Uma tela de 2-híbrido de levedura em lote para comparar as interações da proteína

Este método usa o princípio do sistema híbrido 2-levedura em ambas as populações para identificar interações proteína-proteína que respondem a perguntas-chave sobre uma variedade de processos moleculares e celulares. Essa técnica aproveita o sequenciamento profundo para ver as interações de uma proteína em relação a outra. Uma vez que essa abordagem é voltada para fazer comparações paralelas, ela pode identificar conjuntos de proteínas que interagem com uma proteína versus outra ou diferentes confirmações da mesma proteína ou durante a tipagem de uma versão mutante causadora de doença, para revelar interactomas diferenciais.

Um novo plasmídeo de isca híbrida 2 de levedura pTEF-GBD foi construído para este procedimento, conforme descrito no protocolo de texto. Este plasmídeo produz proteínas de fusão de domínio de ligação ao DNA Gal4 dentro de um plasmídeo de baixa cópia baseado em centrômero TRP1 carregando o gene de resistência à canamicina que também permite a clonagem de fragmentos de isca a montante e a jusante do domínio de ligação ao DNA Gal4. Este plasmídeo de isca foi usado para transformar a levedura MATa, e a expressão das proteínas de fusão da isca Gal4 foi verificada por immunoblotting com anticorpos anti-MIC.