Multimodal volumétrico Retinal Imaging pelo oblíquo digitalização Laser Oftalmoscopia (oSLO) e a tomografia de coerência óptica (OCT)

Aqui, apresentamos um protocolo para obter um grande campo de visão (FOV) tridimensional (3D) fluorescência e imagem retiniana OCT usando uma romance plataforma multimodal de imagens. Apresentaremos na configuração do sistema, o método de alinhamento e os protocolos operacionais. Imagem latente na vivo será demonstrada, e serão fornecidos resultados representativos.

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da oftalmologia e da imagem da retina. Como imagem e quantificação da ruptura da barreira sangue-retina e funções capilares da retina. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode obter um grande campo de visão, imagens retinianas tridimensionais e multi-contraste, usando um laser de varredura oblíqua em uma única varredura raster.

As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico de retinopatia diabética e outras doenças pré-retinianas. Porque o oSLO pode obter imagens de alto contraste da microvasculatura da retina, até capilares únicos em 3D. Embora esse método possa fornecer informações sobre imagens da retina, ele também pode ser aplicado a outros sistemas de imagem usando lentes objetivas convencionais.

Como imagens in vivo do córtex de camundongo. Uma fonte de laser supercontínua é usada como fonte de laser do sistema para a oftalmoscopia a laser de varredura oblíqua ou configuração oSLO. A faixa de luz visível é separada da faixa de comprimento de onda mais alta pelo primeiro espelho dicróico.

O espectro de luz é expandido com um par de prismas dispersivos, depois que o feixe passa por um divisor de feixe de polarização. Uma fenda é usada para selecionar a faixa de comprimento de onda de excitação. E um espelho reflexivo reflete o feixe filtrado de volta ao par de prismas para acoplar a luz em uma fibra monomodo.

Um espectrômetro é usado para confirmar a seleção do comprimento de onda na saída da fibra monomodo. A fibra monomodo é conectada a dois acopladores de fibra óptica em cascata. Uma das portas de saída de fibra do segundo acoplador de fibra fornece a luz para o sistema oSLO.

Para colimar o laser no sistema oSLO, o laser é desviado por um espelho galvanômetro. Um sistema de telescópio um-para-um retransmite o laser para um segundo espelho galvanômetro, e um sistema de telescópio três-para-um retransmite ainda mais o laser para a pupila do olho. Um espelho dicróico dentro do sistema de telescópio de três para um reflete os sinais fluorescentes.

O sistema de telescópio três para um e o espelho dicróico são montados em um controle deslizante de cauda de andorinha personalizado para compensar o eixo óptico e criar a iluminação de varredura oblíqua. A iluminação oblíqua permite a imagem de fluorescência volumétrica sem a necessidade de seccionamento. Ao deslocar o laser, um feixe oblíquo é focado na retina e, em seguida, a detecção oblíqua pode capturar uma imagem de fluorescência tomográfica ao longo do caminho do feixe oblíquo.

Para criar o caminho óptico da imagem de fluorescência, a fluorescência é refletida pelo espelho dicróico e retransmitida para o terceiro espelho galvanômetro. A luz fluorescente é então retransmitida para uma lente objetiva de imagem por outro sistema de telescópio um-para-um. Dois estágios de tradução adicionais são instalados sob o terceiro espelho galvanômetro para fornecer redundância nos graus de liberdade para otimizar a imagem.

O sistema de imagem final é montado em um palco que tem três graus de liberdade. Rotação e dois eixos de translação. Uma câmera planar é usada para capturar as imagens de fluorescência transversais.

Outro espelho dicróico separa a faixa infravermelha traseira da luz restante. Um filtro passa-longo é usado para limitar ainda mais a largura de banda a 800 a 900 nanômetros. Acople o feixe em uma fibra monomodo.

A fibra monomodo é conectada à outra porta de entrada dos dois acopladores de fibra óptica em cascata para combinar com a excitação oSLO azul. A luz da segunda porta de saída do segundo acoplador de fibra é direcionada para o braço de referência OCT. Que possui placas de compensação de dispersão, filtro de densidade neutra variável e espelho reflexivo.

O retorno de luz do braço de referência e do olho se recombina no segundo acoplador de fibra óptica e é entregue ao espectrômetro OCT para coletar o sinal. Use um software de sistema de aquisição de dados escrito em Labview e modificado a partir do protocolo de varredura OCTA. Para cada b-scan, um dente de serra de ciclo de trabalho de 80% com 500 etapas é emitido por uma placa de saída analógica para controlar o espelho de varredura rápida x-prime.

Acione a câmera de varredura de linha em cada etapa para adquirir dados para a OCT, somente quando o espelho estiver na direção de varredura para frente. Defina o tempo de exposição da câmera de varredura de linha para 17 microssegundos. Para adquirir o sinal OCTA, repita a medição cinco vezes no mesmo local de b-scan.

Defina a taxa de saída AO em 100 kilohertz e a taxa de linha A OCT em 50 kilohertz. Controle o espelho de varredura lenta y-prime, GM1, por uma forma de onda crescente. Sincronize o espelho de devarredura, GM3, com GM1 para desfazer a varredura lenta.

Acione a câmera plana por outra placa de saída analógica para capturar uma imagem fluorescente em cada local y-prime. Corte o tamanho da imagem ou coloque os pixels vizinhos no compartimento para aumentar a velocidade e a sensibilidade conforme desejado. Comece confirmando um nível adequado de anestesia no rato por falta de reflexo de retirada durante uma pinça intradigital.

Após a indução da anestesia, coloque o rato em um suporte. Instale um cone nasal para manter a anestesia durante o restante do experimento. Aplique solução oftálmica de cloridrato de tetracaína 5 no olho do rato para anestesia local.

Em seguida, dilate a pupila com solução oftálmica de tropicamida a 1%. Após dois minutos de dilatação, use uma seringa de um mililitro e uma agulha de calibre 29 para injetar 10% de fluoresceína ou 10% de FITC diluído em solução salina através da veia da cauda. Em seguida, ligue a fonte de laser e coloque um filtro de densidade neutra para atenuar a excitação da luz azul durante o alinhamento.

Meça a potência da luz azul, garantindo que seja inferior a 10 microwatts. Em seguida, mude para a luz de tomografia de coerência óptica, garantindo que esteja perto de 8 miliwatts. Ligue a fonte de alimentação do espelho do galvanômetro, que é usado para controlar a direção do laser.

Ajuste a altura do globo ocular para fazer um ponto de laser estacionário na córnea. Ajuste a posição dos olhos para tornar a borda da pupila aproximadamente perpendicular ao laser. E desloque o laser para cerca de 1,5 milímetros do centro apical do olho.

Ajuste ainda mais o suporte do animal até que as imagens de tomografia de coerência óptica atinjam a qualidade ideal. Na direção de varredura rápida x-prime, certifique-se de que a imagem de varredura b transversal pareça plana. Ao alternar para a direção de varredura lenta y-prime, certifique-se de que a imagem de varredura b da seção transversal apareça inclinada devido à varredura oblíqua.

Remova o filtro de densidade neutra para a excitação da luz azul. E monitore o feed em tempo real da câmera. Uma imagem fluorescente transversal deve aparecer mostrando vasos sanguíneos em diferentes profundidades.

Ajuste o foco do sistema de imagem de fluorescência final para alcançar o foco ideal. E realize ajustes finos da posição do olho no plano lateral para obter a qualidade ideal da imagem oftalmoscopia a laser de varredura oblíqua. Após o alinhamento, comece a adquirir angiografia por tomografia de coerência óptica simultânea e angiografia com fluoresceína volumétrica.

Esta imagem mostra uma imagem de tomografia de coerência óptica transversal de uma retina de rato. Esta é uma angiografia por tomografia de coerência óptica, ou imagem OCTA, da mesma região. E uma oftalmoscopia oblíqua a laser de varredura e angiografia volumétrica com fluoresceína por imagem angiografia com fluoresceína transversal, ou oSLO-VFA.

Análogo ao b-scan de tomografia de coerência óptica. Em comparação com a OCTA, a oftalmoscopia oblíqua a laser de varredura e a imagem transversal da angiografia volumétrica com fluoresceína identificam claramente os capilares na camada plexiforme externa. A camada superficial da retina é mostrada aqui em uma imagem OCTA.

Artefatos na forma de listras verticais são visíveis na imagem. oSLO-VFA evita os artefatos de movimento utilizando contraste de emissão de fluorescência. Dentro da camada intermediária da retina, os vasos de mergulho vertical são claramente mostrados na imagem oSLO FA.

Mas não aparente no OCTA. Ao tentar este procedimento, é importante evitar a exposição contínua do laser ao olho por mais de dois minutos. Evite o ressecamento da córnea e deixe o olho descansar pelo menos 30 segundos entre as seções de imagem, bloqueando a luz.

Após este procedimento, outros métodos, como imagens de camundongos geneticamente modificados para expressar proteínas de fluorescência, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais. Como a forma como tipos específicos de células da retina podem mudar e as variáveis vistas com doenças conhecidas.