Isolamento, expansão e indução de Adipogenic de CD34 + CD31 + células endoteliais de tecido adiposo humano de Omental e subcutâneo

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da obesidade, como identificar os principais fatores e mecanismos que impedem uma resposta adipogênica robusta durante a remodelação do tecido adiposo. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o isolamento de células endoteliais CD34+CD31+do tecido adiposo humano, começando com pequenas quantidades de tecido. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando queríamos identificar células na vasculatura adiposa humana que respondem à estimulação adipogênica.

A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de isolamento celular são difíceis de praticar devido ao acesso muitas vezes limitado ao tecido adiposo humano fresco. Colete tecido adiposo omental e subcutâneo humano de seres humanos submetidos à cirurgia bariátrica. Imediatamente após a extração do tecido, mantenha o tecido adiposo omental e subcutâneo humano em frascos separados contendo a solução salina tamponada de Hank com 50 microgramas por mililitro de estreptomicina de penicilina à temperatura ambiente.

Assim que a amostra chegar ao laboratório após a extração do tecido, limpe e remova cuidadosamente as seções fibróticas e cauterizadas do tecido usando tesouras e pinças com esfregaço de etanol a 70%. Pese o tecido adiposo e divida-o em alíquotas de cinco gramas para a digestão da colagenase. Use duas tesouras para picar finamente cinco gramas de tecido adiposo em cinco mililitros de uma solução de colagenase em um frasco de cintilação à temperatura ambiente.

Adicione mais 10 mililitros de solução de colagenase ao tecido picado para um total de 15 mililitros. Digerir as amostras durante uma hora a 37 graus Celsius em banho-maria com agitação contínua. Após a digestão, despeje as amostras na seringa de 20 mililitros sem corte.

Filtre a amostra através de malha de náilon de 250 mícrons no tubo cônico de 50 mililitros para separar os adipócitos e as células vasculares estromais do tecido não digerido. Lave o frasco de cintilação com 10 mililitros de KRBBS e despeje a lavagem através do filtro para coletar as células residuais antes de incubar as amostras filtradas por cinco minutos em temperatura ambiente. Em seguida, utilize uma seringa de 20 mililitros e uma agulha de pipetagem de calibre 20 por seis polegadas para remover a camada de fração vascular estromal e transferi-la para um tubo cônico limpo de 50 mililitros.

Adicione 10 mililitros de KRBBS e deixe as amostras na bancada por cinco minutos em temperatura ambiente. Mantenha as frações vasculares estromais de ambos os depósitos no gelo para processamento posterior. Gire as frações vasculares estromais a 500 vezes G por cinco minutos a 4 graus Celsius.

Remova as amostras da centrífuga e despeje cuidadosamente o sobrenadante, mantendo o pellet contendo as células da fração vascular estromal. Ressuspenda suavemente os pellets celulares em cinco mililitros de PBS. Depois de girar as amostras novamente, remova o sobrenadante, ressuspenda as células em um mililitro de PBS e conte as células.

Pellet as amostras pela terceira vez, e ressuspenda o pellet em 100 microlitros de tampão de isolamento CD34. Adicione 10 microlitros de coquetel CD34 e incube a amostra por 15 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, adicione cinco microlitros de esferas magnéticas e incube a amostra por 10 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, adicione 2,5 mililitros de tampão de isolamento CD34 a cada amostra e coloque as amostras no ímã por cinco minutos em temperatura ambiente. Inverta o ímã por cinco segundos para despejar o tampão de isolamento. Depois de repetir esse processo quatro vezes, remova o tubo do ímã e adicione dois mililitros de tampão de isolamento CD34.

Após outra centrifugação, ressuspenda os grânulos de células CD34 + em um mililitro de tampão de isolamento CD34 e conte as células. Pulverize as células novamente e ressuspenda o pellet em 250 microlitros de tampão B e 250 microlitros de tampão de lavagem. Em seguida, ressuspenda completamente os grânulos CD31 por vórtice do tubo, adicione 20 microlitros de grânulos CD31 ao grânulo celular ressuspenso e incube a amostra com balanço por 30 minutos à temperatura ambiente.

Antes da separação das células, adicione um mililitro de tampão de lavagem para equilabar o filtro. Em seguida, aplique a mistura preparada de células ressuspensas em grânulos CD31 no filtro. Lave o filtro com cinco mililitros de tampão de lavagem em movimentos circulares para um volume total de 20 mililitros.

Conecte o conector a um tubo cônico estéril de 50 mililitros e feche a trava de louro. Depois de conectar o filtro ao conector, adicione um mililitro de tampão de lavagem ao longo da parede do filtro e, em seguida, adicione um mililitro de tampão D ativado ao longo da parede do filtro. Agite a amostra suavemente e incube-a por 10 minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, adicione um mililitro de tampão de lavagem e separe as células das contas pipetando para cima e para baixo 10 vezes. Abra a trava de leur e deixe as células separadas fluírem para o tubo cônico de 50 mililitros. Lave o filtro 10 vezes com um mililitro de tampão de lavagem de cada vez.

Descarte o conector e o filtro e centrifugue as amostras a 300 vezes G por 10 minutos a 4 graus Celsius. Finalmente, ressuspenda o pellet celular em dois mililitros de meio EGM2 completo para cultura. Cultive as células em placas tratadas com cultura de tecidos de seis poços com meio EGM2 completo em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Substitua o meio a cada três a quatro dias até que as células atinjam 80 a 90% de confluência. Em seguida, semeie aproximadamente 100 a 200 mil células em placas de seis poços, garantindo poços duplicados para cada depósito, e cultive-as em meio EGM2 completo por dois dias. Após dois dias, aspire qualquer meio de crescimento.

Substitua o meio por dois mililitros de meio DMEM/F-12 com 5% de FBS e 50 microgramas por mililitro de penicilina estreptomicina para as células de controle. Para as células de tratamento, substitua o meio por dois mililitros de meio de adipogênese. Incubar as células a 37 graus Celsius em uma incubadora umidificada de 5% de dióxido de carbono por 13 dias, substituindo o respectivo meio a cada três a quatro dias.

São mostrados resultados representativos mostrando a morfologia endotelial típica de paralelepípedos das células CD34 + CD31 + após duas passagens na cultura. Também foi demonstrada a capacidade das células de formar túbulos quando cultivadas em Matrigel como esperado. A captação uniforme de LDL acetilada marcada com fluorescência mostra a presença de uma população de células homogênea com identidade endotelial.

Aqui é mostrada a coloração Oil Red O de gotículas lipídicas neutras em células CD34+CD31+ após 13 dias de indução adipogênica. Respostas representativas de células de depósitos omentais e subcutâneos de três indivíduos humanos diferentes ilustram a grande variabilidade na resposta à indução adipogênica entre depósitos de gordura do mesmo doador e entre doadores. Esta imagem mostra coloração lipídica intracelular fluorescente em células CD34+C31+, após indução adipogênica por 13 dias.

A imagem mostra células com lipídios uniloculares, lipídios multiloculares e sem acúmulo de lipídios. A PCR em tempo real mostra a expressão do marcador pan adipócitos adiponectina e dos marcadores bege marrom CIDEA e UCP-1. Esses resultados confirmam que as células após a indução adipogênica expressam marcadores moleculares consistentes com um fenótipo misto de adipócitos bege branco.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cinco horas se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar tecido adiposo humano fresco que foi coletado e não armazenado por mais de duas horas. Após este procedimento, outros métodos como citometria de fluxo, imuno-histoquímica e RT-PCR podem ser realizados para identificar subconjuntos específicos de células respondedoras e expressão de marcadores de adipócitos maduros que podem ser utilizados para identificar um fenótipo de adipócito marrom bege.

Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da obesidade explorarem os papéis do tecido adiposo, células vasculares e adipogênese em humanos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como isolar, cultivar e expandir células CD34+31+. Não se esqueça de que trabalhar com tecidos humanos pode ser extremamente perigoso, e precauções, como regulamentos de biossegurança, devem sempre ser tomadas ao realizar este procedimento.

As implicações dessa técnica se estendem à terapia de comorbidades associadas à obesidade, como a resistência à insulina, pois identifica a resposta adipogênica das células a uma potencial intervenção terapêutica.