Name: Isolamento, expansão e indução de Adipogenic de CD34 + CD31 + células endoteliais de tecido adiposo humano de Omental e subcutâneo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 28 s
Description: Aprenda a isolar células endoteliais CD34+CD31+ de tecido adiposo humano e diferenciá-las em adipócitos brancos e bege. Este método avança a pesquisa sobre obesidade e remodelamento tecidual.

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Os autores desejam reconhecer Becky Marquez, o coordenador clínico no centro de bariátrica Sentara, pela sua assistência com o processo do paciente, triagem e concordando. Esta pesquisa foi apoiada pelo R15HL114062 para Anca D. Dobrian.

O Comitê de placa de revisão institucional na Eastern Virginia Medical School aprovado a pesquisa e a coleta de amostras de tecido adiposo humano utilizados no estudo. Termo de consentimento informado foram coletado dos pacientes.
1. preparação de Buffers, meios e instrumentos
<ol><li>Preparar uma solução de Krebs Ringer Bicarbonate-Buffered (KRBBS): 135 milímetros de cloreto de sódio, 5 mM de cloreto de potássio, sulfato de magnésio 1 mM, 0,4 milímetros de fosfato de potássio dibásico, glicose de 5,5 mM, adenosina de 1mm, mistura de antibiótico/antimicótico 0,01% (50 µ g/mL de penicilina, 50 µ g/mL de estreptomicina, 30 µ g/mL de gentamicina, 15 ng/mL de anfotericina) e 10 mM HEPES (pH = 7,4). Esta solução é preparada fresca cada vez para a coleção de tecido e digestão.</li>
	<li>Preparar uma solução de colagenase fresco: 1 mg/mL de colagenase, tipo 1, em KRBSS; fazer 3 mL/g de gordura. Pré-aquecer a solução de colagenase a 37 ° C em banho de água antes da digestão do tecido.</li>
	<li>Preparar um Buffer de isolamento de células CD34: 2% de soro fetal bovino (FBS) e 1 mM de EDTA em salina tampão fosfato (PBS).</li>
	<li>Preparar a mídia Adipogenesis: DMEM/F12, 5% FBS, 50 µ g/mL de penicilina/estreptomicina, 1,25 µ l/mL de insulina humana (5 µ g/mL ou 144 mU/mL) e 0,36 µ l/mL de 2,8 mM rosiglitazone (1 µM).</li>
	<li>Prepare uma solução stock de óleo vermelho O (ORO) de 0,3% (peso/volume), dissolver 0,3 g de ORO em 100 mL de isopropanol.</li>
</ol>2. tecido adiposo do estroma Vascular fração isolamento
Nota: O estudo incluiu uma coorte transversal de morbidamente obesos tipo 2 diabéticos (T2D) e indivíduos não-diabéticos, com idade entre 18-65 anos, submetidos à cirurgia bariátrica no Sentara metabólica e centro de cirurgia de perda de peso (Sentara Medical Group, Norfolk, VA). Critérios de exclusão foram uma doença auto-imune, incluindo diabetes mellitus tipo 1, as condições que requerem terapia imunossupressora crônica, medicamentos anti-inflamatórios, thiazolinendiones, uso ativo do tabaco, infecções crônicas ou agudas ou uma história de malignidade tratados nos últimos 12 meses. T2D foi definida como um jejum de glicose do plasma de 126 mg/dL ou maior, um de 200 mg/dL ou maior após uma tolerância à glicose 2h teste de glicose ou o uso de medicamentos anti-diabéticos.
<ol><li>Recolha humano omental (OM) e tecido adiposo de subcutânea (SC) (AT) de seres humanos submetidos à cirurgia bariátrica.</li>
	<li>Mantenha a OM e SC AT em frascos separados, contendo solução salina em buffer do Hank com 50 µ g/mL de penicilina/estreptomicina em temperatura ambiente imediatamente após a retirada de tecido.</li>
	<li>Limpe cuidadosamente e remover seções de tecido fibróticas e cauterizadas usando uma pinça e tesoura de colheu etanol 70% quando a amostra chega ao laboratório após a extração do tecido.</li>
	<li>Pesar o tecido adiposo e alíquotas que em 5 g (ou menos) para a digestão de colagenase de partição.</li>
	<li>Picar finamente a 5 g do AT em 5 mL de uma solução de colagenase em um frasco de cintilação em temperatura ambiente, usando dois pares de tesouras.</li>
	<li>Adicione um adicional 10 mL da solução de colagenase no tecido picada para total 15 mL.</li>
	<li>Digeri as amostras por 1h, a 37 ° C, em banho-maria com agitação contínua.</li>
	<li>Corte a ponta fora uma seringa de 20 mL, tornar um fim brusco.</li>
	<li>Corte um quadrado de 9 x 9 cm de uma malha de 250 µm e empurre-a meio caminho em um tubo cônico de 50 mL, utilizando a seringa de fim brusco.</li>
	<li>Despeje as amostras a seringa de 20 mL fim brusco e filtro através da malha de nylon 250 µm no tubo cónico de 50 mL separar adipócitos e células do estroma vasculares do tecido não digerido. Nota: Não use mais de 5g de AT por tubo cónico de 50 mL, como a malha vai entupir devido ao excesso de material não digerido fibrótico.</li>
	<li>Lavar o frasco de cintilação com 10 mL de KRBBS e derramá-lo através do filtro para coletar células residuais.</li>
	<li>Incube as amostras filtradas por 5 min à temperatura ambiente. Nota: Este passo é importante para permitir os adipócitos para flutuar na parte superior do tubo e algumas das células do estroma vasculares repousar no fundo do tubo.</li>
	<li>Utilize uma seringa de 20 mL e um 20 x 6 na pipetagem agulha para remover a camada de fração vascular do estroma e transferir para um tubo cônico de 50ml limpo.</li>
	<li>Adicionar 10 mL de KRBBS e permitir que as amostras se sentar no banco durante 5 min, à temperatura ambiente.</li>
	<li>Repita as etapas de 2.12 – 2.14 duas vezes. Nota: Estes passos irão garantir que não há nenhuma contaminação das células do estroma vasculares com os adipócitos flutuantes.</li>
	<li>Manter as frações do estroma vasculares de ambos os depósitos no gelo para processamento adicional, conforme descrito nas etapas abaixo. Nota: Não deixe as células no gelo por mais de 1h, pois isto pode ter um impacto sobre a viabilidade celular. Os adipócitos podem ser congelado em nitrogênio líquido para armazenamento a longo prazo ou usadas frescos para experimentos.</li>
</ol>3. isolamento de células endoteliais de tecido adiposo
<ol><li>Girar as frações vasculares do estroma (SVF) a 500 x g por 5 min, a 4 ° C.</li>
	<li>Retire as amostras da centrífuga e com cuidado decantar o sobrenadante; manter a pelota que contém as células SVF.</li>
	<li>Resuspenda suavemente as pelotas de célula em 5 mL de PBS. Nota: Se mais de 5 g de um depósito de AT foi processada em várias alíquotas (ver passo 2.4), juntar as pelotas de célula.</li>
	<li>Girar as amostras em 500 x g durante 5 min, a 4 ° C.</li>
	<li>Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de PBS contar as células. Nota: Aqui, um contador automático de células foi usado para a contagem de células. A viabilidade celular foi obtida através da mistura de 12 µ l de suspensão de células com 12 µ l de uma solução de iodeto de laranja/propidium (AO/PI) acridina (ver Tabela de materiais). O número médio de células por grama de AT para cada depósito é: (a) OM Depot: 1,69 x 105 ± 4,51 x 104; (b) SC Depot: 1,24 x 105 ± 6,45 x 104. A viabilidade das células de ambos os depósitos era > 90%.</li>
	<li>Pelotas as amostras em 500 x g durante 5 min, a 4 ° C. Nota: Um protocolo de seleção CD34 Fima (ver Tabela de materiais) foi adaptado para etapas 3.7 – 3.15.</li>
	<li>Resuspenda o pellet em 100 µ l de tampão de isolamento de CD34. Nota: A contagem de células totais exige os seguintes volumes de re-suspensão: (a) < 2 x 107 células: resuspenda o pellet em 100 µ l; (b) 2 x 108– 5 x 108 células: resuspenda o pellet em 1 mL. Em passos 3.9 – 3.16, os volumes dos reagentes usados foram reduzidos para < 2 x 107 células.</li>
	<li>Adicionar 10 µ l de coquetel CD34 e incubar a amostra durante 15 minutos, à temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicionar 5 µ l de grânulos magnéticos e incubar a amostra durante 10 minutos, à temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicionar 2,5 mL de tampão de isolamento de CD34 para cada amostra e coloque as amostras para o ímã, por 5 min, à temperatura ambiente.</li>
	<li>Inverter o ímã para 5 s para decantar o tampão de isolamento.</li>
	<li>Remover as amostras do ímã e repita os passos x 4 3.10 e 3.11.</li>
	<li>Retire o tubo do ímã e adicionar 2 mL de tampão de isolamento de CD34.</li>
	<li>Pelotas as células a 500 x g por 5 min, a 4 ° C.</li>
	<li>Resuspenda as pelotas de células em 1 mL de tampão de isolamento de CD34 e contar as células. Nota: Aqui, o número médio de células por grama de AT é: (a) OM Depot: 4,75 x 104 ± 3.36 x 104; (b) SC Depot: 1,06 x 104 ± 9,53 x 103. Um protocolo de plástico immunobead CD31 foi adaptado para etapas 3.16 – 3.34 (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Células a 500 x g por 5 min de pelotas e resuspenda o pellet em 250 µ l de tampão B e 250 µ l de tampão de lavagem.</li>
	<li>Resuspenda completamente os grânulos CD31 vortexing o tubo.</li>
	<li>Adicione 20 µ l de grânulos CD31. Nota: Devido a célula total conta > 1 x 106, o volume foi reduzido de acordo com a entrada do fabricante.</li>
	<li>Incube a amostra com balanço por 30 min, à temperatura ambiente.</li>
	<li>Anexe um coador para um tubo cônico estéril 50 mL. Nota: A maior abertura do filtro deve estar no topo.</li>
	<li>Antes da separação da célula, adicione 1 mL de tampão de lavagem para equilibrar o coador. Aplique a mistura gerada em etapa 3,16 para o filtro.</li>
	<li>Lave o filtro com 5 mL de tampão de lavagem em um movimento circular para um volume total de 20ml. Encaixe o conector para um tubo cônico estéril 50 mL e fechar o conector luer-lock.</li>
	<li>Ligue o filtro ao conector. Adicione 1 mL de tampão de lavagem ao longo da parede do filtro. Adicione 1 mL de tampão registrado D ao longo da parede do filtro. Agitar suavemente o frasco da amostra e incube-lo por 10 minutos, à temperatura ambiente.</li>
	<li>Adicione 1 mL de tampão de lavagem. Separe as células os grânulos pipetando acima e para baixo 10 x. Nota: Evite a geração de bolhas de ar.</li>
	<li>Abra o conector luer-lock e permitir que as células destacadas a fluir no tubo cónico de 50 mL. Lavar o filtro 10 x com 1 mL de tampão de lavagem cada vez.</li>
	<li>Descartar o conector e o filtro e centrifugar as amostras a 300 x g durante 10 minutos, a 4 ° C. Resuspenda o pellet celular em 2 mL de mídia de EGM-2 completa para cultura. Nota: O número médio de células por grama de AT neste momento é: (a) OM Depot: 5.92 x 103 ± 4,27 x 103; (b) SC Depot: 4,12 x 103 ± 2,1 x 103. A viabilidade de células de ambos os depósitos foi superior a 90%.</li>
</ol>4. indução de Adipogenesis em células endoteliais isoladas
<ol><li>Crescem as células em placas de cultura de tecidos tratados 6-poços com completa EGM-2 de mídia em um 37 ° C, 5% CO2 incubadora. Substitua a mídia cada 3-4 dias até as células atinjam a confluência de 80-90%. Nota: A duplicação da população é entre 2 a 3 dias.</li>
	<li>Expandir as células por chapeamento-los em pratos de Petri de 100mm e dividir as células uma vez 1:3. Nesta fase, as células são na passagem 2.</li>
	<li>Contagem de células usando uma célula automática contador (ver Tabela de materiais).</li>
	<li>Células de sementes aproximadamente 100 – 200.000 em 6-poços chapas garantindo poços duplicados para cada depósito e cultura-los em completa mídia EGM-2 para 2 dias.</li>
	<li>Aspire fora qualquer mídia de crescimento e substituí-lo com 2 mL de DMEM/F12 com 5% FBS e 50 µ g/mL de penicilina/estreptomicina para o controle de células e substituí-lo com 2 mL de mídia Adipogenesis (consulte a etapa 1.4) para as células de tratamento.</li>
	<li>Incube as celulas a 37 ° C em um umidificado 5% CO2 incubadora há 13 dias, substituindo os respectivos meios de comunicação a cada 3 a 4 dias. Observação: Células começará a acumular lipídios após 4 dias de tratamento.</li>
	<li>Conduta de ORO e Nilo vermelho coloração de acordo com métodos publicados15–17.</li>
	<li>Para isolar as células para uma extração de RNA, remova a mídia as placas de indução 6-poços e lave-a com 1 mL de PBS estéril.</li>
	<li>Adicione 350 µ l de uma solução de tiocianato-fenol-clorofórmio guanidium (consulte a Tabela de materiais) para cada um bem e incube-lo em temperatura ambiente por 5-10 min.</li>
	<li>Raspar as células no prato com uma espátula de célula e transferir as células para um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL. Nota: As amostras podem ser armazenadas no freezer-80 ° C para a extração do RNA e posterior processamento em data posterior.</li>
	<li>Extrair o mRNA das amostras usando uma extração de RNA adaptada de protocolo (consulte Tabela de materiais).</li>
	<li>Executar uma reação em cadeia do polymerase em tempo real (RT-PCR) para avaliar a expressão gênica usando as seguintes pontas de prova: adiponectina, UCP-1 e CIDEA (ver Tabela de materiais). Nota: Aqui, os procedimentos de RT-PCR foram realizados utilizando o seguinte protocolo padrão: desnaturação (95 ° C; 15 s), recozimento e extensão (60 ° C; 1 min) para 40 ciclos. As amostras que expressa genes com valores de CT > 35 foram considerados indetectável.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O foco deste artigo é fornecer uma metodologia para o isolamento, a expansão e a indução de adipogenic de CD34 + CD31 + células endoteliais de depósitos viscerais e subcutâneas de tecido adiposo humano.
Metodologias foram relatadas para o isolamento de células endoteliais de vários leitos vasculares de roedores ou humanos que envolvem principalmente técnicas usando anticorpos CD31 fluorescente etiquetado ou acoplado a grânulos magnético18, 1...

Evidência recente mostra que, tanto nos ratos e nos seres humanos, um subconjunto de células que residem na vasculatura do tecido adiposo pode ser diferenciado em adipócitos branco ou bege/marrom1,2,3. O fenótipo de tais células é um assunto controverso, com evidências que sustentam as células endoteliais, musculares lisas/Pericito ou um espectro de fenótipos intermediários4,5,6,7. O escopo de desenvolver esta metodologia foi testar o potencial de adipogenic de CD34 + CD31 + células endoteliais isoladas de diferentes depósitos de gordura dos humanos obesos. Outros estudos na literatura estão focando o adipogenic potencial de fração total do estroma vascular ou do adipócito conhecido progenitores2,8,9. Desde tecnologias actualmente existentes podem alvejar especificamente tecido adiposo células endoteliais por drogas entrega10, compreendendo o potencial de tais células adipogenic submeter-se a indução no sentido de adipócitos brancos ou bege é importante para terapias alvo futuras.
Diferentes grupos relataram a combinação de marcadores CD31 e CD34 como substitutos para isolar as células endoteliais de tecido adiposo humano11,12,13. Normalmente, o isolamento é realizado usando duas etapas sequenciais e uma seleção positiva usando esferas magnéticas. Neste relatório, foi utilizada a immunoseparation usando CD34 + grânulos magnéticos combinados com grânulos plásticos CD31. Encontramos essa técnica superior para o sequencial immunoseparation magnético com relação a preservação da morfologia endotelial típico de paralelepípedos. Além disso, fomos capazes de gerar células suficientes, necessárias para a expansão e adipogenic indução a partir de tão pouco quanto 1-2 g de gordura. A biópsia de pequena amostra de gordura subcutânea é suficiente para produzir a quantidade necessária de células para aplicações a jusante. Este aspecto é potencialmente importante, particularmente se esse método será utilizado para a seleção para uma capacidade de resposta à indução de adipogenic em cobaias humanas.
Ao contrário de outros sistemas relatados na literatura, este método utiliza apenas dois ingredientes para a indução de adipogenic do CD34 + CD31 + células: um agonista do PPARγ — rosiglitazone — e da insulina humana. Importante, a quantidade de insulina usada cai dentro do intervalo normal/alta de circulação post-absorptive insulina em seres humanos14. O grau de sensibilidade à insulina de células em vitro, medido por fosforilação da Akt, não se correlaciona com a capacidade de responder para a indução de cocktail. Curiosamente, usando este condições de cocktail e experimental de indução, uma mistura de brancas e bege/marrom células foram obtidos conforme determinado pelo tamanho e número de gotículas lipídicas intracelulares e a expressão de marcadores moleculares. Este protocolo de indução simples e econômica, juntamente com a avaliação quantitativa do fenótipo das células Respondente (branco vs bege) permite um rastreio dos agentes que potencialmente podem alterar o equilíbrio de bege diferenciada : branco adipócitos.
Este método também fornece uma abordagem translacional para compreender os mecanismos subjacentes da adipogenesis de progenitoras endoteliais vasculares no tecido adiposo humano. Usando esta técnica de isolamento específico/diferenciação, investigadores podem interrogar várias vias responsáveis para adipogenesis em um subconjunto de pilhas endothelial vasculares de vários depósitos de gordura em humanos obesos e magros.

<table><tbody><tr><td> Large Equipment </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Biosafety Cabinet </td><td> Nuaire </td><td> nu-425-400 </td><td></td></tr><tr><td> Cell Culture Incubator </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 800 DH </td><td></td></tr><tr><td> banho-maria </td><td> Forma Scientific </td><td> 2568 </td><td> Shaker Recíproco </td></tr><tr><td> RT-PCR Machine </td><td> BIO-RAD </td><td> CFX96-C1000 </td><td></td></tr><tr><td> Caixa de Eletroforese </td><td> BIO-RAD </td><td> Mini PROTEAN 3 Células </td><td></td></tr><tr><td> Caixa Transblot </td><td> BIO-RAD </td><td> Mini Trans-Blot Cell </td><td></td></tr><tr><td> Electrophoresis Power Supply </td><td> BIO-RAD </td><td> PowerPac Basic </td><td></td></tr><tr><td> ELISA Reader </td><td> Molecular Devices </td><td> SpectraMax M5 </td><td></td></tr><tr><td> Blot Reader </td><td> LI-COR </td><td> Odyssey </td><td> Near Infrared </td></tr><tr><td> Refrigerated Centrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> 5810 R </td><td></td></tr><tr><td> Tabletop Centrifuge </td><td> Eppendorf </td><td> MiniSpin Plus </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio Fluorescente </td><td> Olympus </td><td> BX50 </td><td></td></tr><tr><td> Microscópio invertido </td><td> Nikon </td><td> TMS </td><td></td></tr><tr><td> KRBSS Buffer </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> HEPES </td><td> Research Products International </td><td> H75030 </td><td></td></tr><tr><td> Bicarbonato de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 792519 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de cálcio di-hidratado </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7902 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de potássio monobásico </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P5655 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfato de magnésio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2643 </td><td></td></tr><tr><td> Cloreto de sódio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 746398 </td><td></td></tr><tr><td> Fosfato de sódio monobásico monohidratado </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S9638 </td><td></td></tr><tr><td> Potássio cloreto </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9333 </td><td></td></tr><tr><td> Glicose </td><td> Acros Organics </td><td> 410950010 </td><td></td></tr><tr><td> Adenosina </td><td> Acros Organics </td><td> 164040250 </td><td></td></tr><tr><td> Albumina de soro bovino </td><td> GE Healthcare Bio-Sciences </td><td> SH30574.02 </td><td></td></tr><tr><td> Penicilina/Estreptomicina </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 15070063 </td><td></td></tr><tr><td> Tissue Digestion </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 20 mL Seringa </td><td> Global Medical </td><td> 67-2020 </td><td></td></tr><tr><td> Malha de Nylon, 250 &micro; m </td><td> Sefar </td><td> 03-250/50 </td><td></td></tr><tr><td> Agulhas de Pipetagem </td><td> Popper </td><td> 7934 </td><td></td></tr><tr><td> Tesouras Finas </td><td> Ferramentas de Belas Ciências </td><td> 14058-11 </td><td></td></tr><tr><td> Pinças de Tecido </td><td> George Tiemann & Co </td><td> 160-20 </td><td></td></tr><tr><td> Collagenase, Tipo I </td><td> Worthington Biochemical </td><td> LS004196 </td><td></td></tr><tr><td> Petri Plates, 100 mm </td><td> USA Scientific </td><td> 5666-4160 </td><td> TC Tratados </td></tr><tr><td> Eppendorf Tubes, 1.5 mL </td><td> USA Scientific </td><td> 1615-5500 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos cônicos, 15 mL </td><td> Nest Scientific </td><td> 601052 </td><td></td></tr><tr><td> Tubos cônicos, 50 mL </td><td> Nalgene </td><td> 3119-0050 </td><td></td></tr><tr><td> Frascos de cintilação </td><td> Kimble </td><td> 74505-20 </td><td> Corte de tecidos </td></tr><tr><td> Isolamento celular </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Celômetro </td><td> Nexcelom </td><td> Auto 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Slides do celômetro </td><td> Nexcelom </td><td> CHT4-SD100-002 </td><td></td></tr><tr><td> Celómetro Mancha de Viabilidade </td><td> Nexcelom </td><td> CS2-0106-5mL </td><td> Acridina Laranja/Propidina Umm Iodo </td></tr><tr><td> Anti-CD34 Grânulos Magnéticos </td><td> StemCell Technologies </td><td> 18056 </td><td> Kit </td></tr><tr><td> EasySep Magnet </td><td> StemCell Technologies </td><td> 18000 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-CD31 Contas de Plástico </td><td> pluriSelect USA </td><td> 19-03100-10 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect 10x Wash Buffer </td><td> pluriSelect USA </td><td> 60-00080-10 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect Anel Conector </td><td> pluriSelect USA </td><td> 41-50000-03 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect Detachment Buffer </td><td> pluriSelect USA </td><td> 60-00046-12 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect Incubation Buffer </td><td> pluriSelect USA </td><td> 60-00060-12 </td><td></td></tr><tr><td> pluriSelect Filtro de Células S </td><td> pluriSelect USA </td><td> 43-50030-03 </td><td></td></tr><tr><td> Cell Culture </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 6-well Plates </td><td> USA Scientific </td><td> CC7682-7506 </td><td> TC Treated </td></tr><tr><td> 4- lâminas bem compartimentadas </td><td> Corning Life Sciences </td><td> 354559 </td><td> Fibronectina revestida </td></tr><tr><td> 4-lâminas bem compartimentadas </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 154526PK </td><td> Vidro não revestido </td></tr><tr><td> Células endoteliais microvasculares adiposas humanas (HAMVEC) </td><td> Sciencell Research Laboratories </td><td> 7200 </td><td> Linha celular primária </td></tr><tr><td> Endothelial Cell Media (ECM) </td><td> ScienCell Research Laboratories </td><td> 1001 </td><td> Kit Completo </td></tr><tr><td> DMEM/F12 Basal Media </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 11320082 </td><td></td></tr><tr><td> Soro Fetal Bovino (FBS) </td><td> Rocky Mountain Biologicals </td><td> FBS-BBT </td><td></td></tr><tr><td> Insulina </td><td> Lilly </td><td> U-100 </td><td> Humalog </td></tr><tr><td> Rosiglitazona </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> R2408 </td><td></td></tr><tr><td> Cell Analysis </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Oil Red O Dye </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> O0625 </td><td> Preparado em placas de poços isopropanol </td></tr><tr><td> 96 poços </td><td> USA Scientific </td><td> 1837-9600 </td><td></td></tr><tr><td> 96 placas de PCR de poço </td><td> Genesee Scientific </td><td> 24-300 </td><td></td></tr><tr><td> RNA Extraction </td><td> Zymo Research </td><td> R2072 </td><td> Kit </td></tr><tr><td> cDNA Synthesis </td><td> BIO-RAD </td><td> 1708841 </td><td> Supermix </td></tr><tr><td> JumpStart PCR Polimerase </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> D9307-250UN </td><td> Hot start, com PCR Buffer N </td></tr><tr><td> Solução de Cloreto de Magnésio </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M8787-5ML </td><td> 3 mM final em reação de PCR </td></tr><tr><td> dNTPs </td><td> Promega </td><td> U1515 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan AdipoQ </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs00605917_m1 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan CIDEA </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs00154455_m1 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan RPL27 </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs03044961_g1 </td><td></td></tr><tr><td> TaqMan UCP1 </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> Hs00222453_m1 </td><td></td></tr><tr><td> BCA Assay </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> QPBCA-1KT </td><td> Kit </td></tr><tr><td> Bis-acrilamida </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610146 </td><td> solução estoque de 40% </td></tr><tr><td> Persulfato de amônio </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610700 </td><td></td></tr><tr><td> TEMED </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610800 </td><td></td></tr><tr><td> Tris </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T1503 </td><td></td></tr><tr><td> Glicina </td><td> BIO-RAD </td><td> 1610718 </td><td></td></tr><tr><td> Sulfato de Dodecalal de Sódio </td><td> Sigma-Aldrich < </td><td> p>L3771 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Fisher Scientific </td><td> S311-100 </td><td></td></tr><tr><td> Azul de Bromofenol </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> B8026 </td><td></td></tr><tr><td> Blot Membrane </td><td> EMD Millipore </td><td> IPFL00010 </td><td></td></tr><tr><td> Metanol </td><td> Fisher Scientific </td><td> A452-SK4 </td><td></td></tr><tr><td> Odyssey Blocking Buffer, Tris </td><td> LI-COR </td><td> 927-50000 </td><td></td></tr><tr><td> Anti-AKT anticorpo </td><td> Cell Signaling Technology </td><td> 2920S </td><td> Monoclonal de camundongo </td></tr><tr><td> Anticorpo anti-pAKT </td><td> Tecnologia de Sinalização Celular </td><td> 9271S </td><td> Policlonal de coelho </td></tr><tr><td> Anticorpo anti-UCP1 </td><td> Abcam </td><td> ab10983 </td><td> Coelho policlonal </td></tr><tr><td> anticorpo IgG anti-camundongo </td><td> LI-COR </td><td> 926-68070 </td><td> Goat Polyclonal, IRDye 680RD </td></tr><tr><td> Anti-Rabbit IgG anticorpo </td><td> LI-COR </td><td> 926-32211 </td><td> <>p Policlonal de cabra, IRDye 800CW </td></tr><tr><td> Anticorpo IgG anti-coelho </td><td> Jackson ImmunoResearch </td><td> 111-025-003 </td><td> Policlonal de cabra, TRITC </td></tr><tr><td> Tampão fosfato salino </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 10010049 </td><td></td></tr><tr><td> 37% Solução de formaldeído </td><td> Electron Microscopy Sciences </td><td> 15686 </td><td> solução 4% para fixação celular </td></tr><tr><td> Soro de cabra normal </td><td> Vector Laboratories </td><td> S-1000 </td><td> solução de bloqueio 10% </td></tr><tr><td> Triton X-100 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> X-100 </td><td> solução de permeabilização 0,1% </td></tr><tr><td> DAPI </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> D1306 </td><td></td></tr><tr><td> Calceína AM </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> 65-0853-39 </td><td> Visualização fluorescente celular </td></tr><tr><td> Matriz de membrana basal de matrigel </td><td> Corning Life Sciences </td><td> 356231 </td><td> Fator de crescimento reduzido </td></tr><tr><td> DiI marcado com acetilado LDL </td><td> Thermo-Fisher Scientific </td><td> L3484 </td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento, expansão e indução de adipogenic de cd34 + cd31 + células endoteliais de tecido adiposo humano de omental e subcutâneo

Isolation, Expansion, and Adipogenic Induction of CD34+CD31+ Endothelial Cells from Human Omental and Subcutaneous Adipose Tissue

A obesidade é acompanhada por uma extensa remodelação do tecido adiposo, principalmente através de hipertrofia dos adipócitos. Crescimento extremo dos adipócitos resulta em uma má resposta à insulina, hipóxia local e inflamação. Estimulando a diferenciação dos adipócitos brancos funcionais de progenitores, hipertrofia radical da população adipócito pode ser prevenida e, consequentemente, melhorar a saúde metabólica do tecido adiposo juntamente com uma redução de inflamação. Também, estimulando uma diferenciação dos adipócitos bege/marrom, o gasto de energia total do corpo pode ser aumentado, resultando em perda de peso. Esta abordagem poderia impedir o desenvolvimento de co-morbidades como diabetes tipo 2 e doença cardiovascular obesidade.
Este artigo descreve o isolamento, expansão e diferenciação dos adipócitos brancos e bege de um subconjunto de células endoteliais de tecido adiposo humano que expressam co os marcadores CD31 e CD34. O método é relativamente barato e não é trabalhoso. Ele requer acesso ao tecido adiposo humano e é adequado para amostragem o depósito subcutâneo. Para este protocolo, amostras de tecido adiposo fresco de indivíduos obesos mórbidos [índice de massa corporal (IMC) > 35] são recolhidos durante os procedimentos de cirurgia bariátrica. Usando um immunoseparation sequencial da fracção vascular do estroma, células suficientes são produzidas a partir de tão pouco como 2 – 3 g de gordura. Estas células podem ser expandidas em cultura durante 10 a 14 dias, podem ser criopreservadas e mantém suas propriedades de adipogenic com passagem até passagem 5 – 6. As células são tratadas por 14 dias com um coquetel, usando uma combinação de insulina humana e o agonista do PPARγ-rosiglitazone de adipogenic.
Esta metodologia pode ser usada para a obtenção de prova dos experimentos de conceito sobre os mecanismos moleculares que conduzem a respostas adipogenic nas células endoteliais adiposas, ou para a seleção de novos medicamentos que podem melhorar o adipogenic resposta dirigido também para o branco ou diferenciação dos adipócitos bege/marrom. Usando pequenas biópsias subcutâneas, esta metodologia pode ser usada para filtrar os assuntos não-Respondente para ensaios clínicos vistos estimular adipócitos bege/marrom e brancos para o tratamento da obesidade e co-morbidades.

Nosso protocolo visa proporcionar uma abordagem in vitro para determinar o potencial de adipogenic de CD34 + CD31 + vascular em células de diferentes depósitos de tecido adiposo humano. Um diagrama de fluxograma simplificado é mostrado na figura 1A. O primeiro passo usando uma seleção positiva de CD34 expressando células resulta em &gt; 95% células CD34 + na população das células recém isoladas (figura 1A). Importante, e...

A diferenciação dos adipócitos brancos e bege de tecido adiposo vascular progenitores tem potencial para melhoria metabólica em obesidade. Descrevemos os protocolos para um CD34 + CD31 + isolamento de células endoteliais de gordura humana e uma subsequente em vitro expansão e diferenciação em adipócitos brancos e bege. Diversas aplicações a jusante são discutidas.

Isolamento, expansão e indução de Adipogenic de CD34 + CD31 + células endoteliais de tecido adiposo humano de Omental e subcutâneo

Obesity is accompanied by an extensive remodeling of adipose tissue primarily via adipocyte hypertrophy. Extreme adipocyte growth results in a poor ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da obesidade, como identificar os principais fatores e mecanismos que impedem uma resposta adipogênica robusta durante a remodelação do tecido adiposo. A principal vantagem dessa técnica é que ela permite o isolamento de células endoteliais CD34+CD31+do tecido adiposo humano, começando com pequenas quantidades de tecido. Tivemos a ideia desse método pela primeira vez quando queríamos identificar células na vasculatura adiposa humana que respondem à estimulação adipogênica.A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de isolamento celular são difíceis de praticar devido ao acesso muitas vezes limitado ao tecido adiposo humano fresco. Colete tecido adiposo omental e subcutâneo humano de seres humanos submetidos à cirurgia bariátrica. Imediatamente após a extração do tecido, mantenha o tecido adiposo omental e subcutâneo humano em frascos separados contendo a solução salina tamponada de Hank com 50 microgramas por mililitro de estreptomicina de penicilina à temperatura ambiente.Assim que a amostra chegar ao laboratório após a extração do tecido, limpe e remova cuidadosamente as seções fibróticas e cauterizad

isolation-expansion-adipogenic-induction-cd34-cd31-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra uma técnica para isolar e cultivar células-tronco derivadas do tecido adiposo do arco periaórtico murino marcadas com fluorescência (ADSCs) do tecido adiposo do arco periaórtico murino. Após o isolamento, os NCADSCs são detectados, classificados usando classificação de células ativadas por fluorescência e, posteriormente, cultivados em uma placa, promovendo a proliferação celular.

Isolando células-tronco derivadas de tecido adiposo do tecido adiposo periaórtico murino

A heterogeneidade transcricional dentro das células estromais derivadas do tecido adiposo humano pode ser definida no nível de célula única usando marcadores de superfície celular e genes osteogênicos.  Descrevemos um protocolo que utiliza citometria de fluxo para o isolamento de subpopulações celulares com potencial osteogênico aumentado, que pode ser usado para melhorar a reconstrução esquelética craniofacial.

Isolamento e Enriquecimento da Human adiposo-derivadas células estromais para Osteogenesis Aprimorado

Aqui, relatamos um método para o isolamento das populações de células progênitentes de adipócitos (APC) do tecido de tecido adiposo perivascular (PVAT) usando a classificação celular celular ativada por magnética (MCS). Este método permite um maior isolamento de APC por grama de tecido adiposo quando comparado à Classificação de células ativadas por fluorescência (FACS).

Expansão e adipogênese Indução de progenitores de adipócitos do tecido adiposo perivascular isolado pela classificação de células ativadas magnéticas

Este protocolo descreve a abordagem técnica para isolar subpopulações de células estromais adipogênicas e fibroinflamatórias de depósitos de tecido adiposo branco intra-abdominal murino (WAT) por classificação de células ativadas por fluorescência ou separação de esferas imunomagnéticas.

Isolamento de Subpopulações de Células Estromais Adipogênicas e Fibro-Inflamatórias de Depósitos Adiposos Intra-Abdominais Murinos

Apresentamos um método simples para isolar células progenitoras adiposas altamente viáveis de almofadas de gordura epidímica do rato usando a triagem celular ativada por fluorescência.

Preparação de células progenitoras adiposas adiposas de tecidos adiposos epidímicos do rato

Este protocolo detalha um método para a dissecção de depósitos adiposos de camundongos e o isolamento e digestão das respectivas artérias para liberar e, em seguida, identificar a população de células endoteliais. Células recém-isoladas usadas em aplicações a jusante avançarão na compreensão da biologia celular vascular e dos mecanismos de disfunção vascular.

Isolamento e Identificação de Células Endoteliais Vasculares de Depósitos Adiposos Distintos para Aplicações a Jusante

Este protocolo descreve uma metodologia para isolar e identificar células-tronco mesenquimais (CTMs) derivadas do tecido adiposo de ratos Sprague Dawley.

Isolamento e Identificação de Células-Tronco Mesenquimais Derivadas do Tecido Adiposo de Ratos Sprague Dawley

Este protocolo descreve o isolamento semi-automatizado da fração vascular estromal (FVS) do tecido adiposo murino para obtenção de pré-adipócitos e diferenciação de adipócitos in vitro. O uso de um dissociador tecidual para digestão da colagenase reduz a variação experimental e aumenta a reprodutibilidade.

Isolamento Semi-Automatizado da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Branco Murino Usando um Dissociador de Tecido

Descrevemos o isolamento, a cultura e a indução adipogênica de pré-adipócitos derivados da fração vascular estromal do tecido adiposo periaórtico de camundongos, permitindo o estudo da função do tecido adiposo perivascular e sua relação com as células vasculares.

Isolamento, Cultura e Indução Adipogênica de Pré-adipócitos Derivados da Fração Vascular Estromal do Tecido Adiposo Periaórtico de Camundongos

O tecido adiposo é uma excelente fonte de células-tronco mesenquimais. Aqui, trazemos a extração, cultivo e caracterização passo a passo de células-tronco derivadas do tecido adiposo (ADSCs) do tecido adiposo epididimal de camundongos suíços.

Isolamento, expansão in vitro e caracterização de células-tronco mesenquimais do tecido adiposo epididimal de camundongos

O tamanho e a fragilidade dos adipócitos maduros limitaram as técnicas e ferramentas disponíveis para seu estudo e isolamento. Aqui, é descrito um protocolo para o isolamento de adipócitos murinos maduros, que pode ser facilmente adaptado para diferentes depósitos adiposos e dietas de camundongos.

Isolamento e cultura de adipócitos murinos primários de camundongos magros e obesos

Aprenda a isolar células endoteliais CD34+CD31+ de tecido adiposo humano e diferenciá-las em adipócitos brancos e bege. Este método avança a pesquisa sobre obesidade e remodelamento tecidual.

Isolamento, expansão e indução de Adipogenic de CD34 + CD31 + células endoteliais de tecido adiposo humano de Omental e subcutâneo (Vídeo) | JoVE Journal

Isolamento, expansão e indução de Adipogenic de CD34 + CD31 + células endoteliais de tecido adiposo humano de Omental e subcutâneo

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