O método de conjunto de réplica: Uma abordagem de alto rendimento para quantitativamente medida Caenorhabditis elegans expectativa de vida

Centenas de genes foram identificados cuja função afeta a forma como um organismo envelhece. Mas muitos de seus relacionamentos são mal compreendidos. Este método pode ajudar a responder a uma pergunta-chave no campo do envelhecimento.

Ou seja, quais são as inter-relações genéticas entre os genes gerA? A principal vantagem desta técnica é um aumento no rendimento, o número de predebações genéticas que podem ser medidas quantitativamente simultaneamente é aumentado em pelo menos uma ordem de magnitude. Os dados de vida útil, coletados com este procedimento, podem ser plotados e analisados usando o software que fornecemos com esta publicação.

Além de fornecer informações sobre a expectativa de vida, esse método também pode ser aplicado a outros fenótipos relacionados à idade, como resistência ao estresse e mudanças no plano de saúde. Para este procedimento, crie um novo carimbo da subbiblioteca RNAi. Primeiro, alíquota de cada poço de uma placa de 96 poços, com 200 microlitros de LB com ampicilina, usando um pipetador de 12 canais.

Esterilize um replicador de placa de 96 pinos imergindo sequencialmente os pinos em 50% de alvejante seguido de água ultrapura. Em seguida, mergulhe as pontas em etanol e queime cuidadosamente as pontas. Em seguida, remova cuidadosamente a tampa da folha adesiva de uma placa de biblioteca de estoque de glicerol congelada de 96 poços e moa suavemente, mas com firmeza, as pontas do replicador de placa esterilizado nos poços dos estoques de glicerol ainda congelados.

Em seguida, inocular as culturas e selar a placa inoculada com a membrana permeável. Permita que as culturas cresçam durante a noite na bancada. No dia seguinte, esterilize o replicador de placas e remova cuidadosamente a vedação da cultura noturna e mergulhe as pontas dos pinos do replicador.

Em seguida, inocule uma placa retangular de ampicilina LB e ágar tetraciclina com os pinos. Aplique pressão uniforme e use um pequeno movimento circular para transferir as bactérias sem deixar as manchas ficarem muito lotadas. Em seguida, incube as placas durante a noite a 37 graus Celsius.

No dia seguinte, para cada 10 réplicas de placas necessárias, carregue cada poço de uma placa de 96 poços profundos com 1,5 mililitros de LB com ampicilina. Em seguida, inocule os poços com as bactérias cultivadas. Em seguida, sele a placa com uma membrana respirável, cultive-a por 20 horas agitando.

Os poços de controle devem ser espalhados pelos 96 poços, de modo que quando a placa da subbiblioteca de 96 poços for dividida em grupos de 24, cada divisão de 24 poços tenha um de cada um dos controles. No dia seguinte, carregar alíquotas de 120 microlitros da cultura nas placas de 24 poços, usando uma pipeta multicanal de seis poços, com espaçamento de ponta ajustável. Em seguida, seque as placas descobertas em uma capela de fluxo laminar até que todo o líquido tenha sido absorvido.

Não os deixe secar demais. Certifique-se de manter seu foco ao aliquotar culturas líquidas, para garantir que a cultura bacteriana adequada seja colocada no poço adequado na placa de 24 poços. Os experimentos do conjunto de réplicas começam com o conjunto de placas replicadas independentes de 24 poços, cada uma semeada com os mesmos clones de RNAi de bactérias.

Para experimentos de vida útil, 15 a 20 animais L1 são adicionados a cada poço de placa e podem crescer até o estágio L4. Em L4, o FUdR é adicionado a todos os poços entre as replicações. Mais tarde, no mesmo dia, uma placa replicada pode ser retirada do conjunto e marcada como o primeiro ponto de tempo.

Para marcar a vida útil, o líquido é adicionado aos poços da placa para induzir o movimento do animal. Os animais que não começam a se mover são cutucados suavemente com uma picareta de minhoca. O número total de animais e o número de animais mortos são então registrados.

A placa da primeira observação é então descartada. No próximo ponto de observação, outra placa replicada é retirada do conjunto e pontuada de maneira semelhante. Isso é repetido no intervalo de pontuação determinado.

Cada vez com uma nova placa do conjunto de replicação. Continue marcando um conjunto de pratos até que nenhum animal permaneça vivo. Primeiro, sincronize uma população de animais com o mesmo método de preparação à base de alvejante usado para o ensaio tradicional de vida útil.

Em seguida, usando uma pipeta de espaçamento ajustável de seis poços e reservatório de reagente, semeie de 15 a 20 animais L1 em cada poço das placas de 24 poços preparadas. Ao semear as placas, misture periodicamente os animais L1 em solução para manter uma distribuição uniforme. Agora, deixe os animais se desenvolverem para L4. O momento do desenvolvimento de L4 deve ser conhecido para este protocolo.

Monitore periodicamente o desenvolvimento dos vermes. Quando os animais atingirem L4, adicione 24 microlitros de 50x FUdR a cada poço e devolva as placas à incubadora. O uso de animais L4 é fundamental.

Se os hermafroditas atingirem a maturidade reprodutiva antes de adicionar FUdR, sua progênie sobreviverá e comerá o alimento. Por outro lado, adicionar FUdR muito cedo leva a animais rompidos. Nos pontos de tempo desejados, use uma placa replicada para pontuar a viabilidade.

Para isso, inunde o poço com solução M9. Antes de pontuar a viabilidade a cada dia, sensor Para cada poço, registre o total de animais por poço e verifique o status dos vermes imóveis, tocando suavemente cada um na cabeça com uma picareta de minhoca.

Depois de contar todos os mortos imóveis em um prato, descarte o prato. Para este procedimento, crescer transformado e. Coli durante a noite em LB com ampicilina.

No dia seguinte, concentrar as bactérias por centrifugação a 3.000 G's durante 15 a 20 minutos. Ressuspenda as bactérias em 1/10 do volume inicial. Em seguida, alíquota de 200 microlitros das bactérias 10x em placas de seis centímetros.

Prepare três ou quatro placas por condição de teste e inclua duas placas extras em caso de contaminação. Secar as placas num lote de fluxo laminar, até que todo o líquido tenha sido absorvido ou evaporado. Depois de secas, armazene as placas em uma caixa plástica durante a noite em temperatura ambiente para induzir a produção de RNA de fita dupla.

Em seguida, armazene as placas por até duas semanas a quatro graus Celsius. Para os animais, colete animais adultos e grávidos em M9. Lave-os duas vezes com M9. Repetindo o giro na aspiração. Em seguida, ressuspenda C.elegans em quatro mililitros de M9 e adicione dois mililitros de solução de hipoclorito.

Agora, imediatamente vórtice os vermes por três minutos, com agitação periódica e vigorosa. Em seguida, sob um microscópio de dissecação, procure uma nuvem de ovos. Se a nuvem não for vista, faça um vórtice dos vermes por mais 10 a 20 segundos.

Em seguida, lave rapidamente os ovos com M9, duas vezes, como antes. E ressuspenda os ovos lavados em três mililitros M9. Em seguida, transfira os ovos para um novo tubo de 15 mililitros e incube o tubo a 20 graus Celsius com rotação suave e deixe os embriões eclodirem durante a noite. No dia seguinte, determine a densidade da solução L1 preparada calculando o número médio de L1s por microlitro em três gotas de 10 microlitros.

Carregue as placas semeadas de bactérias preparadas com 50 animais L1, cada. Instale as placas em uma incubadora Celsuis de 20 graus, até que os embriões se desenvolvam até o estágio L4. O desenvolvimento normal de L1 a L4 leva cerca de 40 horas.

Em seguida, para evitar a produção de progênies, adicione 160 microlitros de 50x FUdR a cada placa. Em seguida, remova os machos, pois a expectativa de vida é normalmente medida apenas com hermafroditas. Depois de concluído, reembale as placas na incubadora de 20 graus Celsius.

Até que todos os vermes estejam mortos, marque sua viabilidade diariamente. Para fazer isso, toque suavemente cada nematóide imóvel na cabeça com um fio de platina ou cílio. Os animais não reagentes estão mortos e devem ser removidos da placa.

Anote quaisquer anomalias durante esta rotina. O conjunto de réplicas e os métodos tradicionais para testar a vida útil de C. elegans produzem resultados semelhantes com animais N2 do tipo selvagem. Por exemplo, o knockdown de RNAi baseado em alimentação de mml-1 ou mxl-2 diminuiu significativamente a expectativa de vida normal.

Isso foi medido por um ensaio de vida útil tradicional e pelo ensaio de réplica. A longevidade prolongada também pode ser detectada. Visto aqui, o RNAi para mdl-1 ou mxl-1 aumentou significativamente a vida útil de C. Elegans quando medido por qualquer uma das metodologias.

Usando o método do conjunto de réplicas, é possível quantificar simultaneamente as mudanças na expectativa de vida em mais de 100 condições, o que não seria razoável com uma abordagem mais tradicional. Por exemplo, uma triagem de RNAi baseada em alimentação em todo o genoma identificou 159 genes necessários para o aumento da vida útil conferida pela diminuição da sinalização semelhante à insulina daf-2. A relação entre a sinalização semelhante à insulina e esses genes foi descrita medindo a expectativa de saúde dos animais.

A saúde foi indicada por c. Elegans se debatendo quando suspenso em solução. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como usar o RNAi baseado em alimentação para medir a vida útil de C.Elegans.

Mas o RNAi é versátil e pode ser aplicado para muitos fenótipos diferentes. Uma vez dominado, o método do conjunto de réplicas permite que a vida útil seja avaliada para mais de 100 clones de RNAi por dia, se for executado corretamente. Os pontos de tempo antecipados e tardios podem ser marcados rapidamente.

Todos os animais em um poço estarão vivos e em movimento, ou mortos. A pontuação leva mais tempo quando os animais estão começando a morrer. Escalone a configuração de testes independentes com isso em mente.