeno número de proteínas ou domínios3. Além disso, bibliotecas de rapina muito complexo que podem codificar vários fragmentos de interação de proteínas que expandir o tamanho do como matrizes matriz para tamanhos impraticáveis. Uma alternativa é realizar ensaios com bibliotecas complexas em lotes e avaliar a presença de interação clones usando sequenciamento de elevado-throughput maciço paralelo4. Isto pode ser aplicado para ensaiar a presença de plasmídeos de rapina que surgem em várias colônias usando um típico Y2H formatado abordagem em qual fermento habitação um par de interação de proteínas da fusão de células podem crescer em uma placa de5,6. Esta ideia geral pode ser acentuada para aumentar a consulta de ambos várias iscas e presas componentes ao mesmo tempo7,8.
Ainda assim, muitas investigações exigem que um mais fácil ainda mais focado esforço em apenas algumas proteínas 'iscas' e podem se beneficiar mais de uma consulta exaustiva e semi-quantitativa de uma biblioteca de rapina complexo único. Temos desenvolvido e validado uma abordagem para realizar estudos de interação de proteínas em larga escala usando um princípio de Y2H em formato de lote4. Isto usa a taxa de expansão de um plasmídeo presa particular como um proxy para a força relativa da interação de Y2H9. Sequenciamento profundo de todos os plasmídeos dentro de uma população submetida ao crescimento normal ou condições de crescimento seletivo produz um mapa completo de clones que geram interações de Y2H forte e fracas. O repertório de interactianos pode ser obtido e comparado diretamente através de múltiplos isca plasmídeos. O fluxo de trabalho resultante denominado DEEPN (enriquecimento dinâmico para avaliação de redes de proteínas), portanto, pode ser usado para identificar interactomes diferencial das bibliotecas de rapina mesmo para identificar proteínas, permitindo a comparação entre uma proteína vs outro.
Aqui, demonstramos DEEPN e introduzir melhorias nos métodos laboratoriais que facilitam a sua utilização, que são descritos na Figura 1. Melhorias significativas incluem:
Geração de populações de presas fermento. Um dos principais requisitos de DEEPN está gerando populações de levedura com diferentes isca plasmídeos que têm a mesma distribuição das bibliotecas de rapina do plasmídeo. Populações de equivalente de linha de base da biblioteca do plasmídeo presa são essenciais para fazer comparações precisas entre o interactomes de iscas diferentes. Isto é melhor alcançado quando um plasmídeo de biblioteca já está alojado em uma população de levedura haploide e entrando um plasmídeo isco dado que a população é alcançado pelo acasalamento para produzir um diploides. Aqui, nós fornecemos um guia claro em como fazer tais populações usando bibliotecas comerciais alojadas em leveduras haploides. Embora não tenhamos encontrado métodos que geram um número elevado de diploides, a eficiência global de acasalamento destas cepas de leveduras contendo biblioteca comercial foi baixa. Portanto, nós construímos uma nova tensão que pode abrigar presas bibliotecas que rende muito mais diploides por reação de acasalamento.
Novo conjunto de isca plasmídeos. Muitos plasmídeos atuais que expressam proteínas da fusão 'isca' compostas da proteína de interesse e um domínio de ligação a DNA são baseados em 2µ, permitindo-lhes ampliar seu número de cópia. Este número de cópia pode ser bastante variável na população e levar a variabilidade na resposta transcricional de Y2H. Isto por sua vez poderia inclinar a capacidade de medir a força de uma interação de proteína dada baseada a resposta de crescimento das células de seleção. Isto pode ser parcialmente endereço usando um plasmídeo cópia baixa, alguns dos quais têm sido descritos anteriormente como o comercialmente disponível pDEST3210. Nós construímos um nova isca do plasmídeo (pTEF-GBD) que produz proteínas da fusão Gal4-DNA-ligando domínio dentro de um plasmídeo de cópia baixa baseada em Centrómero TRP1 carreg o gene de resistência de Kanr que também permite a clonagem de fragmentos de isca contra a corrente e a jusante do domínio Gal4 DNA-ligando.
Biblioteca de fragmento de novo high-density Y2H. Temos construído um plasmídeo novo para bibliotecas de rapina Y2H casa e usou para construir uma biblioteca de Y2H altamente complexa feita de distorcida aleatoriamente fragmentos de DNA genômico de Saccharomyces cerevisiae. Análise de sequência mostrou que esta biblioteca tinha mais 1 milhão de elementos diferentes, muito mais complexos do que descritas anteriormente fermento Y2H genômica plasmídeo bibliotecas11. Com essa nova biblioteca, fomos capazes de mostrar que o fluxo de trabalho do DEEPN é robusto o suficiente para acomodar o complexas bibliotecas com muitos plasmídeos diferentes de uma forma que é confiável e reprodutível.

<table><tbody><tr>Plataforma de <td>sequenciamento profundo</td> <td>Illumina HiSeq 4000</td><td>Illumina</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos monoclonais anti-HA</td><td>Biolegend</td><td>901514</td><td>Anticorpo primário para detectar a expressão de HA em construções pGal4AD</td></tr><tr><td>Anticorpos anti-myc policlonais</td><td>QED Biosciences Inc</td><td>18826</td><td>Anticorpo primário para detectar a expressão de MYC em construções pTEF-GBD</td></tr><tr><td>NarI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0191S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>New England BioLabs</td><td>R3236S</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>New England BioLabs</td><td>R0146S</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenoglicol 3350, pó</td><td>J.T. Baker</td><td>U2211-08</td><td></td></tr><tr><td>DNA de esperma de salmão</td><td>Trevigen, Inc vendido pela Fisher Scientific</td><td>50-948-286</td><td>DNA transportador para transformação de levedura seção 3.2.1.</td></tr>Produtos <tr><td>de pesquisa de</td> <td>monossulfato de canamicina</td> International <td>K22000</td><td></td></tr><tr><td>LE Agarose</td><td>GeneMate</td><td>E-3120-500</td><td>usado para fazer géis de agarose de DNA</td></tr><tr>Produtos <td>de pesquisa de</td><td>cloreto de sódio</td> International <td>S23025</td><td></td></tr><tr><td>Produtos de pesquisa de</td><td>triptona</td> internacional <td>T60060</td><td></td></tr><tr><td>Produtos de</td><td></td> <td>pesquisa de D-SorbitolS23080</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de Lítio Di-hidratado</td><td>MP Biomedicals</td><td>155256</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de Cálcio</td><td>ThermoFisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>EDTA Sal de Sódio</td><td>Research Products International</td><td>E57020</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de Levedura em Pó</td><td>Research Products International</td><td>Y20020</td><td></td></tr><tr><td>Base de Nitrogênio de Levedura (sulfato de amônio) sem aminoácidos</td><td>Research Products International</td><td>Y20040</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Trp-Leu+40ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS0789</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Trp-Leu-His+40ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS1169</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Leu-Met</td><td>Formedium</td><td>DCS0549</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Trp-Met</td><td>Bio 101, Inc</td><td>4520-922</td><td></td></tr><tr><td>L-Metionina</td><td>Formedium</td><td>DOC0168</td><td></td></tr><tr><td>Adenine</td><td>Research Products International</td><td>A11500</td><td></td></tr><tr><td>D- (+) -Glucose</td><td>Research Products International</td><td>G32045</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD</td><td>214010</td><td>usado para fazer placas de mídia na seção 1</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Research Products International</td><td>P20240</td><td></td></tr><tr><td>3-amino-1,2,4 Triazole</td><td>Sigma</td><td>A8056</td><td></td></tr><tr><td>2- Mercaptoehanol (BME)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Zymolyase 100T</td><td>USBiological</td><td>Z1004</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio dibásico</td><td>Sigma</td><td>P8281</td><td></td></tr><tr><td>Fenol: Clorofórmio: IAA</td><td>Ambion</td><td>AM9732</td><td></td></tr><tr><td>Acetato de amônio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>238074</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>Decon Laboratories, INC</td><td>2716</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>ThermoFisher</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>Research Products International</td><td>U20200</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Research Products International</td><td>L22010</td><td></td></tr><tr><td>glicerol</td><td>Sigma</td><td>Aldrich G5516</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Gibco</td><td>15506-017</td><td></td></tr><tr><td>azul de bromofenol</td><td>Amresco</td><td>449</td><td></td></tr><tr><td>Kit de clonagem de montagem Gibson</td><td>New England Biolabs</td><td>E5510S</td><td>Método de montagem rápida para clonagem de plasmídeos na seção 2</td></tr><tr><td>NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix</td><td>New England Biolabs</td><td>M0541S</td><td>Usado para amplificação de produtos para montagem Gibson na seção 2.3, bem como preparação de amostras para sequenciamento profundo DEEPN na seção 6.2.1</td></tr><tr><td>Brometo de etídio</td><td>Amresco</td><td>0492-5G</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purificação de PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Usado para purificação de produtos de PCR na seção 6.2.3</td></tr><tr><td>Kit de extração de gel de DNA Qiaquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Usado para purificação de pTEF-GBD digerido na seção 2.1</td></tr><tr><td>Kit KAPA Hyper Prep Kit</td> de preparação <td>KAPA Biosystems</td><td>KK8500</td><td>para sequenciamento profundo</td></tr><tr><td>http://www.jcat.de</td><td></td><td></td> de<td>otimização de códons</td></tr><tr><td>Otimização de códons</td><td>https://www.idtdna.com/CodonOpt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>gBlocks</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>Fragmentos de DNA usados para clonagem na Seção 2.2</td></tr><tr><td>Strings Fragmentos de</td> DNA <td>Thermofisher</td><td></td><td>usados para clonagem na Seção 2.2</td></tr><tr><td>Kit de mini-preparação de DNA de plasmídeo GenCatch</td><td>EPOCH Life Sciences</td><td></td><td>Usado para preparar quantidades de DNA na Seção 2.3</td></tr><tr><td>Covaris E220</td><td>Covaris</td><td></td><td>ultra-sonicator de alto desempenho na seção 7</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5'- CGGTCTT CAATTTCTCAAGTTTCAG -3'</td><td>Tecnologias integradas de DNA ou Thermofisher</td><td></td><td>usadas para amplificação de pcr e sequenciamento de 5 'inserir pTEF-GBD durante a construção do plasmídeo</td></tr>, <tr><td>oligo nucelotide 5'-GAGTAACG ACATTCCCAGTTGTTC-3'</td><td>Tecnologias integradas de DNA ou Thermofisher</td><td></td><td>usadas para amplificação e sequenciamento de pcr 5 'inserir pTEF-GBD durante a construção do plasmídeo</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5'-CACCGTAT TTCTGCCACCTCTTCC-3'</td><td>Tecnologias integradas de DNA ou Thermofisher</td><td></td><td>usadas para amplificação e sequenciamento de pcr 3 'inserir pTEF-GBD durante a construção do plasmídeo</td></tr><tr><td>oligo nucelotide 5'-GCAACCGC ACTATTTGGAGCGCTG-3'</td><td>Tecnologias integradas de DNA ou Thermofisher</td><td></td><td>usadas para amplificação de pcr e sequenciamento de 3 'inserir pTEF-GBD durante a construção do plasmídeo</td></tr><tr><td>oligonucleotídeo 5'-GTTCCGATG CCTCTGCGAGTG-3'</td><td>Tecnologias integradas de DNA ou Thermofisher</td><td></td><td>5 'Pimer usado para amplificação de inserção de oligonucelotídeo pGAL4AD</td></tr><tr><td>5'-GCACATGCT AGCGTCAAATACC-3 '</td><td>Tecnologias integradas de DNA ou Thermofisher</td><td></td><td>3' Pimer usado para amplificação de inserção de oligonucelotídeo pGAL4AD</td></tr><tr><td>5'-ACCCAAGCA GTGGTATCAACG-3'</td><td>Integrated DNA Technologies ou Thermofisher</td><td></td><td>5' Pimer usado para amplificação de inserção de oligonucelotídeo pGADT7</td></tr><tr><td>5'- TATTTAGA AGTGTCAACAACGTA -3'</td><td>Integrated DNA Technologies ou Thermofisher</td><td></td><td>3 'Pimer usado para amplificação de inserção de cepa de levedura pGADT7</td></tr><tr><td>PJ69-4A MatA</td><td>http://depts.washington.edu/yeastrc/ James P, Halladay J, Craig EA: Bibliotecas Genômicas e uma cepa hospedeira projetada para seleção de dois híbridos altamente eficiente em leveduras. GENÉTICA 1996 144:1425-1436</td><td></td><td>MATA leu2-3,112 ura3-52 trp1-901 his3-200 gal4D, gal80D, GAL-ADE2 lys2::GAL1-HIS3 met2::GAL7</td></tr><tr><td>pTEF-GBD</td><td>Dr. Robert Piper Lab</td><td></td><td>Gal4-DNA binding doimain expression plasmid</td></tr><tr><td>pGal4AD (pPL6343)</td><td>Dr. Robert Piper Lab</td><td></td><td>Gal4-activation domain expression plasmid</td></tr><tr><td>100 mm petri plates</td><td>Kord-Vallmark vendido pela VWR</td><td>2900</td><td></td></tr><tr><td>Frasco Erlenmeyer PYREX de 125 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63270</td><td></td></tr><tr><td>250 mL PYREX Frasco Erlenmeyer</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63271</td><td></td></tr><tr><td>1.000 mL PYREX Frasco Erlenmeyer</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63274</td><td></td></tr><tr><td>2.000 mL PYREX Frasco Erlenmeyer</td><td>Fisher Scientific</td><td>S63275</td><td></td></tr><tr><td>20 X 150 mm Tubo de Cultura Descartável</td><td>Thermofisher</td><td>14-961-33</td><td></td></tr><tr><td>pipet-aid</td><td>Drummond</td><td>4-000-100</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica de 5 mL</td><td>Denville</td><td>P7127</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica de 10 mL</td><td>Denville</td><td>P7128</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta sorológica de 25 mL</td><td>Denville</td><td>P7129</td><td></td></tr><tr><td>1.000 mL PYREX Griffin Beaker</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-540P</td><td></td></tr><tr><td>1.000 mL PYREX Garrafa de Armazenamento de Mídia Reutilizável</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-414-1D</td><td></td></tr><tr><td>cilindro graduado de 1.000 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-572-6G</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax 190</td><td>Dispositivos</td><td></td> Moleculares <td>usados para medir a Densidade Óptica das células</td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-2000</td><td>Espectrofotômetro usado para quantificar a quantidade de DNA</td></tr><tr><td>UV Eletrônico transiluminador</td><td>Ultra Lum</td><td>MEB 20</td><td>usado para visualizar DNA em um gel de agarose de brometo de etídio</td></tr><tr><td>P1000 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123602G</td><td></td></tr><tr><td>P200 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123601G</td><td></td></tr><tr><td>P20 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F123600G</td><td></td></tr><tr><td>P10 Gilson PIPETMAN</td><td>Fisher Scientific</td><td>F144802G</td><td></td></tr><tr><td>1250 &micro; L Ponteiras de Pipeta de Baixa Retenção</td><td>GeneMate</td><td>P-1236-1250</td><td></td></tr><tr><td>200 &micro; Ponteiras de Pipeta de Retenção LLow</td><td>VWR</td><td>10017-044</td><td></td></tr><tr><td>10 &micro; L XL Pontas de pipeta de baixa retenção</td><td>VWR</td><td>10017-042</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 50 mL</td><td>VWR</td><td>490001-627</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico de 15 mL</td><td>VWR</td><td>490001-621</td><td></td></tr><tr><td>raspador de células</td><td>Denville Scientific</td><td>TC9310</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fluka Analytical</td><td>318949-1L</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>J.T. Baker</td><td>5674-02</td><td></td></tr><tr><td>Aplicadores de madeira</td><td>Solon Care</td><td>55900</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrífuga Eppendorf 5424</td><td>Microcentrífuga</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-400-005</td></tr><tr><td>Sorvall ST16R</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75004381</td><td>centrífuga de bancada</td></tr><tr><td>Amersham ECL Rabbit IgG, Ab inteiro ligado a HRP (de burro)</td> <td>GE Healthcare</td><td>NA934-1ML</td><td>Anticorpo Secundário</td></tr><tr><td>Amersham ECL Mouse IgG, Ab inteiro ligado a HRP (de ovelhas)</td> <td>GE Healthcare</td><td>NA931-1ML</td><td>Anticorpo Secundário</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico Substrato Quimioluminescente</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34080</td><td>Solução de detecção de ECL</td></tr><tr><td>Incubadora Isotemp Incubadora</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Incubadora</td></tr><tr><td>Mutitron 2</td><td>Incubadora de agitação INFORS HT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isotemp Digital-Control Banho-maria Modelo 205</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>Biblioteca</td></tr> de <tr><td>cDNA de camundongo Y2H em Y187 (pan tissue)</td><td>Clontech</td><td>630482</td><td>biblioteca de cDNA disponível comercialmente</td></tr><tr><td>Biblioteca de cDNA de camundongo Y2H em Y187 (cérebro de camundongo)</td><td>Clontech</td><td>630488</td><td>disponível comercialmente cDNA Library</td></tr><tr><td>pGADT7 AD Vector</td><td>Clontech</td><td>630442</td><td>vetor AD disponível comercialmente que abriga muitas bibliotecas de cDNA</td></tr><tr><td>pGBKT7 DNA-BD Vector Clontech</td><td></td><td>630443</td><td>DNA-BD disponível comercialmente Vector</td></tr><tr><td>Biolase DNA polimerase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21042</td><td>DNA polimerase usado para a seção 2.4</td></tr><tr><td>GeneMate GCL-60 Termociclador</td><td>BioExpress</td><td>P-6050-60</td><td>máquina de pcr</td></tr><tr><td>TempAssure 0,5 mL PCR tubos</td><td>EUA Scientific</td><td>1405-8100</td><td></td></tr></tbody></table>

uma tela de 2-híbrido de levedura em lote para comparar as interações da proteína

A Yeast 2-Hybrid Screen in Batch to Compare Protein Interactions

Triagem para interações da proteína-proteína usando o ensaio de 2-híbrido de levedura tem sido uma ferramenta eficaz, mas seu uso foi em grande parte limitado à descoberta de interactianos de alta afinidade que são altamente enriquecido na biblioteca dos candidatos interagindo. Em um formato tradicional, o ensaio 2-híbrido de levedura pode render muitas colônias para analisar quando conduzido no rigor baixa onde os interactianos de baixa afinidade podem ser encontrados. Além disso, sem uma interrogação abrangente e completa da mesma biblioteca contra diferentes isca plasmídeos, uma análise comparativa não pode ser alcançada. Embora alguns destes problemas podem ser abordados usando bibliotecas de matriz presa, o custo e a infra-estrutura necessária para operar essas telas podem ser proibitivos. Como alternativa, adaptámos o ensaio 2-híbrido de levedura para descobrir simultaneamente dezenas de transiente e interações proteína estático dentro de uma única tela utilizando uma estratégia denominado DEEPN (enriquecimento dinâmico para avaliação de redes de proteínas), que incorpora o sequenciamento de DNA do elevado-throughput e computação para acompanhar a evolução de uma população de plasmídeos que codificam parceiros interagindo. Aqui, descrevemos reagentes personalizados e protocolos que permitem que uma tela DEEPN a ser executado de modo fácil e econômico.

O ensaio de Y2H tem sido amplamente utilizado para encontrar interações da proteína: proteína e várias adaptações e sistemas foram desenvolvidos. Na maior parte, as mesmas considerações que ajudam a garantir o sucesso com estas abordagens anteriores são importantes para DEEPN. Alguns dos pontos de referência importantes incluem: garantindo a expressão do domínio de ligação a DNA proteínas da fusão, garantindo um baixo fundo de espúrias + seu crescimento nos diploides que contém a isca de ...

Processamento em lote de telas 2-híbrido de levedura permite a comparação direta dos perfis de interação de várias proteínas de isca com um conjunto altamente complexo de proteínas da fusão de rapina. Aqui, descrevemos como implementar sua utilização para tais telas, novos reagentes e métodos refinados.

Uma tela de 2-híbrido de levedura em lote para comparar as interações da proteína

Screening for protein-protein interactions using the yeast 2-hybrid assay has long been an effective tool, but its use has largely been limited to the ...

Este método usa o princípio do sistema híbrido 2-levedura em ambas as populações para identificar interações proteína-proteína que respondem a perguntas-chave sobre uma variedade de processos moleculares e celulares. Essa técnica aproveita o sequenciamento profundo para ver as interações de uma proteína em relação a outra. Uma vez que essa abordagem é voltada para fazer comparações paralelas, ela pode identificar conjuntos de proteínas que interagem com uma proteína versus outra ou diferentes confirmações da mesma proteína ou durante a tipagem de uma versão mutante causadora de doença, para revelar interactomas diferenciais.Um novo plasmídeo de isca híbrida 2 de levedura pTEF-GBD foi construído para este procedimento, conforme descrito no protocolo de texto. Este plasmídeo produz proteínas de fusão de domínio de ligação ao DNA Gal4 dentro de um plasmídeo de baixa cópia baseado em centrômero TRP1 carregando o gene de resistência à canamicina que também permite a clonagem de fragmentos de isca a montante e a jusante do domínio de ligação ao DNA Gal4. Este plasmídeo de isca foi usado para transformar a levedura MATa, e a expressão das proteínas de fusão da isca Gal4 foi verificada por immunoblotting com anticorpos anti-MIC.Além disso, foi criada uma nova biblioteca híbrida de levedura 2 no vetor de plasmídeo de presa PGAL4 AD simplificado. O DNA genômico foi fragmentado por cisalhamento, tamanho selecionado, modificado com adaptadores e inserido em PGAL4-AD para criar a biblioteca híbrida de levedura saxairtab 2. Para iniciar o procedimento de criação de populações de leveduras com bibliotecas de iscas e presas, inocule três culturas de mililitros de cada um dos transformantes de levedura MATa carregando o outro de viagem contendo plasmídeos de isca e CSM menos meio de viagem.Incluir duas culturas separadas, contendo apenas o plasmídeo vector, para servirem de controlo processual. Incubar as culturas a 30 graus Celsius e 200 rpm por seis horas. Em seguida, diluir cada cultura em uma cultura de 25 mililitros em um frasco Erlenmeyer estéril e incubar durante a noite.Descongele um vil congelado de células alfa MAT contendo a biblioteca de presas portadoras de lu2 à temperatura ambiente. Use todo o vil descongelado de células para inocular 125 mililitros de CSM menos lu menos meio encontrado em um frasco Erlenmeyer estéril. Cultive a cultura a 30 graus Celsius e 200 rpm durante a noite.No dia seguinte, após confirmar que o OD600 das culturas transformantes da esteira noturna varia entre 1,0 a 1,5, transfira as culturas para tubos cônicos de 50 mililitros e centrifugue 21 equivalentes OD 600 de cada cultura a 4.696 vezes g em temperatura ambiente por cinco minutos. Ressuspenda cada pellet de células de esteira a em 10 mililitros de água estéril, transfira a suspensão para um novo tubo cônico de 50 mililitros e centrifugue a 4.696 vezes g em temperatura ambiente por cinco minutos. Usando uma pipeta, remova suavemente o sobrenadante, sem romper as células peletizadas, e ressuspenda o pellet em quatro mililitros de meio YPDA tamponado a pH 3,7.Para cada 10 reações de acasalamento desejadas, chumbinho 39 OD 600 equivalentes da cepa mat alpha carregando os plasmídeos da biblioteca em um tubo cônico de 50 mililitros. Ressuspenda as células alfa em 10 mililitros de água estéril e repela em um novo tubo cônico de 50 mililitros a 4.696 vezes g em temperatura ambiente por cinco minutos. Usando uma pipeta, remova suavemente o sobrenadante, sem romper as células peletizadas, e ressuspenda o pellet em 10 mililitros de meio YPDA tamponado a pH 3,7.Para configurar cada reação de acoplamento, adicione o seguinte a um novo tubo cônico de 50 mililitros: Um mililitro de células transformadas em MAT-A, um mililitro de células contendo a biblioteca MAT-alfa e um mililitro de YPDA tamponado em pH 3,7. Incube a 30 graus Celsius com agitação orbital suave por 90 minutos. Após 90 minutos, centrifugue as células a 4.696 vezes g à temperatura ambiente durante cinco minutos.Remova o sobrenadante e ressuspenda o pellet em dois mililitros de um a um YPDA-YPD tamponado. Coloque todos os dois mililitros de células em uma placa YPD de 100 mililitros e incube a 30 graus Celsius por aproximadamente 20 horas. Para colher as células, pipete de dois a três mililitros de CSM menos lu menos meio de viagem em cada placa YPD e use um raspador de células para desalojar as células.Pipetar as células desalojadas para um tubo cónico de 50 mililitros. Enxágue a placa quatro a cinco vezes com dois a três mililitros de CSM menos lu menos meio de viagem usando uma pipeta de 1.000 microlitros para pipetar o meio e ejetando-o suavemente pela superfície da placa YPD. Centrifugue as células a 4.696 vezes g à temperatura ambiente durante cinco minutos.Descarte o sobrenadante de cada tubo cônico e ressuspenda as células em 40 mililitros de CSM menos lu menos meio de viagem pipetando para cima e para baixo. Para estimar o número de células diplóides formadas, dilua quatro microlitros da mistura diplóide em 200 microlitros e 2.000 microlitros de CSM menos lu menos meio de viagem, respectivamente. Colocar 200 microlitros de cada diluição em uma placa CSM menos lu menos trip para representar uma diluição total de um a 10.000 e de um a 100.000 do estoque de diplóides colhidos.Incube as placas a 30 graus Celsius por 36 a 40 horas. Use imediatamente o restante de cada 40 mililitros de ressuspensão celular para inocular 500 mililitros de CSM menos lu menos meio de viagem em um frasco Erlenmeyer de um litro. Meça o OD 600 de cada cultura.Incube esses frascos a 30 graus Celsius, com agitação a 180 rpm, até atingirem a saturação, o que normalmente leva de 36 a 40 horas. Monitore o crescimento celular em 24 horas e 36 horas medindo o OD 600. Antes de continuar com o procedimento, confirme a eficiência de acasalamento das duas cepas de levedura.É necessário um número mínimo de 200 colónias na placa de diluição de uma a 10 000. Quando as culturas atingirem a saturação, remover uma aloquada de 20 ml de cada cultura com uma pipeta e inocular dois balões de Erlenmeyer. Um frasco contendo 750 mililitros de CSM menos lu menos meio de viagem e um segundo frasco contendo 750 mililitros de CSM menos lu menos viagem menos seu meio.Com o nível mais baixo de três amino 124 triasol que elimina o fundo, determinado anteriormente conforme descrito no protocolo de texto. Misture bem as novas culturas girando. Depois de medir o OD 600 inicial, incubar as culturas a 30 graus Celsius, agitando a 180 rpm, até a saturação, que normalmente ocorre dentro de 24 horas para a cultura CSM menos lu menos trip não selecionada, mas pode levar mais de 70 horas para culturas sob seleção para interações híbridas de levedura 2.Quando as culturas atingirem a saturação, remova 11 mililitros de cada cultura com pipeta e sedimente as células com um centrifugação de cinco minutos a 4.696 vezes g à temperatura ambiente. Descarte o sobrenadante e prossiga com a extração de DNA conforme demonstrado na próxima seção. Para iniciar o procedimento de extração de DNA, use uma pipeta para ressuspender cada pellet celular preparado anteriormente em 500 microlitros de tampão TE forte.Transfira para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e adicione 10 microlitros de caldo de zimolay a cada tubo. Em uma capela de exaustão, adicione três microlitros de etanol beta marketol a cada tubo e misture bem. Incubar na incubadora de 37 graus Celsius por 24 a 36 horas.Em seguida, extrair as amostras duas vezes com 500 microlitros de álcool isolaymal fenol clorofórmio conforme descrito no protocolo de texto. Adicione sete microlitros de cloreto de sódio de quatro molares e 900 microlitros de gelado, 100% de etanol e misture por inversão. Sedimentar o DNA girando em uma microcentrífuga a 21, 130 vezes g por 10 minutos à temperatura ambiente.Descarte o sobrenadante pipetando e lave cada pellet três vezes com 900 microlitros de etanol a 70%. Sedimentar o ADN centrifugando a 21, 130 vezes g durante dois minutos. Depois de remover o etanol residual, seque os pellets a 42 graus Celsius por sete minutos.Ressuspenda cada pellet em 120 microlitros de TE forte 0,1x em banho-maria a 37 graus Celsius por 90 minutos. Pipete 60 microlitros do DNA extraído em um tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 mililitro. Adicione 120 microlitros de TE forte e 3,5 microlitros de caldo RN ace A, agite para misturar e incube a 37 graus Celsius por uma hora.Adicione sete microlitros de acitato de amônio de cinco molares e 900 microlitros de gelado, 100% de etanol a cada tubo. Misture por inversão e sedimente o DNA, conforme demonstrado anteriormente. Ressuspenda o DNA tratado com RNace-A em 55 microlitros de TE forte 0,1x em banho-maria a 37 graus Celsius por 90 minutos.Quantifique o DNA por absorbância a 260 nanômetros. O próximo passo é realizar PCR nas inserções de CDNA. Realize duas reações de PCR de 50 microlitros por amostra de DNA.Para cada reação, adicione água, cinco microgramas de amostra de DNA, 25 picamoles de cada primer direto e reverso correspondente ao plasmídeo da biblioteca de presas e 25 microlitros de master mix de PCR 2x de alta fidelidade. Amplifique as reações com este programa. Uma desnaturação de 30 segundos a 98 graus Celsius, 25 ciclos de D-natrina a 98 graus Celsius por 10 segundos, anealing a 55 graus Celsius por 30 segundos e tempos de extensão de três minutos a 72 graus Celsius, seguidos por uma incubação de cinco minutos a 72 graus Celsius.Analise cada reação de PCR por eletroforese de resfriamento de 1% de DNA com um gel contendo bromo de ácido e visualize o gel por transiluminação UV. Amostras sem seleção mostram um esfregaço generalizado de DNA, mas após a seleção bandas individuais podem ser discernidas. Combine amostras de PCR duplicadas e purifique usando um kit seguindo as instruções do fabricante.Quantificar o DNA por absorbância a 260 nanômetros em um espectrofotômetro. Posteriormente, realizar sequenciamento profundo, seguido de processamento e verificação de bioinformática conforme descrito no protocolo de texto. A nova biblioteca aleatória fragmentada de leveduras 2-híbridas foi usada no procedimento demonstrado e as inserções de plasmídeo amplificadas por PCR foram analisadas por sequenciamento DEEP e processamento de bioinformática usando o software DEEPN e comparadas com uma biblioteca publicada anteriormente.Este gráfico mostra a ordem de classificação das palhetas por cada gene nas bibliotecas divididas pelas palhetas por gene encontrado pelo sequenciamento do genoma da levedura. Este histograma mostra o número de plasmídeos únicos por gene que codifica um fragmento que está tanto na região codificadora da proteína quanto no quadro de leitura translacional adequado. Uma comparação dos números de plasmídeos diferentes em cada biblioteca que codificam genes de levedura e a proporção que estão e não estão no quadro de leitura translacional correto ou são inseridos de trás para frente é mostrada.No geral, a nova biblioteca tem muito mais plasmídeos diferentes. Esses métodos garantem que a biblioteca possa ser transferida de forma reprodutível para células contendo diferentes proteínas de isca e que o procedimento de seleção possa produzir conjuntos reprodutíveis de genes que são enriquecidos, distinguindo-os como proteínas candidatas específicas que interagem. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de uma semana se executada corretamente.A maior parte desse trabalho é incubar culturas de células e o tempo realmente prático é de apenas algumas horas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de criar populações de um grande número de células diplóides individuais para que a biblioteca possa ser transferida de forma reprodutível para células contendo as diferentes proteínas de isca. Também é importante prestar muita atenção às condições de diluição e taxa de crescimento das células para as populações submetidas à seleção para condições positivas de levedura 2-híbrida.Seguindo este procedimento, os métodos computacionais explicados no trabalho acompanhado identificarão as proteínas candidatas que interagem e fornecerão um caminho para validar essas interações usando um ensaio tradicional de levedura 2-híbrido ou outros métodos bioquímicos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa ideia sobre como criar de forma reprodutível populações de leveduras diplóides que contêm a biblioteca de plasmídeos de presas e cultivá-las em lote para selecionar interações positivas de levedura 2-híbrida. Não se esqueça que trabalhar com solventes orgânicos, durante o protocolo de purificação do DNA, pode ser perigoso e deve ser feito na hotte usando luvas e jaleco.

a-yeast-2-hybrid-screen-in-batch-to-compare-protein-interactions

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

MITO permite a detecção de interações sensíveis transitória e estável entre as proteínas que são expressas no modelo de Saccharomyces cerevisiae organismo. Tem sido aplicado com sucesso para estudar exógenos e leveduras proteínas integrais da membrana, a fim de identificar seus parceiros interagem de uma forma de alto rendimento.

Split-Ubiquitina Yeast Membrana Baseado Two-Hybrid (MITO) do sistema: uma ferramenta poderosa para identificação de interações proteína-proteína

Nós desenvolvemos abrangente, imparcial genome-wide telas para entender gene de drogas e interações gene-ambiente. Métodos para a triagem dessas coleções mutantes são apresentados.

Competitiva Screens Genomic de Bibliotecas Yeast Barcoded

Este vídeo demonstra o ensaio de dois híbridos de levedura para detectar autointerações proteicas específicas. Neste ensaio, a proteína de interesse é marcada em dois domínios de um fator de transcrição que codifica a enzima β-galactosidase. Quando as duas proteínas interagem, isso causa transcrição e tradução para formar a enzima, que é então detectada usando um ensaio bioquímico.

Ensaio de dois híbridos de levedura para determinar a autoassociação de proteínas em células de levedura

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de um híbrido de levedura modificado, que detecta várias proteínas interagindo com o DNA alvo. As células de levedura transformadas contêm a sequência de DNA alvo a montante do gene repórter. Além disso, eles expressam proteínas do fator de transcrição. Quando as proteínas formam complexos e se ligam ao DNA alvo, o gene repórter é expresso e pode ser detectado enzimaticamente.

Ensaio Híbrido Levedura-Um Modificado para Detectar Interações Complexo de Proteína Heteromérica e DNA

Este artigo centra-se na identificação de conjuntos de dados de interação de alta confiança entre hospedeiro e as proteínas do patógeno usando uma combinação de dois métodos ortogonais: levedura de dois híbridos seguido de um ensaio de interação de alto rendimento em células de mamíferos chamada HT-GPCA.

Uma abordagem comparativa para caracterizar a paisagem de Patógeno-Hospedeiro interações proteína-proteína

Utilizando microarrays de proteína que contêm quase toda a S. cerevisiae proteoma é sondado para um rápido interrogatório imparcial de milhares de interações proteína-proteína em paralelo. Este método pode ser utilizado para a molécula de proteína-pequena, a modificação pós-traducional, e outros ensaios in high-throughput.

Sondagem de alta densidade microarrays proteína funcional para detectar interacções proteína-proteína

As proteínas interagem entre si e essas interações determinam em grande parte suas funções. Os parceiros de interação proteica podem ser identificados em alto rendimento in vivo usando um ensaio de aptidão de levedura baseado no ensaio de complementação de fragmentos de proteína diidrofolato redutase (DHFR-PCA).

Genome-wide proteína-proteína Interaction Triagem por proteína-fragmento de Complementação Assay (PCA) em células vivas

proteínas efetoras bacterianas são importantes para o estabelecimento de infecções bem-sucedidas. Este protocolo descreve a identificação experimental de parceiros de ligação proteicas de uma proteína efetora bacteriana em seu hospedeiro natural da planta. A identificação dessas interações efetoras através de levedura telas de dois híbridos tornou-se uma ferramenta importante para desvendar as estratégias de patogenicidade moleculares.

Desvendando a função de uma bacteriana Effector de um patógeno não-cultiváveis ​​meio de uma levedura Screen Two-hybrid

O ensaio de um híbrido de levedura modificado descrito aqui é uma extensão do ensaio de híbrido (Y1H) de levedura clássico para estudar e validar a interação de proteína-proteína heteromérica-DNA em um sistema heterólogo para qualquer estudo de genômica funcional.

Um Sistema Híbrido de Levedura-Um Modificado para Estudos de Interação de DNA de Complexo de Proteínas Heteroméricas

Sequenciamento profundo das populações de leveduras selecionadas para interações de 2-híbrido de levedura positivos potencialmente produz uma riqueza de informações sobre interação proteínas do parceiro. Aqui, descrevemos o funcionamento das ferramentas de Bioinformática específicos e software atualizado personalizado para analisar os dados de sequência de tais telas.

Análise informática de dados da sequência do lote levedura híbrida-2 telas

As interações de biomoléculas, como as interações proteína-proteína, são a base molecular das funções biológicas. Se mutantes de interação nula/prejudicada que especificamente não possuem a interação relevante puderem ser isolados, eles ajudarão muito a entender a(s) função(ões) dessa interação. Este artigo apresenta uma maneira eficiente de isolar mutantes nulos de interação/prejudicados.

Isolando mutantes de interação nula/prejudicada usando o ensaio de dois híbridos de levedura

Aprenda a realizar telas de 2-híbridos de levedura em lote para comparar perfis de interação proteica usando deep sequencing. Este método permite identificar interações diferenciais relevantes para processos moleculares e celulares.

Uma tela de 2-híbrido de levedura em lote para comparar as interações da proteína

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