Name: Multimodal volumétrico Retinal Imaging pelo oblíquo digitalização Laser Oftalmoscopia (oSLO) e a tomografia de coerência óptica (OCT) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Aprenda a realizar imagem volumétrica multimodal da retina usando oSLO e OCT para visualização tridimensional de capilares retinianos. Este método avança o diagnóstico de retinopatia diabética e doenças pré-retinianas.

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Financiamento é o financiamento de fundação Evans médica do centro médico de Boston, bem como um sub contrato de NIH 5R01CA183101, piloto de BU-CTSI conceder 1UL1TR001430 e programa piloto Joslin BU BU-CTSI KL2TR001411.

Todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (ACUC) de Boston Medical Center e cuidado Animal.
1. configuração do sistema
<ol><li>Sistema de oSLO<ol>
<li>Use uma fonte de laser de supercontinuum como a fonte de sistema laser.<ol>
<li>Separe a gama de luz visível (450 a 650 nm) do intervalo de comprimento de onda maior (650-2000 nm) por um espelho dicroico (DM1). Expanda o espectro com um par de Prismas dispersivos após o feixe passa através de um divisor de feixe de polarização (PBS).</li>
			<li>Lugar uma fenda para selecionar o intervalo de comprimento de onda de excitação (475-495 nm). Use um espelho reflector para refletir o feixe filtrado para o par de prisma e em seguida um par a luz em uma fibra monomodo (SMF 1).</li>
			<li>Use um espectrómetro para confirmar a seleção do comprimento de onda na saída da fibra monomodo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Conectar-se a fibra de modo único para dois acopladores em cascata fibra óptica conforme mostrado na Figura 2. Um da porta de saída da fibra do acoplador da fibra segundo fornece a luz para o sistema de oSLO.</li>
		<li>Desbloqueem o laser primeiro no sistema de oSLO.<ol>
<li>Desvie o laser por um espelho de galvanômetro (GM1). Relé do laser para um segundo espelho de galvanômetro (GM2) por um sistema de telescópio de 1:1 e ainda mais relé para a pupila do olho por um sistema de telescópio de 3:1.</li>
			<li>Instale um espelho dicroico (DM2) dentro do sistema 3:1 telescópio para refletir os sinais de fluorescência.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Monte o sistema do telescópio de 3:1 e o espelho dicroico (DM2) em um slider de cauda de pomba personalizado para compensar o eixo óptico e criar o oblíquo digitalização iluminação conforme mostrado na Figura 3. Use uma pinça para controlar com precisão o comprimento de deslocamento conforme desejado.</li>
		<li>Imagem caminho óptico de fluorescência.<ol>
<li>Refletir a fluorescência pelo espelho dicroico e retransmissão para o terceiro espelho galvanômetro de digitalizar o escaneamento lento.</li>
			<li>Relé da luz de uma lente objetiva de imagem por um outro sistema de telescópio de 1:1. Instale a ótica acima em um estágio da tradução. Nota: Dois estágios de translação adicionais são instalados sob o terceiro espelho galvanômetro (GM3) para fornecer redundância nos graus de liberdade para otimizar a imagem.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Monte um sistema de imagem final num palco que tem três graus de liberdade (rotação e dois eixos da tradução). Use uma câmera planar para capturar as imagens de fluorescência transversal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sistema de tomografia de coerência óptica<ol>
<li>Use a mesma fonte de laser de supercontinuum como a fonte de sistema laser.<ol>
<li>Separe próximo intervalo infravermelho (NIR) (900-650 nm) a luz remanescente (650-2000 nm) por outro espelho dicroico (DM3). Use um filtro passe longo para limitar ainda mais a largura de banda de 800-900 nm. Casal do feixe em uma fibra monomodo (SMF 2).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Conecte a fibra de modo único a outra porta de entrada dos dois engates em cascata de fibra óptica para combinar com a azul da excitação de oSLO. Direcionar a luz do segundo porto saída do segundo acoplador da fibra para o braço de referência OCT, que tem um filtro de densidade neutra variável (VNDF), placas de compensação de dispersão e um espelho reflector. Nota: A luz voltou do braço de referência e o olho recombina no segundo acoplador da fibra óptica e é entregue para o espectrómetro de OCT para coletar o sinal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aquisição de dados<ol>
<li>Use um software de sistema de aquisição de dados escrito em LabVIEW e modificado do protocolo de verificação de OCTA7,8,9,10. Para cada B-scan, um ciclo de trabalho de 80% vi dente com 500 passos é a saída por uma placa de saída analógica (AO1) para controlar o x' espelho de varredura rápido, GM2.</li>
		<li>Acionar a câmera de varredura de linha em cada etapa para adquirir dados da TOC só quando o espelho está na frente direção de digitalização. Defina o tempo de exposição para a câmera de varredura de linha para ser 17 µs.</li>
		<li>Para adquirir o sinal do OCTA, repita a medição 5 vezes no mesmo local B-scan.</li>
		<li>Defina a taxa de saída AO 100 kHz e a taxa de uma linha de OCT de 50 kHz. Controlar o y' espelho varredura lento, GM1, por uma subida de forma de onda. Sincronize o espelho de varredura, GM3, com GM1 de digitalizar o escaneamento lento.</li>
		<li>Acionar a câmera planar por uma outra placa de saída analógica (AO2) para capturar uma imagem fluorescente em cada y' local. O tamanho da imagem latente de culturas ou bin os pixels vizinhos para aumentar a velocidade e a sensibilidade como desejado.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. sistema alinhamento
<ol><li>Ajuste a ranhura na fonte luminosa de oSLO para selecionar o comprimento de onda de excitação azul. Use um espectrómetro para monitorar a faixa espectral para ser ao redor 475-490 nm.</li>
	<li>Ajuste a barra de montagem de cauda de pomba para deslocar o eixo óptico por ~ 5 mm. Isso resultará em um deslocamento para o aluno de rato por ~1.7 mm, resultando em um ângulo oblíquo de ~ 15° na retina.</li>
	<li>Ajuste o estágio da tradução da ótica de deteção de fluorescência a mesma 5 mm.</li>
	<li>Ajuste a fluorescência final de imagem de sistema para ser ~ 30°.</li>
	<li>Medir a potência óptica usando um medidor de energia. Certifique-se que o poder de excitação de oSLO azul é ≤ 0.2 mW e o OCT laser poder ≤0.8 mW, que não causará dano de retina. Nota: Baseado no padrão ANSI, a exposição máxima permissiva (MPE) para a retina é a nível de ~ 2mW7,8 na faixa de luz visível. De acordo com a fórmula por Delori et al . 9, o MPE para o infravermelho próximo é cerca de duas vezes maior do que a luz visível, em cerca de 4 mW.</li>
</ol>3. in Vivo experimento Animal
<ol><li>Transferi um rato Evans longo masculino de 12 semanas na câmara de indução. Anestesia o rato com 4,5% de isoflurano em oxigênio por 10 minutos com uma vazão de 2 L/min por um vaporizador de isoflurano.<ol>
<li>Confirme a profundidade de anestesia conforme determinado pela falta de reflexo de retirada durante uma pitada interdigital.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após a indução, coloque o rato sobre um suporte de 5 eixos (x, y, z traduções, guinada e arremesso). Fornece calor suplementar pelo uso de uma fase aquecida, circula água quente cobertor ou outro método adequado em uma experiência prolongada. Manter a anestesia em 1,5% de isofluorano com uma vazão de 2 litros/minutos durante a parte restante do experimento. Quando não utilizar uma câmara de indução com ativo de exaustão, câmara de indução deve ser colocada sobre uma mesa backdraft ou do downdraft ou sob um snorkel para eliminar o isoflurano.</li>
	<li>Dilate a pupila com solução oftálmica de tropicamida 1% por 2 minutos. Aplica 0,5% HCl tetracaína solução oftálmica no olho do rato para a anestesia local adicional, se necessário. Mantenha o olho hidratado com lágrimas artificiais comerciais pelo menos uma vez cada minuto durante o experimento.</li>
	<li>Injetar fluoresceína sal (10% w/w) ou FITC (10% w/w) diluído em solução salina estéril (0.1-0.3 mL) na veia da cauda com um 1 mL seringa e um 29G agulha.</li>
	<li>Ligue a fonte de laser. Coloque um filtro de densidade neutra para atenuar a excitação de luz azul durante o alinhamento. Medir o poder da OCT para ser ~0.8 mW e a luz azul < 0,01 mW para evitar a formação de catarata.</li>
	<li>Inicie o modo de digitalização e alinhamento do galvanômetro. Ajuste a altura da bola olho para fazer um laser estacionário mancha na córnea. Ajuste a posição do olho de rato para fazer a borda da pupila aproximadamente perpendicular ao laser e compensar o laser ao centro apical do olho de aproximadamente ~1.5 mm.</li>
	<li>Mais ajuste o animal titular até imagens OCT alcançar qualidade ideal. No x' rápida digitalização direção, certifique-se de que a imagem de B-varredura transversal aparece plana. Ao alternar para o y' slow direção de digitalização, verifique se a imagem de B-scan de secção transversal aparece inclinada, devido a digitalização oblíqua.</li>
	<li>Retire o filtro de densidade neutra para a excitação de luz azul e monitorar o alimentação da câmera em tempo real. Imagem fluorescente secional transversal deve aparecer mostrando vasos aparecendo em diferentes profundidades.<ol>
<li>Ajuste o foco da fluorescência final de imagem de sistema para atingir o foco ideal. Permitem ajustes finos da posição do olho no plano lateral para alcançar uma qualidade de imagem ideal oSLO.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após o alinhamento, inicie a aquisição simultânea OCTA e angiografia fluoresceína volumétrico (AGV).</li>
	<li>Construa as imagens volumétricas para OCTA e oSLO pelo Matlab. Os algoritmos são descritos anteriormente no detalhe10. Gere vasculatures da retina profundidade-resolvido por segmentação de imagens.</li>
	<li>Depois de completar a imagem, desligar o laser, liberar o animal e aplicar uma pomada oftálmica nos olhos e em seguida, coloque o animal em uma caixa de recuperação.</li>
	<li>Não deixe o animal autônoma até que recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal ou como por política institucional.</li>
</ol>

<ol><li>Webb, R. H., Hughes, G. W., Delori, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+scanning+laser+ophthalmoscope%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">Confocal scanning laser ophthalmoscope.</a> Applied Optics. 26 (8), 1492-1499 (1987).</li>
<li>Roorda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+scanning+laser+ophthalmoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy.</a> Optics Express. 10 (9), 405-412 (2002).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4638169/">Optical coherence tomography.</a> Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).</li>
<li>de Carlo, T. E., Romano, A., Waheed, N. K., Duker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+optical+coherence+tomography+angiography+%28OCTA%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Retina+and+Vitreous%22%5BJournal%5D)">A review of optical coherence tomography angiography (OCTA).</a> International Journal of Retina and Vitreous. 1 (1), 5(2015).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Optical+Coherence+Tomography+Angiography+of+Choroidal+Neovascularization+in+Age-Related+Macular+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Quantitative Optical Coherence Tomography Angiography of Choroidal Neovascularization in Age-Related Macular Degeneration.</a> Ophthalmology. 121 (7), 1435-1444 (2014).</li>
<li>Chen, C. -L., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+based+angiography+%5BInvited%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography based angiography [Invited].</a> Biomedical Optics Express. 8 (2), 1056-1082 (2017).</li>
<li>Yi, J., Chen, S. Y., Shu, X., Fawzi, A. A., Zhang, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+retinal+imaging+using+visible-light+optical+coherence+tomography+guided+by+scanning+laser+ophthalmoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Human retinal imaging using visible-light optical coherence tomography guided by scanning laser ophthalmoscopy.</a> Biomedical Optics Express. 6 (10), 3701-3713 (2015).</li>
<li>Zhang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-band+spectral-domain+optical+coherence+tomography+for+in+vivo+imaging+the+spectral+contrasts+of+the+retinal+nerve+fiber+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Dual-band spectral-domain optical coherence tomography for in vivo imaging the spectral contrasts of the retinal nerve fiber layer.</a> Optics Express. 19 (20), 19653-19667 (2011).</li>
<li>Delori, F. C., Webb, R. H., Sliney, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximum+permissible+exposures+for+ocular+safety+%28ANSI+2000%29%2C+with+emphasis+on+ophthalmic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Optical+Society+of+America+a-Optics+Image+Science+and+Vision%22%5BJournal%5D)">Maximum permissible exposures for ocular safety (ANSI 2000), with emphasis on ophthalmic devices.</a> Journal of the Optical Society of America a-Optics Image Science and Vision. 24 (5), 1250-1265 (2007).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+fluorescence+retinal+imaging+in+vivo+over+a+30-degree+field+of+view+by+oblique+scanning+laser+ophthalmoscopy+%28oSLO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Volumetric fluorescence retinal imaging in vivo over a 30-degree field of view by oblique scanning laser ophthalmoscopy (oSLO).</a> Biomedical Optics Express. 9 (1), 25-40 (2018).</li>
</ol>

Ji Yi detém uma patente pendente para oSLO. O outro autor (es) declara sem interesses financeiros concorrentes.

Aqui, descrevemos a oSLO, na vivo volumétrico fluorescente imagem da retina técnica com um FOV mais de 30 °. Comparado a OCT, um padrão atual de atendimento imagem método em oftalmologia, oSLO oferece um semelhante de imagem capacidade 3D ainda permite o contraste de fluorescência que OCT não é sensível a. A vantagem de oSLO é que requer apenas uma digitalização raster e, portanto, permite a combinação perfeita de PTU, fornecendo duas técnicas complementares para imagiologia volumétrica estrutural e fluorescente...

Oftalmologia e visão ciência beneficiar muito das modernas técnicas de imagem ópticas, uma vez que a retina pode ser facilmente acessada com luz. Imagem latente retinal da fluorescência é uma ferramenta essencial no diagnóstico e na gestão de choriorétiniennes doenças vasculares tais como a retinopatia diabética (DR) e degeneração macular relacionada à idade (DMRI), ambos os quais são principais causas de cegueira nos Estados Unidos.
No entanto, é ainda um desafio para adquirir um grande campo de visão (FOV), tridimensional imagem usando imagens de fluorescência da retina (3D). Fotografia do fundo não tem a capacidade de resolução de profundidade e não rejeita luz difusa. Como resultado, a mistura de sinais de profundidade diferente reduz a qualidade da imagem. Digitalização Oftalmoscopia do laser (SLO) e confocal pode SLO (cSLO) reduz o efeito de luz difusa usando confocal associada1. No entanto, é difícil para SLO ou cSLO para adquirir uma imagem da retina humana 3D devido ao limite de sua profundidade de foco. Óptica adaptativa SLO (AOSLO) pode fornecer excelente resolução e contraste, corrigindo as aberrações de frente de onda introduzidas pelo olho humano. No entanto, AOSLO ainda precisaria de z-empilhamento para imagiologia volumétrica2. OCT angiografia (OCTA) sistemas de coerência óptica tomografia computadorizada (OCT)3 e superar estas restrições para fornecer tridimensional (3D) imagens anatômicas e vascular4,5,6, mas a natureza sem corantes de outubro não posso Visualizar escapamento indicativo de disfunção vascular.
Este protocolo descreve uma romance plataforma multimodal para retinal fluorescência volumétrico 3D de imagem, ou seja, oblíqua digitalização laser Oftalmoscopia (oSLO). Neste sistema da imagem latente, uma digitalização oblíqua é gerado por um controle deslizante cauda de pomba, e um sistema de imagem final é alinhado em um ângulo para detectar fluorescência Cruz imagens secionais. O sistema utiliza métodos de exploração do laser, e essas técnicas permitem a fácil incorporação com OCT como uma modalidade de imagem estrutural volumétrica complementar. A resolução de profundidade atual é de cerca de 25 µm na retina do rato e o campo de visão é de 30°. Essencialmente, o oSLO permite uma versão fluorescente de outubro e podem ser combinados simultaneamente com OCT e OCTA sobre um grande FOV.
Neste protocolo, descreveremos a configuração de oSLO, o método de alinhamento e de construção, o método de imagem na vivo da retina de ratos e os resultados representativos.

<table><tbody><tr><td>Fonte de laser Supercontinuum</td><td>NKT Photonics</td><td>SuperK EXTREME EXU-OCT6</td><td></td></tr><tr><td>Espelho dicróico (DM1)</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP650R</td><td></td></tr><tr><td>Espelho dicróico (DM2)</td><td>Chroma</td><td>ZT514/1064rpc</td><td></td></tr><tr><td>Espelho dicróico (DM3)</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP900R</td><td></td></tr><tr><td>fibra monomodo (SMF 1)</td><td>Thorlabs</td><td>P3-460B-FC-2</td><td></td></tr><tr><td>Fibra de Modo Único (SMF 2)</td><td>Thorlabs</td><td>P3-780A-FC-2</td><td></td></tr><tr><td>Acoplador de Fibra Óptica</td><td>Thorlabs</td><td>TW850R5A2</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de Telescópio 1:1</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A&times; </td><td></td>2</tr><tr><td>Sistema de Telescópio 3:1</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A&times; </td><td></td>2</tr><tr><td>Sistema de Telescópio 3:1</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-50-A&times; </td><td></td>2</tr><tr><td>Espelhos Galvo (GM1,GM2)</td><td>Thorlabs</td><td>GVS201&times; </td><td></td>2</tr><tr><td>Espelhos Galvo De-sacn (GM3)</td> <td>Thorlabs</td><td>GVS011</td><td></td></tr><tr><td>Lente Objetiva</td><td>Olympus</td><td>UplanSApo 20&vezes;/0.75</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagem final</td><td>Olympus</td><td>UplanFL N 10&vezes;/0.3</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de imagem final</td><td>Computar</td><td>12-36mm/1:2.8</td><td></td></tr><tr><td>Câmera</td><td>PCO</td><td>Pco.pixelfly usb</td><td></td></tr><tr><td>Filtro</td><td>Thorlabs</td><td>FEL0800</td><td></td></tr><tr><td>Montado Continuamente Variável Filtro ND</td><td>Thorlabs</td><td>NDC-50C-4M-A</td><td></td></tr><tr><td>Câmera de Varredura de Linha</td><td>Thorlabs</td><td>SPL2048-140K</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Saída Analógica (AO1)</td>Placa de Saída Analógica <td>PCI-6731</td><td></td> <td>da National Instrument</td></tr><tr><td>(AO2)</td>Filtro <td>passa-longa PCIe-6351</td><td></td> <td>da National Instrument</td></tr><tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>FEL0800</td><td></td></tr></tbody></table>

multimodal volumétrico retinal imaging pelo oblíquo digitalização laser oftalmoscopia (oslo) e a tomografia de coerência óptica (oct)

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy (oSLO) and Optical Coherence Tomography (OCT)

Enquanto imagens de fluorescência é amplamente utilizada em oftalmologia, uma grande campo de visão (FOV) da imagem retiniana tridimensional (3D) de fluorescência é ainda um grande desafio com o estado-da-arte retinal imaging modalidades porque eles exigiria z-empilhamento para Compile um conjunto de dados volumétrico. Nova tomografia de coerência óptica (OCT) e sistemas de angiografia (OCTA) OCT superar estas restrições para fornecer imagens tridimensionais (3D) anatômicas e vasculares, mas a natureza sem corantes da OCT não pode visualizar o escapamento indicativo de vascular disfunção. Este protocolo descreve um romance oblíquo verificação técnica de laser Oftalmoscopia (oSLO) que fornece a imagem da retina de fluorescência volumétrico 3D. A instalação do sistema de geração de imagens gera o oblíquo digitalização por um botão deslizante cauda de pomba e alinha o sistema final de imagem em um ângulo para detectar imagens transversais fluorescentes. O sistema usa o método de exploração do laser e portanto, permite uma fácil incorporação de OCT como uma modalidade de imagem estrutural volumétrica complementar. In vivo da imagem na retina do rato é demonstrada aqui. Solução de fluoresceína é injetada por via intravenosa para produzir angiografia fluoresceína volumétrico (AGV).

Figura 4a mostra uma imagem de OCT transversal de uma retina do rato. Figura 4b -4 c mostram as mesmas imagens transversais da retina de vFA OCTA e oSLO adquiridos ao mesmo tempo. O oSLO permite transversal FA análoga para o B-scan da OCT. Em comparação com OCTA, a imagem de corte transversal de vFA oSLO identifica claramente os vasos na camada de fibras nervosas (NFL) e a camada de células ganglionares (GCL) e c...

Aqui, apresentamos um protocolo para obter um grande campo de visão (FOV) tridimensional (3D) fluorescência e imagem retiniana OCT usando uma romance plataforma multimodal de imagens. Apresentaremos na configuração do sistema, o método de alinhamento e os protocolos operacionais. Imagem latente na vivo será demonstrada, e serão fornecidos resultados representativos.

Multimodal volumétrico Retinal Imaging pelo oblíquo digitalização Laser Oftalmoscopia (oSLO) e a tomografia de coerência óptica (OCT)

While fluorescence imaging is widely used in ophthalmology, a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence retinal image is still a big ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da oftalmologia e da imagem da retina. Como imagem e quantificação da ruptura da barreira sangue-retina e funções capilares da retina. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode obter um grande campo de visão, imagens retinianas tridimensionais e multi-contraste, usando um laser de varredura oblíqua em uma única varredura raster.As implicações dessa técnica se estendem ao diagnóstico de retinopatia diabética e outras doenças pré-retinianas. Porque o oSLO pode obter imagens de alto contraste da microvasculatura da retina, até capilares únicos em 3D. Embora esse método possa fornecer informações sobre imagens da retina, ele também pode ser aplicado a outros sistemas de imagem usando lentes objetivas convencionais.Como imagens in vivo do córtex de camundongo. Uma fonte de laser supercontínua é usada como fonte de laser do sistema para a oftalmoscopia a laser de varredura oblíqua ou configuração oSLO. A faixa de luz visível é separada da faixa de comprimento de onda mais alta pelo primeiro espelho dicróico.O espectro de luz é expandido com um par de prismas dispersivos, depois que o feixe passa por um divisor de feixe de polarização. Uma fenda é usada para selecionar a faixa de comprimento de onda de excitação. E um espelho reflexivo reflete o feixe filtrado de volta ao par de prismas para acoplar a luz em uma fibra monomodo.Um espectrômetro é usado para confirmar a seleção do comprimento de onda na saída da fibra monomodo. A fibra monomodo é conectada a dois acopladores de fibra óptica em cascata. Uma das portas de saída de fibra do segundo acoplador de fibra fornece a luz para o sistema oSLO.Para colimar o laser no sistema oSLO, o laser é desviado por um espelho galvanômetro. Um sistema de telescópio um-para-um retransmite o laser para um segundo espelho galvanômetro, e um sistema de telescópio três-para-um retransmite ainda mais o laser para a pupila do olho. Um espelho dicróico dentro do sistema de telescópio de três para um reflete os sinais fluorescentes.O sistema de telescópio três para um e o espelho dicróico são montados em um controle deslizante de cauda de andorinha personalizado para compensar o eixo óptico e criar a iluminação de varredura oblíqua. A iluminação oblíqua permite a imagem de fluorescência volumétrica sem a necessidade de seccionamento. Ao deslocar o laser, um feixe oblíquo é focado na retina e, em seguida, a detecção oblíqua pode capturar uma imagem de fluorescência tomográfica ao longo do caminho do feixe oblíquo.Para criar o caminho óptico da imagem de fluorescência, a fluorescência é refletida pelo espelho dicróico e retransmitida para o terceiro espelho galvanômetro. A luz fluorescente é então retransmitida para uma lente objetiva de imagem por outro sistema de telescópio um-para-um. Dois estágios de tradução adicionais são instalados sob o terceiro espelho galvanômetro para fornecer redundância nos graus de liberdade para otimizar a imagem.O sistema de imagem final é montado em um palco que tem três graus de liberdade. Rotação e dois eixos de translação. Uma câmera planar é usada para capturar as imagens de fluorescência transversais.Outro espelho dicróico separa a faixa infravermelha traseira da luz restante. Um filtro passa-longo é usado para limitar ainda mais a largura de banda a 800 a 900 nanômetros. Acople o feixe em uma fibra monomodo.A fibra monomodo é conectada à outra porta de entrada dos dois acopladores de fibra óptica em cascata para combinar com a excitação oSLO azul. A luz da segunda porta de saída do segundo acoplador de fibra é direcionada para o braço de referência OCT. Que possui placas de compensação de dispersão, filtro de densidade neutra variável e espelho reflexivo.O retorno de luz do braço de referência e do olho se recombina no segundo acoplador de fibra óptica e é entregue ao espectrômetro OCT para coletar o sinal. Use um software de sistema de aquisição de dados escrito em Labview e modificado a partir do protocolo de varredura OCTA. Para cada b-scan, um dente de serra de ciclo de trabalho de 80% com 500 etapas é emitido por uma placa de saída analógica para controlar o espelho de varredura rápida x-prime.Acione a câmera de varredura de linha em cada etapa para adquirir dados para a OCT, somente quando o espelho estiver na direção de varredura para frente. Defina o tempo de exposição da câmera de varredura de linha para 17 microssegundos. Para adquirir o sinal OCTA, repita a medição cinco vezes no mesmo local de b-scan.Defina a taxa de saída AO em 100 kilohertz e a taxa de linha A OCT em 50 kilohertz. Controle o espelho de varredura lenta y-prime, GM1, por uma forma de onda crescente. Sincronize o espelho de devarredura, GM3, com GM1 para desfazer a varredura lenta.Acione a câmera plana por outra placa de saída analógica para capturar uma imagem fluorescente em cada local y-prime. Corte o tamanho da imagem ou coloque os pixels vizinhos no compartimento para aumentar a velocidade e a sensibilidade conforme desejado. Comece confirmando um nível adequado de anestesia no rato por falta de reflexo de retirada durante uma pinça intradigital.Após a indução da anestesia, coloque o rato em um suporte. Instale um cone nasal para manter a anestesia durante o restante do experimento. Aplique solução oftálmica de cloridrato de tetracaína 5 no olho do rato para anestesia local.Em seguida, dilate a pupila com solução oftálmica de tropicamida a 1%. Após dois minutos de dilatação, use uma seringa de um mililitro e uma agulha de calibre 29 para injetar 10% de fluoresceína ou 10% de FITC diluído em solução salina através da veia da cauda. Em seguida, ligue a fonte de laser e coloque um filtro de densidade neutra para atenuar a excitação da luz azul durante o alinhamento.Meça a potência da luz azul, garantindo que seja inferior a 10 microwatts. Em seguida, mude para a luz de tomografia de coerência óptica, garantindo que esteja perto de 8 miliwatts. Ligue a fonte de alimentação do espelho do galvanômetro, que é usado para controlar a direção do laser.Ajuste a altura do globo ocular para fazer um ponto de laser estacionário na córnea. Ajuste a posição dos olhos para tornar a borda da pupila aproximadamente perpendicular ao laser. E desloque o laser para cerca de 1,5 milímetros do centro apical do olho.Ajuste ainda mais o suporte do animal até que as imagens de tomografia de coerência óptica atinjam a qualidade ideal. Na direção de varredura rápida x-prime, certifique-se de que a imagem de varredura b transversal pareça plana. Ao alternar para a direção de varredura lenta y-prime, certifique-se de que a imagem de varredura b da seção transversal apareça inclinada devido à varredura oblíqua.Remova o filtro de densidade neutra para a excitação da luz azul. E monitore o feed em tempo real da câmera. Uma imagem fluorescente transversal deve aparecer mostrando vasos sanguíneos em diferentes profundidades.Ajuste o foco do sistema de imagem de fluorescência final para alcançar o foco ideal. E realize ajustes finos da posição do olho no plano lateral para obter a qualidade ideal da imagem oftalmoscopia a laser de varredura oblíqua. Após o alinhamento, comece a adquirir angiografia por tomografia de coerência óptica simultânea e angiografia com fluoresceína volumétrica.Esta imagem mostra uma imagem de tomografia de coerência óptica transversal de uma retina de rato. Esta é uma angiografia por tomografia de coerência óptica, ou imagem OCTA, da mesma região. E uma oftalmoscopia oblíqua a laser de varredura e angiografia volumétrica com fluoresceína por imagem angiografia com fluoresceína transversal, ou oSLO-VFA.Análogo ao b-scan de tomografia de coerência óptica. Em comparação com a OCTA, a oftalmoscopia oblíqua a laser de varredura e a imagem transversal da angiografia volumétrica com fluoresceína identificam claramente os capilares na camada plexiforme externa. A camada superficial da retina é mostrada aqui em uma imagem OCTA.Artefatos na forma de listras verticais são visíveis na imagem. oSLO-VFA evita os artefatos de movimento utilizando contraste de emissão de fluorescência. Dentro da camada intermediária da retina, os vasos de mergulho vertical são claramente mostrados na imagem oSLO FA.Mas não aparente no OCTA. Ao tentar este procedimento, é importante evitar a exposição contínua do laser ao olho por mais de dois minutos. Evite o ressecamento da córnea e deixe o olho descansar pelo menos 30 segundos entre as seções de imagem, bloqueando a luz.Após este procedimento, outros métodos, como imagens de camundongos geneticamente modificados para expressar proteínas de fluorescência, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais. Como a forma como tipos específicos de células da retina podem mudar e as variáveis vistas com doenças conhecidas.

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Source: &lt;a style='text-decoration:none;' href='https://app.jove.com/v/55865/ coerência-óptica-tomografia-imagem-de-camundongo-células-ganglionares-de-retina-em-vivo'&gt;Jagodzinska, J., et. al., Tomografia de Coerência Óptica: Imagem de células ganglionares da retina de camundongos In Vivo. J. Vis. exp. (2017)  Neste vídeo, demonstramos o uso da tomografia de coerência óptica de domínio espectral (SD-OCT) para obter imagens das camadas da retina e avaliar as mudanças estruturais em um modelo...

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