Name: Em pequena escala colorimétrica ensaios de intracelular lactato e piruvato no nemátode Caenorhabditis elegans (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Aprenda a extrair e quantificar lactato e piruvato em Caenorhabditis elegans usando ensaios colorimétricos de pequena escala. Este método demonstra a importância da precipitação de proteínas para análises bioquímicas precisas.

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Este trabalho foi apoiado financeiramente por uma bolsa de investigação especial de Daito Bunka University para Sumino Yanase.

1. sincronizada cultura de c. elegans
<ol><li>Antes da semeadura, cultura de Escherichia coli (e. coli) estirpe OP50 durante a noite a 37 ° C em 300 mL de meio líquido de caldo de Luria-Bertani (LB). Armazenar o OP50 cultivadas a-4 ° C.<ol>
<li>Para tornar o meio líquido do caldo LB, usar 10g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g de NaCl e 1,5 mL de 1 NaOH de N e adicionar a 1 L com água desionizada. Autoclave. Nota: OP50 e c. elegans cepas estão disponíveis a partir do centro de genética Caenorhabditis (Universidade de Minnesota, St. Paul, MN, EUA).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Para tornar o ágar de nematoides crescimento médio (NGM), use 3 g de NaCl, 2,5 g de peptona, 17 g de ágar-ágar e 975 mL de água desionizada. Autoclave. Legal a 55 ° C, então sterilely adicionar, em ordem, 1 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de 1 M CaCl2, 1ml de colesterol de 5 mg/mL em EtOH e 25 mL de fosfato de potássio 1m pH 6.0 em 90-mm placas de Petri.<ol>
<li>Para 1m de potássio fosfato pH 6.0, use 108,3 g de KH2PO4 e 46,6 g de K2HPO4e adicionar água desionizada para 1 L. Autoclave6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Espalhou-se 1 a 2 mL da OP50 cultivadas em placas de ágar a NGM. Para fazer uma camada fina de OP50, Incube as placas durante a noite à temperatura ambiente antes de adicionar qualquer nematoides. Nota: As NGM placas de ágar que inoculado OP50 podem ser armazenados à temperatura ambiente por 2-3 semanas.</li>
	<li>Adicione pelo menos 100 minhocas em uma placa de ágar NGM com OP50 e cultura a 20 ° C até a fase adulta. Pelo menos três placas são necessárias.</li>
	<li>Para coletar os ovos no útero, transferir gravid hermafroditas das três NGM placas de ágar cada com 5 mL de tampão de S em um tubo cônico de 15 mL e lavar os vermes 3 vezes com 15 mL de tampão de S usando centrifugação a 300 x g durante 30 s, à temperatura ambiente.<ol>
<li>Para tornar o buffer de S, use 5,9 g de NaCl e 50 mL de 1m potássio fosfato pH 6.0, adicione 1 L com água desionizada. Autoclave6.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Dissolver os vermes em uma solução de hipoclorito alcalino para axenization e isolamento de ovo a granel (0,5 mL de lixívia fresca ou equivalente: 5-6% de hipoclorito de sódio, 0,1 mL de NaOH de M 10, aproximadamente 4,5 mL de tampão de S)6, e defendemos a solução 10-15min no temperatura ambiente com a mistura por inversão. Nota: Dentro de 15min, vermes adultos devem dissolver-se, deixando uma solução nebulosa de ovos libertados de suas carcaças (os ovos liberados devem ser confirmados usando um microscópio estereoscópico). Em vez de 0,1 mL de NaOH de 10 N, 0,2 mL de NaOH de N 5 também pode ser usado.</li>
	<li>Após o tratamento de hipoclorito, lavar o sedimento de ovo 3 vezes com 15 mL de tampão de S e ressuspender em 5-6 mL de tampão de S. Chocar os ovos liberados durante uma incubação durante a noite a 20 ° C no buffer de S sem Escherichia coli para uma cultura da idade-síncrono de larvas L1.</li>
	<li>Para determinar o número aproximado de larvas L1, contar os vermes usando um microscópio estereoscópico em 10 µ l de tampão de S após resuspending as larvas de pelo menos 3 vezes e calcular a média. Em seguida, transferir as larvas L1 para cinco placas de ágar NGM com OP50 (1.500-3.000 vermes por placa usando um prato de Petri de 90 mm) e cultura a 20 ° C até que eles têm crescido a fase adulta jovem, quando começa a autopolinização e alguns ovos (normalmente depois de 3-d ays).</li>
</ol>2. a extração da fração celular de c. elegans
<ol><li>Recolha os jovens em fase adulta (animais de 5 dias de idade) vermes das cinco placas de ágar NGM com buffer de S (figura 1A).<ol>
<li>Para selecionar apenas os vermes vivos usando o método de sacarose6 para flutuação em sacarose 30% (p/v), misture os vermes suspendidos em 3-4 mL de tampão de S com um volume igual de sacarose gelada de 60% (p/v) em um tubo cônico de 15 mL. Girar o tubo a 1.500 x g durante 15 s a 4 ° C e remover o flutuante vermes em um tubo de fresco, deslocando-os para fora da parede do tubo com uma pipeta Pasteur.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Lave os vermes 3 vezes com tampão de S por centrifugação a 1.500 x g por 30 s a 4 ° C. Verifique o volume molhado de vermes lavados após a centrifugação utilizando uma ponta de micropipeta de 1.000 µ l (figura 1B).</li>
	<li>Adicione os vermes lavados para um volume igual de gelada 10% (p/v) de ácido tricloroacético (TCA; concentração final de 5%) para a precipitação de proteínas (Figura 1). Em vez de TCA, ácido perclórico (PCA) ou ácido metafosfórico pode ser usado.</li>
	<li>Homogeneizar os vermes com o dessensibilizador usando 40 golpes de um pilão em um homogeneizador de Teflon (Potter-Elvehjem moedor de tecido) com rotação de até 1.300 rpm no gelo.</li>
	<li>Transferir o homogeneizado em um microtubo de 1,5 mL fresco com uma pipeta Pasteur e proceda à sonicação usando um homogeneizador ultra-sônico por 3 min (3 tempos de 1 min), com um ciclo de trabalho de 20% no gelo.</li>
	<li>Clarificar o homogeneizado por centrifugação a 8.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Neutralizar os sobrenadantes com 4 M de KOH (volume de 0,25 a 10% TCA) por 20 min no gelo e centrifugar 8.000 x g por 10 min a 4 ° C. O sobrenadante (como uma amostra de teste) pode ser armazenado a-80 ° C até os ensaios seguintes.</li>
</ol>3. lactato ensaio usando um Kit de ensaio Colorimetric
<ol><li>Medir a concentração de lactato nas amostras de teste usando um kit de ensaio colorimetric (Tabela de materiais). Realizar exames de frente e verso para as amostras de ensaio. Adicionar 5 ou 10 µ l das amostras de teste para uma placa de 96 poços e ajustar o volume de 50 µ l por alvéolo com lactato ensaio Buffer fornecido com o kit.</li>
	<li>Para a curva padrão de lactato, diluir 100 mM L (+)-lactato padrão de 1mm com lactato Buffer de ensaio. Adicionar 0, 2, 4, 6, 8 e 10 µ l a 1 mm L (+)-lactato padrão, que é fornecido com o kit, em uma série de poços.</li>
	<li>Adicionar 50 µ l de reação Mix (contendo 46:2:2 de Buffer de ensaio de lactato, Mix de enzima lactato e lactato sonda em DMSO, anidro; todos os reagentes são fornecidos com o kit) ou Mix de controle de Background (contendo 48:2 de Buffer de ensaio de lactato e lactato sonda) em cada poço e incubar a temperatura ambiente por 30-60 min, enquanto as amostras são protegidas da luz.</li>
	<li>Medir a absorvância de cada poço a 570 nm, utilizando um leitor de microplacas e subtrair o valor da absorvância do fundo controle Mix valor da absorvância da mistura da reação.</li>
	<li>Traça a curva padrão de lactato. Calcule as concentrações de lactato das amostras de teste a partir da curva padrão de lactato.</li>
</ol>4. piruvato ensaio usando um Kit de ensaio Colorimetric
<ol><li>Medir a concentração de piruvato nos sobrenadantes (amostras) usando um kit de ensaio colorimetric (Tabela de materiais). Realizar exames de frente e verso para as amostras de ensaio. Adicionar 10 µ l das amostras de teste e 90 µ l de reagente de trabalho (contendo 94:1 da enzima Mix e corante reagente, que são fornecidos com o kit) em uma placa de 96 poços e incubar a temperatura ambiente por 30 min, enquanto as amostras são protegidas da luz.</li>
	<li>Medir a absorvância de cada poço a 570 nm, utilizando um leitor de microplacas.</li>
	<li>Traça a curva padrão de piruvato. Calcule as concentrações de piruvato das amostras de teste a partir da curva padrão de piruvato.</li>
</ol>5. a proteína ensaio para normalização com teor de proteínas
<ol><li>Medir a concentração de proteína nos sobrenadantes (amostras) usando um kit de ensaio colorimetric (Tabela de materiais). No entanto, esta etapa não é limitada a um kit de ensaio, e outras abordagens podem ser utilizadas para medir a concentração de proteína.</li>
	<li>Normalize os valores de concentrações de lactato e piruvato entre as amostras de teste usando cada concentração de proteínas totais. Nota: Concentração de proteínas nas amostras de teste é suficientemente detectada mesmo após a precipitação de proteínas e é utilizada para a etapa de normalização entre as amostras.</li>
</ol>

<ol><li>Warburg, O. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/13298683">On the origin of cancer cells.</a> Science. 123, 309-314 (1956).</li>
<li>Matoba, S., et al. <a target="_blank" href="http://science.sciencemag.org/content/312/5780/1650.full">p53 regulates mitochondrial respiration.</a> Science. 312, 1650-1653 (2006).</li>
<li>Yanase, S., Suda, H., Yasuda, K., Ishii, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+p53%2FCEP-1+is+associated+with+lifespan+extension+through+an+age-related+imbalance+in+the+energy+metabolism+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+to+Cells%22%5BJournal%5D)">Impaired p53/CEP-1 is associated with lifespan extension through an age-related imbalance in the energy metabolism of C. elegans.</a> Genes to Cells. 22 (12), 1004-1010 (2017).</li>
<li>Page, A. P., Johnstone, I. L. The C. elegans. Research Community. The cuticle. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPage%2C+AP+%22WormBook%22">WormBook</a>. , (2007).</li>
<li>Hulme, S. E., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemistry+and+the+worm%3A+Caenorhabditis+elegans+as+a+platform+for+integrating+chemical+and+biological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Chemistry and the worm: Caenorhabditis elegans as a platform for integrating chemical and biological research.</a> Angewandte Chemie International Edition. 50, 4774-4807 (2011).</li>
<li>Lewis, J. A., Fleming, J. T. Basic culture methods. <a target="_blank" href="https://www.elsevier.com/books/caenorhibditus-elegans-modern-biological-analysis-of-an-organism/epstein/978-0-12-564149-4">Methods in Cell Biology, Volume 48, Caenorhabditis elegans: Modern Biological Analysis of an Organism</a>. Epstein, H. F., Shakes, D. C. , Academic Press, Inc. 3-29 (1995).</li>
<li>Senoo-Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+defect+in+the+cytochrome+b+large+subunit+in+complex+II+causes+both+superoxide+anion+overproduction+and+abnormal+energy+metabolism+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A defect in the cytochrome b large subunit in complex II causes both superoxide anion overproduction and abnormal energy metabolism in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (45), 41553-41558 (2001).</li>
<li>Butler, J. A., Mishur, R. J., Bhaskaran, S., Rea, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+metabolic+signature+for+long+life+in+the+Caenorhabditis+elegans+Mit+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">A metabolic signature for long life in the Caenorhabditis elegans Mit mutants.</a> Aging Cell. 12, 130-138 (2013).</li>
<li>Marbach, E. P., Weil, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+enzymatic+measurement+of+blood+lactate+and+pyruvate%3A+Use+and+significance+of+metaphosphoric+acid+as+a+common+precipitant%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid enzymatic measurement of blood lactate and pyruvate: Use and significance of metaphosphoric acid as a common precipitant.</a> Clinical Chemistry. 13 (4), 314-325 (1967).</li>
<li>Mishur, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+metabolites+extend+lifespan%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial metabolites extend lifespan.</a> Aging Cell. 15, 336-348 (2016).</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente.

Utilizando esses kits de ensaio colorimétrico, o passo mais crítico na extração de amostra para detectar celular lactato e piruvato com precisão em c. elegans são o processo de precipitação de proteínas durante a homogeneização (Figura 1). Não é estritamente necessário usar um homogeneizador de Teflon, como outros Homogeneizadores (EG., homogenizacao e afilado moedores de tecido, ou moinhos do grânulo) também são adequados à extração artesanal de vermes. Nós não detectar ce...

Concentrações de lactato e piruvato são amplamente consideradas como intermediários do metabolismo energético e relacionam-se aos Estados da glicólise, ciclo do ácido tricarboxílico (TCA) e cadeia de transporte electrónico, nas células de organismos aeróbios. Uma série de reações na glicólise oxidar a glicose em piruvato, que se encontra numa encruzilhada metabólica e pode ser convertido para hidratos de carbono através da gluconeogénese, ácidos graxos e metabolismo energético através de acetil-CoA e a aminoácido alanina. O ciclo TCA ocorre sob a presença de oxigênio dissolvido suficiente e é fundamental para a conversão de glicose em energia. Especialmente, a alteração do metabolismo secundário é um fenômeno interessante na qual glicólise é usado predominantemente para produção de energia e aeróbia respiração mitocondrial, que envolve o ciclo TCA e cadeia de transporte de elétrons, é ativador em mamíferos câncer células1,2. Nós mostramos recentemente que os níveis de lactato e a relação lactato/piruvato consequente (L/P) diminuiu durante o envelhecimento no organismo modelo Caenorhabditis elegans (c. elegans). Da mesma forma, achamos que os mamíferos tumor supressor p53 ortholog CEP-1 em c. elegans tem um papel importante nas alterações relacionadas com a idade do metabolismo energético através da ativação de seus alvos transcricionais3.
Em ensaios biológicos, tais como a medição das concentrações de lactato e piruvato em células, a sensibilidade, precisão, tamanho da amostra e tempo de incubação de kits de ensaio colorimétrico/fluorimétrica melhoraram dramaticamente. Devido às inovações tecnológicas, agora somos capazes de analisar vários metabólitos e metabólitos intermediários sem a cultura em grande escala de c. elegans, que é difícil, dado o seu pequeno tamanho. Em geral, a sensibilidade de um ensaio colorimétrico é uma ordem de magnitude menor do que um ensaio fluorimétrica; no entanto, a abordagem colorimétrica é mais adequada na configuração dos laboratórios comuns. Além disso, uma técnica de extração contendo precipitação de homogeneização e proteína é crucial para a determinação quantitativa da concentração de lactato e piruvato de células de c. elegans , porque este nematódeo é encerrado em um exoesqueleto chamado a cutícula, ao contrário de células de mamíferos cultivadas linhas4,5. Aqui, descrevemos um protocolo para analisar as concentrações de lactato e piruvato usando kits de ensaio colorimetric comercial, incluindo dicas para extração de amostra de c. elegans.

<table><tbody><tr><td>Kit de Ensaio Colorimétrico/Fluorimétrico de Lactato&nbsp;</td><td>BioVision</td><td>#K607-100</td><td>ensaios colorimétricos/fluorimétricos 100; Armazene a -20oC</td></tr><tr><td>EnzyChrom Pyruvate Assay Kit</td><td> Systems</td><td>#EPYR-100</td><td>colorimetric/fluorometric 100 ensaios; Armazene a -20oC</td></tr><tr><td>Kit de Ensaio de Proteína BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>#23225</td><td>ensaio colorimétrico; armazene em &nbsp; </td></tr><tr><td>Ácido Tricloroacético Wako</td><td>Pure Chemical</td><td>#207-04955</td><td>à temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Homogeneizador de Teflon&nbsp;</td><td>Iwaki/Pyrex</td><td>#358034 (Wheaton)</td><td>Em vez de Iwaki/Pyrex, disponível por Wheaton</td></tr></tbody></table>

em pequena escala colorimétrica ensaios de intracelular lactato e piruvato no nemátode caenorhabditis elegans

Small-Scale Colorimetric Assays of Intracellular Lactate and Pyruvate in the Nematode Caenorhabditis elegans

Lactato e piruvato são chaves intermediários de vias metabólicas de energia intracelular. A relação lactato/piruvato em células de monitoramento ajuda a determinar se há um desequilíbrio no metabolismo de energia relacionadas com a idade entre a fosforilação oxidativa mitocondrial e glicólise aeróbica. Aqui, nós mostramos a utilização de kits de ensaio colorimetric comercial para lactato e piruvato no organismo modelo c. elegans. Recentemente, a sensibilidade e a precisão dos kits ensaio colorimétrico/fluorimétrica melhoraram grandemente pela pesquisa e desenvolvimento realizados por fabricantes de reagente. Os reagentes melhorados permitiram o uso de ensaios de pequena escala com uma placa de 96 poços em c. elegans. Em geral, um ensaio fluorimétrica é superior na sensibilidade de um ensaio colorimétrico; no entanto, a abordagem colorimétrica é mais apropriada para o uso em laboratórios comuns. Outra questão importante nestes ensaios para a determinação quantitativa é a precipitação de proteínas do homogeneizado c. elegans amostras. Em nosso método de precipitação de proteínas, precipitants comuns (ex., ácido tricloroacético, ácido perclórico e ácido metafosfórico) são utilizados para a preparação da amostra. Uma amostra de ensaio livre de proteína é preparada adicionando diretamente dessensibilizador frio (concentração final de 5%) durante a homogeneização.

Usando os ensaios colorimétricos para a determinação quantitativa da concentração de lactato e piruvato, mostramos a precisão destes ensaios em comparação com os relatórios anteriores em c. elegans7,8. Aqui, o processo de precipitação de proteínas durante a extração da amostra foi a etapa mais crucial para gerar valores precisos. Para a precipitação de proteínas, precipitants comuns (ex., TCA, PCA, ou ácido metaf...

Nós descrevemos uma extração de pequena escala modificada e ensaios colorimétricos de lactato e piruvato no nemátodo elegans do c.. Quando utilizando kits de ensaio comercial, o desenvolvimento técnico da sua sensibilidade e a precisão é importante. Precipitação de proteínas em extração é o passo mais crítico para a determinação quantitativa de metabólitos intracelulares.

Em pequena escala colorimétrica ensaios de intracelular lactato e piruvato no nemátode Caenorhabditis elegans

Lactate and pyruvate are key intermediates of intracellular energy metabolic pathways. Monitoring the lactate/pyruvate ratio in cells helps to determine ...

Esta pesquisa pode ajudar a responder a quaisquer perguntas neles na contagem de bioquímicos e no campo da metodologia, como a análise dos direitos de desenvolvimento no nematoide. A principal vantagem dessa técnica é a precipitação proteica na extradução e bebida e homogeneização dos vermes. Inicie este experimento cultivando a cepa E.coli OP50 em 300 mililitros de caldo LB médio líquido a 37 graus Celsius durante a noite.Armazene op50 bem sucedido a quatro graus Celsius. Pipeta dois mililitros do op50 cultivado no mínimo três NGM previamente preparado, ou Placas de Agar de Mídia de Crescimento Nematode e espalhados à mão girando a placa. Incubar as placas à temperatura ambiente durante a noite para criar uma fina camada de OP50.Em seguida, use um palito estéril para escolher um pedaço de ágar de uma placa com vermes, para adicionar pelo menos 100 worms a cada placa OP50 NGM. Cultura pelo menos três placas com os vermes a 20 graus Celsius, até que os vermes cheguem ao estágio adulto, o que é confirmado sob microscópio estereoscópico. Localize hermafroditas gravid cheias de ovos usando um microscópio estereoscópico.Depois de adicionar cinco mililitros de tampão S às placas, use a pipeta Pasteur para transferir os vermes das três placas para um tubo cônico de 15 mililitros. Lave os vermes três vezes adicionando 15 mililitros de S-buffer e, em seguida, centrifugando a 300 vezes G à temperatura ambiente por 30 segundos. Se o volume de tampão S exceder cinco mililitros, remova o excesso de buffer após a centrifugação.Para exonização bem sucedida e isolamento de ovos a granel, dissolva os vermes em 0,5 mililitros de solução alcalina de hipo clorato. Misture invertendo e incubando à temperatura ambiente por 10 a 15 minutos. Centrifugar a 1.400 RPM por 30 segundos para remover a solução.Use 15 mililitros de tampão-S para lavar a pelota de ovo. Depois de centrifuá-lo remova o supernasce e repita esta lavagem pelo menos três vezes. Após a última lavagem, suspendemos a pelota em cinco a seis mililitros de S-buffer, sem E.coli e incubamos os ovos durante a noite a 20 graus Celsius para eclodi-los e alcançar a cultura síncrona H de larvas de estágio L1.Pipeta 10 microliters de S-buffer contendo worms L1 em três deslizamentos de tampa. Conte as larvas sob um microscópio estereoscópico e calcule a média para determinar o número aproximado de larvas do estágio L1. Finalmente, transfira as larvas do estágio L1 para cinco placas de NGM Agar com OP50 e plante-as a 20 graus Celsius até a fase adulta jovem, durante a qual ocorre a auto-fertilização e alguns ovos são colocados.Observe os vermes todos os dias sob o microscópio e, em seguida, colete o jovem adulto, ou vermes de cinco dias de idade. Para selecionar apenas vermes vivos, adicione os vermes suspensos em três a quatro mililitros de tampão-S a um tubo cônico de 15 mililitros. Em seguida, adicione um volume igual de sacarose gelada de 60% e misture.Centrifugar o tubo a 1.500 vezes G a 4 graus Celsius por 15 segundos. Em seguida, use uma pipeta Pasteur para mover cuidadosamente os vermes da parede do tubo, e, em seguida, remover os vermes flutuantes em um tubo fresco. Encha o tubo com tampão S para lavar os vermes, e centrífuga a 1500 vezes G a quatro graus Celsius por 30 segundos.Retire o buffer e repita a lavagem mais duas vezes. Após a terceira lavagem, remova cuidadosamente o supernascer, certificando-se de não remover nenhum verme, e use uma ponta de pipeta de 1.000 microliter para medir o volume úmido dos vermes lavados. Para precipitação proteica, use uma pipeta Pasteur para adicionar os vermes lavados a um volume igual de ácido 10% tricloroacético em um homogeneizador colocado no gelo.Homogeneize usando 40 traçados de passel com rotação, até 1.300 RPM. Use um homogeneizador ultrassônico com ciclo de 20% de dever para sonicar o homogeneizado. Use uma pipeta Pasteur para transferir o tubo homogeneado para 1,5 mililitro colocado no gelo.Depois de transferir o homogeneizado para um tubo de micro centrífuga, centrífuga a 8.000 vezes G a quatro graus Celsius por 10 minutos para esclarecê-lo. Transfira o supernante para um tubo fresco e adicione quatro cloreto de potássio molar e incubar no gelo por 20 minutos para neutralizá-lo. Em seguida, centrifuá-lo a 8.000 vezes G a quatro graus Celsius por 10 minutos.Transfira o supernante para um tubo fresco e armazene a 80 graus Celsius até que seja necessário para mais ensaios. Para medir a concentração de lactato, utilize um kit de ensaio colorimétrico para realizar análises duplicadas para as amostras de ensaio. Adicione 10 microliters das amostras de ensaio a cada poço de uma placa de 96 poços e, em seguida, adicione o tampão de ensaio de lactato a cada amostra para ajustar o volume a 15 microliters.Diluir 100 milimólares L+Lactato Padrão com tampão de ensaio de lactato para um milimiliar. Em seguida, em uma série de poços, adicione zero, dois, quatro, seis, oito e 10 microliters de L+Lactate Standard diluído. Adicione 50 microliters de mistura de reação a cada poço, e incubar à temperatura ambiente protegido da luz por pelo menos 30 minutos para que a cor se desenvolva.Por fim, use um leitor de microplacão para medir a absorção de cada poço em 570 nanômetros. Subtraia a absorvância da mistura de controle de fundo a partir da absorvância da mistura de reação. Em seguida, plote a curva padrão de lactato e calcule as concentrações de lactato da curva multiplicando cada concentração por 2,25.Use um kit de ensaio colorimétrico para medir a concentração de piruvato nas amostras de teste e realize exames duplex. Adicione 10 microliters das amostras de teste a diferentes poços de uma placa de 96 poços, e adicione 90 microliters de reagente de trabalho a cada amostra. Incubar coberto por 30 minutos em temperatura ambiente.Em seguida, coloque a placa no leitor de microplacões para medir a absorção de cada poço em 570 nanômetros. Plote a curva padrão do piruvato e calcule as concentrações do piruvato a partir da curva padrão multiplicando cada concentração por 2,25. E, finalmente, para medir a concentração de proteína nas amostras de teste, use um kit de ensaio colorimétrico conforme descrito no protocolo de texto.Após a precipitação proteica, os ensaios colorimétricos podem ser usados para a determinação quantitativa das concentrações de lactato e piruvato. Este experimento mostra a precisão dos ensaios colorimétricos contrários aos relatórios anteriores em C.Elegans. Além disso, esses ensaios são suficientemente sensíveis para medir concentrações de lactato e piruvato, mesmo em amostras de pequena escala em um curto período de tempo.Para detectar com precisão lactato e piruvato em C.elegans, é crucial realizar precipitação proteica durante a homogeneização dos vermes. A quantidade de lactato e piruvato detectados é maior quando as amostras são progaméticas precipitadas durante a homogeneização, em comparação com a fração citosolica intacta ou após a homogeneização quando não havia lactato ou piruvato detectado.

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Research

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Biochemistry

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Métodos para avaliar Subcelulares Compartimentos de músculo em C. elegans

Um protocolo é descrito para detecção in vivo de efeitos de inibidores mitocondriais no organismo modelo Caenorhabditis elegans e para identificação de potenciais compostos potenciadores. Este protocolo pode ser usado para rastrear bibliotecas de medicamentos em busca de compostos que modulam a função mitocondrial.

A rastreï¿½el<em&gt; In Vivo</em&gt; Ensaio para mitocondrial Modulators Usando Transgenic Bioluminescent<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Apresentamos uma configuração e protocolo de gravação de comportamento que permitem análise automatizada do nematóide, preferência de Caenorhabditis elegans por compostos solúveis em um ensaio populacional. Este artigo descreve a construção de uma câmara de comportamento, o protocolo de ensaio comportamental e o uso de software de análise de vídeo.

Análise automatizada de um ensaio de preferência quimiossensorial baseado na população de um nematodo

Um guia passo a passo para sondar a perda da acidez dos lisossomos no intestino de c. elegans usando o corante vital sensíveis ao pH 6 - carboxi - 2', 7'-diclorofluoresceína diacetato...

Avaliação dos lisossomos Alkalinization no intestino de viver elegans de Caenorhabditis

Este protocolo descreve como medir a permeabilidade intestinal de Caenorhabditis elegans. Este método é útil para a pesquisa biológica básica sobre a saúde intestinal relacionada à interação entre bactérias intestinais e seu hospedeiro e para triagem para identificar agentes probióticos e químicos para curar a síndrome do intestino com vazamento e doenças inflamatórias intestinais.

Medindo os efeitos de bactérias e produtos químicos sobre a permeabilidade intestinal de Caenorhabditis elegans

Este estudo apresenta protocolos para duas abordagens semi-automatizadas de análise de atividade locomotor em C. elegans complexo I disease gas-1(fc21) worms, ou seja, ZebraLab (um ensaio de rendimento médio) e WormScan (um ensaio de alto rendimento) e fornecem análise comparativa entre uma ampla gama de métodos de pesquisa para quantificar o comportamento nematoides e função neuromuscular integrada.

Análise comparativa de métodos experimentais para quantificar a atividade animal em Caenorhabditis elegans Modelos de Doença Mitocondrial

O ensino de ciências biológicas pode ser mais estimulante para os alunos por meio do uso da experimentação. Este manuscrito apresenta dois protocolos diferentes, porém complementares, que podem ser utilizados em sala de aula para incentivar os alunos a formular e testar hipóteses relacionadas a dietas hipercalóricas, fome e envelhecimento.

Usando corantes de baixo custo para visualizar o acúmulo de glicogênio e a integridade intestinal em Caenorhabditis elegans

Aprenda a extrair e quantificar lactato e piruvato em Caenorhabditis elegans usando ensaios colorimétricos de pequena escala. Este método demonstra a importância da precipitação de proteínas para análises bioquímicas precisas.

Em pequena escala colorimétrica ensaios de intracelular lactato e piruvato no nemátode Caenorhabditis elegans

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