Name: A craca Balanus improvisus como modelo Marine - cultivo e expressão gênica (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 47 s
Description: Aprenda a cultivar Balanus improvisus para estudos de expressão gênica e biologia marinha. Este método permite produzir até 50 mil náuplios semanalmente com alta taxa de desenvolvimento.

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Esta pesquisa foi apoiada por grant 2017-04559 do Conselho Sueco de pesquisa (VR) e o projecto com suporte da UE à beira-mar de Anders Blomberg. Em particular, a criação da facilidade de cultivo, ao longo dos anos, apoiada por subsídios para por R. Jonsson de agências de fomento seguintes: SSF (Fundação sueca para a investigação estratégica) através do programa de ciência Marinha e tecnologia e MISTRA através do programa Paint marinho. Kent Berntsson foi fundamental nas fases iniciais de criação do culturingfacility. Adicionais de financiamento para estabelecer a facilidade de cultivo chegou do centro de biologia marinha evolutiva (www.cemeb.science.gu.se), que é suportado por um fundo de Linnaeus das FORMAS de conselhos de pesquisa Sueco e VR.

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Os autores não têm nada a declarar.

A cultura de craca no Tjärnö Marine Research Laboratory (Suécia) tem sido executado mais de 20 anos e tem sido usada para estudos em muitas áreas diferentes de pesquisa. Mais de 30 trabalhos científicos têm sido publicados que utilizaram o sistema de cultivo durante os últimos anos, incluindo estudos em antifouling13,22, hidrodinâmica23, ecologia química24, mudanças climáticas16 , biologia evolutiva,5e de biologia molecular2.
Para evitar a seleção de certos indivíduos que são mais adaptados para o ambiente de laboratório (indivíduos que pode não ser representativa da população selvagem), recomenda-se coletar um novos reprodutores do campo a cada ano. Além disso, também é recomendável para rejuvenescer a cultura anualmente, desde há aproximadamente 50-80% de mortalidade em adultos durante um ano normal. No entanto, se o objectivo é produzir linhas puras ou configurar estudos da evolução experimental, famílias de laboratório criados somente devem ser utilizados.
Uma boa hora para coletar improvisus b. em painéis no Tjärnö Marine Research Laboratory é em Junho-agosto... porque naquela época, há um bom suprimento de larvas de cyprid no mar. Verificar os painéis semanalmente para ver quando começa o assentamento barnacle e remover manualmente outro estabeleceu-se espécies do que b. improvisus (por exemplo, mexilhões, tunicados, Briozoários, hidroides, Nemertinos/umaespetacular e outras espécies de craca) a partir do painéis (por exemplo, com uma escova de dentes). Em torno de Tjärnö, há três águas rasas barnacle espécies presentes (b. improvisus Semibalanus balanoidese Balanus crenatus). No entanto, b. improvisus é o dominante imundas de superfícies duras suaves durante julho-agosto. S. balanoides tem seu período de liquidação, durante o início da primavera e prefere principalmente naturais substratos (por exemplo, pedras). B. crenatus pode ocorrer em baixos números dos painéis durante o verão.
Também é possível iniciar novas gerações de adultos barnacle de culto cyprids, que seria essencial se estabeleceram-se certos linages com traços específicos, ou em estudos de evolução experimental. A maneira mais conveniente para iniciar novas gerações de adultos é para resolver cyprids em painéis termoplásticos em laboratório. Estes painéis com cyprids recentemente se estabeleceram também poderiam ser usados em tratamentos experimentais ou para exposição no campo. Em casos de emergência, também pode utilizar um adultos em pedregulhos de um local nas proximidades (por exemplo, Idefjorden no caso do Tjärnö Marine Research Laboratory) onde improvisus b. é comum. Estes adultos já estabelecidos são tratados da mesma forma que os adultos sobre os painéis, assim sendo colocados em bandejas e alimentados através da passagem do sistema. Células de fluxo também podem ser usadas para estabelecer painéis com cracas,25. Estas são câmaras de escoamento com rede nos lados em que o cyprids não resolver, com painéis como a superfície de assentamento único para as larvas de plâncton.
Há várias etapas que são fundamentais para a criação de uma cultura de barnacle de funcionamento a longo prazo incluindo todas as fases da vida. Os métodos usados para cultura b. improvisus são provavelmente, em grande medida, também aplicável a outros invertebrados marinhos com livres, larvas de planktotrophic. Procedimentos de cultivo para algumas espécies já estão bem descritos (por exemplo, para diferentes espécies de ostras e mexilhões azuis)26, enquanto que para outros invertebrados marinhos, são apenas alguns exemplos das culturas a longo prazo, abrangendo toda a sua vida ciclo. Uma das primeiras tentativas bem sucedidas de cracas cultura (B. amphitrite) foi feita por Rittschof et al . 15. recursos pessoais e financeiros a longo prazo deverão estar no local antes de considerar a criação de uma craca facilidade de cultivo. A manutenção deste tipo de ano-em torno de barnacle cultura requer pelo menos uma pessoa meia tempo de trabalho. Pode haver algum potencial para a futura automação de algumas etapas na linha de produção, principalmente o cultivo de microalgas27. Além disso, para ter sucesso, é essencial ter acesso a grandes quantidades de água salgada de alta qualidade. O cultivo de microalgas, Artemia e cracas não envolve quaisquer procedimentos de segurança particular. No entanto, testes de alguns produtos antivegetativos substâncias ou produtos químicos tóxicos podem precisar de precauções especiais.
Os painéis foram verificados várias vezes por semana para contaminações. A água do mar usada na cultura foi bombeada para cima de uma profundidade de 40 m, no Fiorde de Koster, fora do laboratório de investigação marinha de Tjärnö e foi passada através de dois filtros de areia, antes de entrar no sistema de água de laboratório. Se tivesse sido feito sem filtragem da água, haveria muito mais contaminação na cultura. É essencial limpar regularmente os painéis na cultura de detritos e outros invertebrados (por exemplo, Estolho-edifício hidroides e Nemertinos predatórios) que entram no sistema através do fornecimento de água do mar, do campo. Por exemplo, se não há larvas são produzidas apesar o fato de que a cultura tem sido bem alimentados e caso contrário parece estar em boas condições, o problema pode ser a presença de Nemertinos que parecem inibir o acasalamento. Naturalmente, muitos dos organismos contaminantes na cultura no Tjärnö Marine Research Laboratory eram específicos para a costa oeste sueca, e outros tipos de contaminar organismos serão predominantes e ser mais um desafio em outras áreas geográficas. Na costa oeste da Suécia, é incomum encontrar contaminação por outras espécies de barnacle dos painéis. Ocasionalmente, o estabelecimento de S. balanoides foi encontrado, mas este é um problema muito marginal (no máximo, um s. balanoides contaminante para 10.000 amostras improvisus b. ). A falta de contaminar espécies dependia muito provável o regime a estabelecer novas culturas durante o verão, quando o larvaefrom b. improvisus foram altamente dominante. Além disso, houve também um claro enriquecimento de b. improvisus nos painéis já que esta espécie é seletiva para superfícies lisas,13.
É essencial para remover cracas morto adultas. Se as conchas vazias são deixadas nos painéis, eles podem se tornar um abrigo tanto para náuplios de Artemia , bem como para diversas espécies de contaminantes. Além disso, foi notado que os indivíduos mortos influenciam o bem-estar dos indivíduos, provavelmente com o lançamento de compostos tóxicos durante a decomposição de vizinhos. Uma consequência adicional da mortalidade adulta é que alguns indivíduos serão deixados sozinho e longe de quaisquer outros adultos para permitir o acasalamento (apesar de cracas têm o pênis mais longo no mundo animal em relação ao seu tamanho)28. Estes indivíduos sobreviverão, mas são não-produtivos para as larvas. No entanto, estes indivíduos adultos solitários suavemente podem ser removidos sem danificar a placa-base e ser colocados horizontalmente perto outros para permitir o acasalamento. Cracas também podem ser acopladas ao colocar painéis com um adulto em cada um, mas perto o suficiente para que a fertilização cruzada pode ocorrer. Desta forma, linhas genéticas podem ser produzidos14.
É fundamental para produzir um feed de alta qualidade e para alimentar as culturas quase todos os dias. Mesmo alguns dias sem comida podem resultar em um lançamento decrescente de larvas. Testes anteriores de composição da dieta têm mostrado que as diatomáceas são essenciais para o crescimento e sobrevivência dos náuplios barnacle. Várias espécies de diatomáceas parecem adequados como alimentar, apesar de células pequenas ou solitárias (inferior a 10 µm de diâmetro) podem ser necessárias para ingestão dos náuplios. As espécies S. marinoi, c. simplexe T. pseudonana todos provaram para ser alimentação adequada para improvisus b. náuplios, bem como, fácil de cultivar. Além disso, a qualidade alimentar é geralmente maior para o crescimento exponencial das algas. Também foi relatado que diatomáceas são essenciais para o estabelecimento de culturas produtivas de amphitrite B.15. Uma teoria da importância das diatomáceas é que eles têm um perfil exclusivo de ácidos gordos e são particularmente ricos em ácidos graxos poliinsaturados altamente 20:529. Ficou demonstrado que certos ácidos graxos são importantes para o desenvolvimento bem sucedido de larvas de ostras30.
Ao longo dos anos, não tem havido nenhuma incidência de doenças prejudiciais na cultura barnacle. Em muitos comerciais aquicultura invertebradas, como ostras e mexilhões, doenças são bastante comuns em podem ser muito prejudiciais. Efeitos nocivos da vírus também foram relatados a partir de populações selvagens. A ostra nativa em França foi substituída pela ostra portuguesa Crassostrea angulata em 1925, mas esta espécie foi dizimada por uma iridovirus em torno de 197031. Mais recentemente, tem havido eventos de mortalidade maciça na ostra do Pacífico Crassostrea gigas em culturas em todo o mundo, que parece ser associado com o ostreid herpesvirus 132. Não há relatórios sobre agentes patogénicos, bactérias ou vírus em cracas foram publicados até agora. No entanto, no genoma-projeto em andamento na b. improvisus, sequências de vírus foram encontradas (Alm Rosenblad et al., dados não publicados), mas com nenhuma ligação aparente com os sintomas de doenças. Misturas de antibióticos anteriormente foram aplicadas às culturas para minimizar o risco de infecções bacterianas; no entanto, este procedimento está atualmente abandonado... e até agora, isso não causou quaisquer problemas de contaminação.
Se a água do mar é aquecida (como descrito acima), superaquecimento pode ser o mais grave risco na linha de produção de cultura. É, claro, difícil de protecção contra sobreaquecimento, apesar de sensores e sistemas de alerta apropriados podem ser usado (por exemplo, enviar e-mail ou mensagens de texto para pessoas responsáveis). Incidência deste tipo no passado resultaram na morte substancial de adultos na cultura. Claro, isso pode ser devastador e arruinar investimentos a longo prazo de tempo e dinheiro. Em particular, isso seria catastrófico se estabeleceram-se linhas genéticas puras. Para garantir a longevidade de tais linhas e fixá-los de perda acidental, seria desejável desenvolver uma metodologia de criopreservação para cracas. Foi relatado que as larvas da ostra podem ser congeladas para baixo e revividas com sucesso parcial33. Cryobanking também tem sido uma ferramenta valiosa para preservar os recursos genéticos de uma vasta gama de espécies34. Até mesmo náuplios de B. amphitrite são relatados para sobreviver congelamento35, e verificou-se que 20% dos indivíduos congelados para baixo com êxito metamorfoseados em cyprids36. No entanto, aplicação de congelamento para a sustentabilidade a longo prazo das culturas até agora não foi aprovada, mas este fato seria necessário para a manutenção de linhas selecionadas; Isso seria um passo essencial para estabelecer firmemente improvisus b. em um potente modelsystem marinho.
Aqui, um protocolo foi apresentado para a dissecação dos vários tecidos dos adultos de b. improvisus (i.e., cirros, soma e cornija de lareira). No entanto, convém salientar que outros tecidos também podem ser extraídos. Por exemplo, o tecido macio entre o manto exterior e interno da espécie membranosa-base Tetraclita japonica formosana foi cuidadosamente isolado e utilizado para uma extração de RNA e RNA-seq análise da expressão de gene37. O protocolo de extração otimizado esboçado descrito aqui fornece quantidades suficientes de RNA de alta qualidade para o sequenciamento de uma quantidade mínima de material começar. Primeiro, a coleção de larvas individuais diretamente para os tubos de homogeneização minimiza qualquer perda durante a transferência de um tubo para outro. Além disso, entre os diferentes métodos testados, a homogeneização com grânulos cerâmicos provou para ser o mais eficiente em termos de RNA rendimento e integridade, comparado a homogeneização sonication ou pilão. Durante o planejamento de expressão gênica ou experimentos de genómica, um tem que ter em mente o desafio da alta variação genética em cracas, pelo menos para improvisus b.. Barnacle tem uma diversidade genética na faixa de 3 a 5%, mesmo em regiões (Alm Rosenblad et al., dados não publicados) de codificação. Isso, claro, coloca demandas específicas sobre o desenho de primers para análise de qPCR, onde mais conservadas regiões devem ser identificadas e utilizadas como modelos para as primeiras demão para obter a expressão consistentes resultados betweenbatches. As regiões conservadas de genes-alvo, como aquaporinas e at + / K + ATPase, podem ser identificados através do estudo da variabilidade de sequência destes genes em RNA-seq dados obtidos de populações de cyprids contendo centenas de indivíduos. Para uma análise do genoma, DNA vai ser amostrado. No entanto, a obtenção de DNA de alta qualidade do improvisus b. pode ser um desafio21.
Em conclusão, a cultura estabelecida barnacle provou para ser instrumental em diferentes tipos de estudos experimentais. Em particular, a todo-ano-em torno de produção larval nos permite conduzir experimentos sem se limitar ao período de desova ocorre naturalmente (para b. improvisus, isto é durante o verão). As larvas obtidas podem ser usadas para executar um amplo conjunto de estudos experimentais, incluindo ensaios de liquidação, ensaios de comportamento, estudos de expressão de genes específicos, bem como estudos de transcriptoma de todo o genoma.

Cracas são crustáceos marinhos com um adulto séssil e larvas planctônicas, livres. A maioria das 1.200 espécies de cracas habita águas rasas e muitos são frequentemente expostos a baixa salinidade. Pode tolerar uma espécie, o barnacle bay improvisa Balanus (Amphibalanus) (b. improvisus), quase de água doce e Charles Darwin descreveu esta espécie de um pequeno riacho no estuário do Rio de la Plata, no Uruguai1. A salinidade de fazê extrema tolerância faz improvisus b. um modelo particularmente relevante para os estudos dos mecanismos osmoregulatory2,3. Este barnacle prefere condições salobras, mas é capaz de viver em águas com salinidades de cerca de 1,6 psu para tão alta como 40 psu4. É a espécie de craca único encontrada no mar de Báltico salobra. Improvisus b. acredita-se que se originam da costa leste do continente americano, mas hoje é encontrado em todo o mundo devido à dispersão por transporte5. É um grande organismo incrustantes e é comumente encontrada em rochas, molhes e cascos de barcos e é, portanto, de interesse geral para compreender os mecanismos da Bioincrustação sobre construções em águas marinhas e salobras6,7.
Semelhante à maioria dos outras cracas, b. improvisus é hermafrodita com fertilização cruzada; reprodução ocorre através do acasalamento entre indivíduos vizinhos, usando um pênis alongada e fertilização interna. O período reprodutivo é principalmente de maio a setembro. B. improvisus tem sete estágios larvas pelágicos (seis náuplios, seguidos por uma fase de cyprid8). As escotilhas de ovo fertilizado em uma larva náuplio, que é livres e alimenta na coluna d'água por até várias semanas antes de a muda em uma larva de cyprid não-alimentar. O cyprid usa várias pistas para encontrar um local apropriado para resolver e então sofre metamorfose em um sessile barnacle juvenil9. As espécies podem ser cultivadas em laboratório e tem uma vida útil de 1 – 2 anos no mar (2-3 anos na cultura de laboratório). Em média, b. improvisus cresce até 10 mm de diâmetro (com um máximo de cerca de 20 mm) e atinge uma altura máxima de cerca de 6 mm (embora pode crescer mais alto sob condições de superlotação). A espécie pode ser identificada por sua concha até calcária Lisa (branco ou acinzentado), a base de calcária radialmente padronizada da placa da concha e a forma das placas tergal1,10.
O barnacle improvisus b. tem várias características vantajosas como modelo para estudos de osmoregulação, com foco em mecanismos fisiológicos e moleculares, bem como as interações ecológicas e consequências evolutivas. É também amplamente utilizado como um modelo para as investigações de regularizar a biologia, em particular em relação à pesquisa de antifouling e os mecanismos envolvidos7,11,12,13. No entanto, desova sazonal natural produz um imprevisível fornecimento de larvas de cyprid para estudos. A capacidade de cultura esta barnacle através de seu ciclo de vida inteiro durante todo o ano é, portanto, um grande trunfo para permitir vários tipos de estudos moleculares e mecanicistas. Além disso, sua presença em águas salobras/marinhas em todo o mundo permite uma combinação de campo e estudos experimentais. Reprodução controlada pode também produzir famílias de conhecidos pedigrees para cultivo a longo prazo14, e um tempo de geração de poucos meses pode permitir a evolução experimental a longo prazo. Há também um genoma de projecto e transcriptomes vários disponíveis, e esses recursos foram utilizados para a clonagem de vários genes (por exemplo, genes de importância na osmoregulação)2,3.
O objectivo do presente protocolo é descrever como estabelecer e manter uma cultura do barnacle improvisus b. durante todo o ano para realizar estudos de expressão do gene em adultos ou larvas deste organismo. Rittschof et al . 15 brevemente descrito um método para o cultivo de cracas da libertação de náuplios para o assentamento de cyprids para a espécie Balanus amphitrite. O protocolo foi adaptado para o cultivo de todo o ano de b. improvisus no Tjärnö Marine Research Laboratory (Suécia), e uma descrição detalhada de todas as etapas na linha de produção é descrita, incluindo a produção e criação de barnacle as larvas, bem como a administração de alimentos destinados a adultos e larvas. Para uma visão geral de todo o procedimento, consulte a Figura 1. O uso do sistema de cultivo é exemplificado com algumas afinações experimentais comuns e ilustrado em estudos de genômica funcional do at+/k+ ATPase e aquaporinas, elucidar suas possíveis funções na osmoregulação2, 3. Às vezes é essencial para examinar a expressão de gene em tecidos específicos e algumas noções básicas de dissecação barnacle serão cobertas. Com um bom suprimento de água do mar de alta qualidade, o cultivo do barnacle improvisus b.e potencialmente muitas outras espécies, deve ser possível nos laboratórios marinhos em todo o mundo.

<table><tbody><tr><td>Painéis de acrílico (polimetilmetacrilato)</td><td>Plástico produkter, Bromma, Suécia</td><td></td><td>vidros transparentes</td></tr><tr><td>garrafa PET</td><td></td><td></td><td></td>de 1,5 L</tr><tr><td>Artemia</td><td>INVE Aquaculture, Bélgica</td><td></td><td>Testamos diferentes empresas; esta é realmente a melhor</td></tr><tr><td>Skeletonema marinoi (cepa CCAP 1077/5)</td><td>CCAP (Coleção de Cultura de Algas e Protozoários); Escócia&nbsp;</td><td>estirpe 1077/5</td><td></td></tr><tr><td>Chaetoceros simplex var. gracilis (estirpe CCAP 1085/3)</td><td>CCAP (Culture Collection of Algae and Protozoa); Escócia&nbsp;</td><td>strain 1085/3</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de filtro de cartucho Millipore</td><td>Millipore&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cartucho com um tamanho nominal de poro de 0,2 &micro; m</td><td>Millipore&nbsp;</td><td>cartucho CWSS01S03</td><td>Alta capacidade para grandes volumes</td></tr><tr><td>de garrafa de policarbonato</td><td>Nalgene</td><td></td><td>RNA autoclavável</td></tr><tr><td>posterior</td><td>Qiagen</td><td>76106</td><td>&nbsp; Solução de fixação para preservar o RNA</td></tr><tr><td>Turbo Kit livre de DNA</td><td>Invitrogen/Thermofisher Scientific&nbsp; &nbsp;</td><td>AM1907</td><td>Kit DNAse para remover DNA de RNA preparado</td></tr><tr><td>Kit de síntese de cDNA iScript</td> Kit de <td>síntese de cDNA</td><td>Biorad</td><td>1708890</td></tr><tr><td>SYBR Green supermix</td><td>Biorad</td><td>1708880</td><td>Dye para QPCR</td></tr><tr><td>RNeasy minikit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td>Extração de RNA de adultos ou muitos ciprídeos</td></tr><tr><td>Homogeneização de tecidos moles CK 14, tubos de 2 ml</td><td>Precellys</td><td>KT03961-1-003.2</td><td>Grânulos cerâmicos para homogeneização</td></tr><tr><td>RNeasy micro kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>Extração de RNA de alguns ciprídeos</td></tr></tbody></table>

a craca balanus improvisus como modelo marine - cultivo e expressão gênica

The Barnacle Balanus improvisus as a Marine Model - Culturing and Gene Expression

Cracas são crustáceos marinhos com um adulto séssil e larvas planctônicas, livres. A craca Balanus (Amphibalanus) improvisus é particularmente relevante como um modelo para os estudos dos mecanismos de osmoregulatory por causa de sua extrema tolerância à salinidade baixa. É também amplamente utilizado como um modelo de resolução de biologia, em particular em relação à pesquisa de antifouling. No entanto, desova sazonal natural produz um imprevisível fornecimento de larvas de cyprid para estudos. É descrito um protocolo para o cultivo de todo o ano de b. improvisus desenvolveu-se e uma descrição detalhada de todos os passos na linha de produção (ou seja, o estabelecimento de culturas adultos em painéis, a coleção e a criação de larvas de craca e a administração de alimentos destinados a adultos e larvas). A descrição também fornece orientação sobre resolução de problemas e discute parâmetros críticos (por exemplo, a remoção de contaminação, a produção de alimentos de alta qualidade, os recursos humanos necessários e a importância da água do mar de alta qualidade). Máximo de cada lote do sistema de cultivo produz cerca de 12.000 náuplios e pode entregar quatro lotes em uma semana, então até quase 50.000 larvas por semana pode ser produzido. O método usado para cultura improvisus b. é, provavelmente, em grande medida, também aplicável a outros invertebrados marinhos com free-swimminglarvae. Protocolos são apresentados para a dissecação dos vários tecidos de adultos, bem como a produção de RNA de alta qualidade para estudos de expressão gênica. Também é descritos como cultos adultos e cyprids criados podem ser utilizados em uma ampla gama de projetos experimentais para análise de expressão gênica em relação a fatores externos. O uso de cracas cultivadas na expressão do gene é ilustrado com estudos de possíveis funções osmoregulatory do at+/k+ ATPase e aquaporinas.

Com o procedimento descrito para o cultivo de cracas adultas de b. improvisus, até quatro lotes de náuplio larvas podem ser produzidas por semana. Seria possível coletar larvas náuplio quase todas as noites, mas isso requer mais pessoas e infra-estrutura (com muitas cracas nos reprodutores, uma cultura irá lançar larvas continuamente). Um fator limitante adicional para a produção de larvas parece ser a disponibilidade de alimentos de alta qualidade, em particular em relação a diatomácea Skeletonema. Màxima, cada lote do sistema de cultivo consiste em aproximadamente 12.000 náuplios, então até 50.000 náuplios por semana podem ser cultivadas. No entanto, algumas semanas pode haver até dez vezes menos larvas produzidas. Um único adulto pode produzir até 7.000 larvas por dia14, que significa que 1 – 2 adultos estão liberando larvas para cada lote. Dentro de uma semana, cerca de 70-90% dos náuplios coletados desenvolverá em cyprids (produzindo cerca de 30.000 cyprids semanais, màxima) que pode ser usado para assentamento de ensaios e estudos moleculares.
Convém salientar que existem variações nas características cyprid entre lotes, e em geral, existem grandes variações entre lotes do que dentro de lotes. Por exemplo, o sucesso de assentamento em ensaios de assentamento varia entre 30 e 70% para lotes diferentes. O mais provável, isso é causado pela variação genética individual entre os pares específicos de adultos liberando larvas durante os períodos de amostragem diferentes. É, claro, recomendável que experiências repetidas (Replica biológica) devem incluir cyprids de um número de lotes se declarações mais gerais sobre os resultados devem ser feitas. A variação de lotes para coloca exigências sobre o delineamento experimental, onde devem ser aplicadas controles adequados e normalizações em estudos de expressão do gene. No entanto, mesmo depois de vários procedimentos de normalização estatística têm sido implementados que reduzem consideravelmente a variação entre lotes, alguns efeitos do lote são geralmente ainda aparentes (dados não publicados).
Seguindo o protocolo fornecido, é possível obter, em média, 500 ng do RNA de alta qualidade de tão pouco como 20 cyprids, independentemente da fase de liquidação barnacle (tabela 1). A qualidade do RNA é geralmente medida como a razão entre os picos de 18S e 28S (a posição esperada dos dois picos são indicadas na Figura 4). No entanto, no caso de cracas e muitos outros artrópodes, o rRNA 28S decompõe-se quando aquecido (como parte do método de análise) e migra junto com o pico de 18 anos20. Eis porque há, em princípio, um único pico de rRNA neste tipo de análise para cracas. É evidente a partir deste teste (Figura 4) que uma homogeneização por grânulos cerâmicos fornece o RNA com maior integridade e é, portanto, o método de escolha. O RNA é suficiente em quantidade e qualidade para gerar bibliotecas de sequenciamento de alta qualidade para sequenciamento, resultando em uma média de 70 milhões de leituras por exemplo (o número de leituras, claro, depende do nível de multiplexação durante o sequenciamento). A quantidade de RNA é também suficiente para análise de expressão síntese e qPCR do cDNA de um grande número de genes.
A Figura 5 mostra o resultado das análises de qPCR de aquaporinas e do at+/k+ ATPase (NAK1) splice variantes, onde as mudanças de expressão foram investigadas em resposta a alterações em pistas ambientais2,3. Uma comparação da expressão relativa de longo e curto splice variantes de NAK1 mostra um duplo aumento para o longa NAK1 mRNA em baixa salinidade em relação a NAK curto (Figura 5A). Assim, os dados indicam que o splicing alternativo faz a forma longa predominante em condições de baixa salinidade. No caso de aquaporinas, é evidente que o paralogs de água-transportando dois AQP1 e AQP2 exibir expressão diferencial (Figura 5B). Em particular, no tecido do manto, é evidente que o AQP1 é substancialmente para baixo-regulado em salinidades inferiores, que não é visto por AQP2. Em vez disso, AQP2 mostra uma expressão ligeiramente aumentada em salinidades inferiores, mas no soma. Estes resultados fornecem uma base para as investigações dos papéis funcionais dos diferentes improvisus b. transportadores de íons e aquaporinas na osmoregulação barnacle.
<img alt="Diagrama do ciclo de vida marinho: amostragem de DNA / RNA, cultivo de náuplios para cipídeos, processo de assentamento de adultos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1 : Visão geral de todo o procedimento e a extração de RNA para estudos de expressão do gene em adultos de cultivo. Para iniciar uma nova cultura, painéis são anexados a um quadro e implantados no mar em 1-3 m de profundidade. Após várias semanas, os painéis com adultos/jovens são colocados verticalmente em racks em bandejas no laboratório. Cada bandeja detém cerca de 40 painéis com adultos. Com cerca de 100 adultos por painel, em total ≈ 4.000 indivíduos adultos são cultivados por bandeja. As cracas adultas são alimentadas com Artemia e pode ser mantidas ano-por aí. As larvas náuplio são recolhidas várias vezes por semana a partir de bandejas através de uma filtragem através de uma peneira. Os náuplios coletados são transferidos para baldes mantidos a 26 ° C em banho-maria e alimentados com microalgas. Náuplios são criados até que eles muda em cyprids não-alimentação, que são coletados por filtragem. Novos painéis podem ser estabelecidos no laboratório através da sedimentação de cyprids nos painéis, ou para fornecer novos painéis para o ano-em torno de cultura ou para ser usado para afinações experimentais específicas com diferentes condições externas. RNA é então extraído de juvenis/adultos no final do experimento, ou nos pontos de tempo específicos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Experiência de filtração aquática; equipamentos e etapas do processo; configuração de separação de sedimentos; investigação." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2 : Imagens de alguns passos importantes no processo de cultivo. (A), esta imagem mostra os quadros com painéis para coletar novas populações do campo. (B) esta imagem mostra os painéis com cracas adultos de b. improvisus em racks que são colocados em bandejas. Os painéis são colocados cerca de 2 cm afastados. (C), esta imagem mostra as bandejas com o barnacle, painéis e o tanque de alimentação para a esquerda. De cada bandeja, há uma tomada onde as peneiras são colocadas para a coleta de larvas náuplio. (D) esta imagem mostra que a produção de Artemia alimenta para as cracas adultas. (E) esta imagem mostra a criação de náuplios em baldes num banho de água situado a 26 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama de anatomia de cracas; placas operculares, concha, detalhes do corpo; estudo biológico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3 : Descrição das etapas de cracas adultas dissecação inicial: remover o corpo do seu shell. (A) agarrar uma das chapas odontódios inserindo fórceps suavemente através da abertura. Puxe suavemente para remover a placa e expor o animal. (B) retirar o animal, agarrando a parte soma logo abaixo os cirros. (C), este painel mostra a anatomia geral de cracas de bolota. O manto e potencialmente fertilizados ovos (no ovário) permanecer na cavidade de escudo quando o corpo é puxado para fora. Uma nota sobre anatomia barnacle (para uma conta mais detalhada, consulte Anderson)9: as placas de parede de uma craca inclinam-se para dentro, e juntos, eles formam um cone de vulcão-como. Uma abertura, a abertura, é coberta pelas duas placas odontódios, que formam uma porta, ou opérculo, para fechar a abertura. Cracas bolota geralmente têm uma placa basal calcária que está colada firmemente o substrato; no entanto, algumas espécies de cracas faltam esta placa calcária (por exemplo, S. balanoides). Cracas secretam exoesqueleto do manto Escuramente pigmentado (carapaça). A superfície externa do manto duas camadas está calcificada para tornar-se rígida, enquanto a superfície interna do manto não está calcificada e, portanto, flexível. Dentro da abertura, os cirros estão presentes em uma posição retraída. Estes são os apêndices torácicos que cracas usam para a alimentação de suspensão. Os ovários estão localizados perto da base do barnacle, enquanto os testículos mentem no soma. Esta figura foi adoptada pelo Panova et al 21 e foi publicado com a permissão de Springer. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Gráfico de tempo vs. intensidade de fluorescência, análise de dados de picos de emissão, estudo espectroscópico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4 : Determinação da integridade de rRNA por eletroforese em gel capilar. RNA foi preparado por dois métodos diferentes de homogeneização: sonication (A) e (B) grânulos cerâmicos. A unidade no eixo y, FU, defende-se unidades de fluorescência. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Gráficos de barras comparando salinidade, efeitos de pCO₂ na expressão de NKA-L1/NAK-S; expressão de aquaporina nos tecidos." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57825/57825fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5 : Expressão gênica resulta de dois estudos diferentes de genes importantes para osmoregulação em b. improvisus. (A), este painel mostra a expressão diferencial, medido por qPCR das variantes da tala do at+/k+ ATPase NAK1 em resposta a diferentes salinidades e pCO2 níveis3. O tratamento de baixa salinidade, a expressão da isoforma longa (NAK1-L) é aumentada em relação a curto (ANOVA, P &lt; 0,001). (B), este painel mostra a expressão das aquaporinas em adultos de b. improvisus durante sua exposição a diferentes salinidades2. qPCR foi usada para determinar os níveis de expressão de aquaporina em relação a actina. Indivíduos adultos foram incubados em 3 diferentes salinidades (3, 20 e 33 PSU) durante 14 dias. Para a preparação de RNA, a soma, cirros e manto dos adultos foram separados. Em ambas as figuras, as barras de erro indicam o desvio padrão. O * * e * * * indicam o nível de significância (ANOVA), 0,01 e 0,001, respectivamente. Estes números foram modificados de Lind et al 2 , 3. ambas as figuras são publicadas com permissão da PLoS ONE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57825/57825fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Fase de liquidação</td>
			<td>Montante total do RNA (ng)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Natação livre</td>
			<td>512</td>
		</tr>
<tr>
<td>Exploração: Pesquisa perto</td>
			<td>518</td>
		</tr>
<tr>
<td>Anexo cyprid</td>
			<td>550</td>
		</tr>
<tr>
<td>Recentemente metamorfoseados juvenil</td>
			<td>832</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: rendimento do RNA. Esta tabela mostra a quantidade de RNA extraída com um kit de preparação do RNA das piscinas de 20 cyprid indivíduos coletados em diferentes fases durante o processo de resolução.

O barnacle improvisus Balanus (Amphibalanus) é um modelo para o estudo de osmoregulação e anti-incrustantes. No entanto, desova sazonal natural produz um imprevisível suprimento de larvas cyprid. Aqui, um protocolo para o cultivo de todo o ano de b. improvisus é descrito, incluindo a produção de larvas. O uso de cracas cultivadas em estudos de expressão do gene é ilustrado.

A craca Balanus improvisus como modelo Marine - cultivo e expressão gênica

Barnacles are marine crustaceans with a sessile adult and free-swimming, planktonic larvae. The barnacle Balanus (Amphibalanus) improvisus is particularly ...

A instalação de cultura pode ajudar a responder a questões-chave dentro da ecologia larval, bioincrustação e biologia evolutiva. Mais especificamente, pode ser usado em estudos sobre interações receptor-ligante durante o assentamento larval, desenvolvimento de novas tecnologias anti-incrustantes e a evolução e função de genes envolvidos na osmorregulação. A principal vantagem deste organismo modelo é que a craca Balanus improvisus é robusta, reproduz-se durante todo o ano e tem um tempo de geração relativamente curto.Embora esse método possa fornecer informações sobre a cultura de cracas, ele também pode ser aplicado à cultura de outros organismos marinhos. Geralmente, os indivíduos novos neste método terão dificuldades devido ao grande número de detalhes importantes para o sucesso, como o fornecimento de boa água do mar, produção robusta de ração de alta qualidade e uma atenção constante à limpeza e alimentação das culturas. Demonstrando o procedimento estarão Martin Ogemark e Anna-Lisa Wrange, técnica e pesquisadora que trabalha com cracas.Para começar, configure molduras que possam conter vários painéis termoplásticos transparentes. Faça dois furos nos cantos superiores de cada painel e use braçadeiras para prender os painéis às molduras. Para coletar cracas adultas, implante os painéis verticalmente a uma profundidade de um a três metros em águas calmas.Depois de permitir que as cracas se assentem e cresçam até cinco milímetros de diâmetro, leve os painéis para o laboratório. Em seguida, coloque os painéis verticalmente em um suporte com ranhuras fresadas em uma bandeja de polietileno. Primeiro, usando fita adesiva não tóxica e resistente à água, cole cinco painéis juntos para criar um cubo aberto na parte superior.Coloque o cubo em uma bandeja pequena e encha-o com água do mar. Em seguida, adicione aproximadamente 200 ciprídeos no topo do cubo. A cada dois dias, alimente as cracas juvenis com 100 mililitros de Skeletonema marinoi.Após duas a três semanas, os painéis do cubo devem conter juvenis estabelecidos com pelo menos cinco milímetros de diâmetro. Desmonte o cubo e mova os painéis para bandejas com água do mar que flui. Para colher náuplios de Artemia, primeiro desligue a bomba de aeração e escureça a garrafa, depois ilumine a parte inferior da garrafa por 10 minutos.Os náuplios de Artemia chocados nadarão em direção à luz. Os cistos não eclodidos afundarão no fundo, enquanto as conchas dos cistos flutuarão no topo. Abra o grampo na parte inferior e colete a fração intermediária como uma população densa dos náuplios de Artemia nadadores.Para limpar os painéis com cracas adultas, borrife-os suavemente com água doce e remova qualquer incrustação com uma escova de dentes macia. Limpe as bandejas sem cracas e os tubos com água doce quente. Em seguida, coloque uma peneira na bandeja de polietileno com uma porta de transbordamento.Recolha as larvas de cracas que se depositam na peneira durante a noite. Em seguida, encha um balde com 20 litros de água do mar filtrada e um litro de uma mistura de microalgas de diatomáceas para criar uma densidade de 50.000 diatomáceas por mililitro. Transfira os náuplios de craca coletados anteriormente para um prato cristalizador e ilumine o prato pela lateral.Em seguida, use uma pipeta para coletar os náuplios que nadam em direção à luz e transfira-os para outro prato. Transfira os náuplios para um copo contendo um litro de água do mar filtrada para contagem. Em seguida, adicione um litro de náuplios ao balde previamente preparado.Após três dias, use uma peneira de 90 micrômetros para coletar os náuplios de cracas, limpe o balde, encha-o com água do mar filtrada e adicione uma nova ração de diatomáceas e os náuplios de cracas. Após mais dois a três dias de incubação, use uma peneira de 320 micrômetros em cima de uma peneira de 160 micrômetros para separar os náuplios de cracas não mudados dos ciprídeos. Depois de montar quatro garrafas de quatro litros para cultura de microalgas, coloque as garrafas à luz com intensidade de 50 a 100 micromoles por metro quadrado.Colha as culturas quando estiverem suficientemente densas para serem usadas na alimentação. Primeiro, selecione indivíduos grandes e retenha alimentos por dois dias antes da dissecação. Em seguida, limpe a casca da craca com uma escova de dentes e enxágue com água para minimizar a contaminação de outras espécies presentes no ambiente.Coloque uma craca individual em uma superfície plana para dissecação e, em seguida, insira a ponta de uma pinça entre as placas tergal e escutal. Segure uma placa e puxe-a suavemente para removê-la. Em seguida, use uma pinça para segurar os cirros e puxe a craca para fora.Por fim, coloque as cracas dissecadas diretamente em etanol a 96% ou solução estabilizadora de RNA para fixação. Com o protocolo descrito aqui, até quatro lotes de larvas de náuplio de craca podem ser produzidos em uma semana. No máximo, cada lote do sistema de cultura consiste em aproximadamente 12.000 náuplios, o que significa que até 50.000 náuplios podem ser cultivados por semana.Dentro de uma semana, 70 a 90% dos náuplios coletados se desenvolverão em ciprídeos, produzindo cerca de 30.000 ciprídeos por semana. Uma média de 500 nanogramas de RNA de alta qualidade foi obtida de apenas 20 ciprídeos individuais, independentemente do estágio de assentamento. Nas cracas, o rRNA 28S se decompõe quando aquecido.A homogeneização por esferas de cerâmica fornece ao RNA a mais alta integridade, tornando-o o método preferido para o manuseio de tecidos de cracas e artrópodes. Usando a análise de qPCR, um aumento de duas vezes foi observado para as variantes longas de mRNA de NAK1 e baixa salinidade em comparação com o NAK curto. Isso indicou que a forma longa é predominante em condições de baixa salinidade.Algumas semanas de treinamento são necessárias para dominar as diferentes etapas envolvidas na cultura da craca. Ao tentar este procedimento, é particularmente importante minimizar a contaminação em todas as etapas do fluxo de trabalho de cultura. Após seu desenvolvimento, essa técnica de cultivo tem sido fundamental para nos dar uma melhor compreensão da ecologia, fisiologia e biologia molecular das cracas.É também uma pedra angular importante para transformar a craca Balanus improvisus em um potente sistema de modelo marinho.

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Environment

Ambiente

O hawaiensis anfípode Parhyale é um organismo modelo promissor para estudos de embriologia e desenvolvimento crustáceo artrópodes comparativa e evolução. Este protocolo descreve um método para a remoção manual dos blastómeros individuais a partir de embriões de fase de clivagem precoces de Parhyale.

Ablação de uma única célula de oito células de embriões de Crustáceo anfípodes<em&gt; Parhyale hawaiensis</em

Métodos que produzem embriões morphant são essenciais para estudar mecanismos de desenvolvimento e redes de regulação gênicas. A estrela do mar Patiria miniata é um sistema modelo emergente para estes estudos. Aqui apresentamos um protocolo para a obtenção de gametas, produzindo culturas de embriões, e microinjeção rápida de zigotos de esta espécie.

Um Método para microinjeção de Patiria minata zigotos

Relatamos aqui a expressão robusta e eficiente de proteínas fluorescentes após a injeção de mRNA em oócitos não fertilizados de Branchiostoma lanceolatum. O desenvolvimento da técnica de microinjeção neste cordados basal irá pavimentar o caminho para longo alcance inovações técnicas neste sistema modelo emergente, incluindo in vivo de imagens e manipulações específicas de genes.

Expressão de proteínas fluorescentes em Branchiostoma lanceolatum Por injecção de mRNA em oócitos não fertilizados

O objetivo deste protocolo é fornecer aos usuários um conjunto de métodos para a descapsulação de alto rendimento de embriões e larvas de Lymnaea stagnalis em preparação para hibridização in situ de montagem inteira e para tratamentos subsequentes de pré e pós-hibridização.

A Monte Whole<em&gt; In Situ</em&gt; Método de hibridação para o molusco gastrópode<em&gt; stagnalis Lymnaea</em

Aqui demonstramos como induzir e monitorar a regeneração na anêmona-do-mar Nematostella vectensis, um modelo de antozoário cnidário.  Demonstramos como amputar e categorizar a regeneração usando um sistema de estadiamento morfológico e usamos esse sistema para revelar um requisito de autofagia na regeneração de estruturas de pólipos.

Induzindo completa Polyp Regeneração do aboral Physa da Anémona Starlet Vectensis Nematostella

O objetivo do presente protocolo é executar hibridação in situ em amostras de coral adultas que foram incorporadas em parafina e seccionadas em lâminas de vidro. Este é um método qualitativo usado para visualizar a expressão espacial de uma sonda de anti-sentido RNA em tecidos de parafina.

In Situ Técnicas de hibridização para amostras de Coral adultas parafina

O objetivo deste protocolo é genótipo o vectensis do nematostella do Anemone de mar durante o gastrulação sem sacrificar o embrião.

Genotyping de Anemone de mar durante o desenvolvimento adiantado

Doliolids, incluindo a espécie Dolioletta gegenbauri, são pequeno zooplâncton marinho gelatinoso de significado ecológico encontrado em sistemas de prateleira subcontinentais produtivos em todo o mundo. A dificuldade de cultivar esses organismos delicados limita sua investigação. Neste estudo, descrevemos abordagens de cultivo para a coleta, criação e manutenção do doliolid Dolioletta gegenbauri.

Cultivo do Tunicato marinho pelágico Dolioletta gegenbauri (uljanin 1884) para estudos experimentais

O artigo apresenta métodos para cultura larval do gastrópode Crepidula fornicata em um sistema de pequeno volume em escala laboratorial e em um sistema de mesocosmo ambiente-água do mar que pode ser implantado no campo.

Cultura de Laboratório e de Campo de Larvas de Lapa Chinelo ( Crepidula fornicata

Este estudo descreve uma estrutura para o desenvolvimento de um modelo de biofilme polimicrobiano agregado e otimização de um protocolo de extração de RNA para avaliar a expressão gênica de Pseudomonas aeruginosa refletindo o ambiente pulmonar de fibrose cística. As aplicações incluem a avaliação dos efeitos antimicrobianos e o estudo de alternativas antibióticas em condições relevantes para a fibrose cística.

Modelo de biofilme agregado de fibrose cística para estudar a expressão gênica relevante para infecção

Este estudo desenvolveu um fluxo de trabalho para a geração e manutenção de linhagens mutantes estáveis para o caracol de maçã de água doce, Pomacea canaliculata. Os protocolos incluem a coleta de zigotos, sua microinjeção com os componentes do sistema CRISPR/Cas9 para induzir a edição do genoma, cultura ex ovo de embriões e genotipagem após cruzamentos controlados.

O Caracol Maçã Dourada Pomacea canaliculata: De Zigotos a Linhagens Mutantes Estáveis

Aprenda a cultivar Balanus improvisus para estudos de expressão gênica e biologia marinha. Este método permite produzir até 50 mil náuplios semanalmente com alta taxa de desenvolvimento.

A craca Balanus improvisus como modelo Marine - cultivo e expressão gênica

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