Hidrogel Bioprintable alginato/gelatina 3D em Vitro sistemas modelo induzem a formação de esferoide de célula
2 de julho de 2018
Desenvolvemos um modelo de câncer de mama heterogênea consistindo de células de tumor e fibroblasto imortalizadas incorporadas em um bioink de alginato/gelatina de bioprintable. O modelo recapitula o microambiente do tumor na vivo e facilita a formação de esferoides tumor multicelulares, produzindo insights sobre os mecanismos de condução tumorigênese.
Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia do câncer, como formação de tumores, rastreamento de migração celular e sinalização de câncer e células saudáveis. A principal vantagem dessa técnica é que ela nos permite estudar a tumorigênese em um ambiente 3D junto com células estromais, como fibroblastos, com baixo custo e alta reprodutibilidade. É importante certificar-se de que os materiais sejam bioimprimíveis e biofuncionais, o que requer um estudo quantitativo de suas propriedades reológicas e compatibilidade celular.
A demonstração visual desse método é crítica, pois as etapas de preparação do hidrogel e mistura do hidrogel celular são difíceis de aprender porque a formação de bolhas interfere na fidelidade do modelo impresso. Em um armário de biossegurança, misture três gramas de alginato e sete gramas de gelatina em pó em um copo de 250 mililitros. Adicione um agitador magnético e 100 mililitros de DPBS.
Sele o copo com filme de parafina estéril e papel alumínio para evitar contaminação. Em seguida, mostre ao participante os gráficos polares únicos e específicos que correspondem aos seus padrões de eletromiografia, ou EMG. Depois disso, continue a agitação em temperatura ambiente por duas horas.
Aqueça a solução a 37 graus Celsius até que o gel sofra uma transição de fase para o estado líquido. Em seguida, transfira a solução para tubos de centrífuga cônicos estéreis de 50 mililitros e feche-os. Centrifugue os tubos a 834 vezes g durante cinco minutos para eliminar as bolhas de gás.
Em seguida, aspire o precursor de hidrogel em seringas de 10 mililitros. Sele as seringas com tampas e filme de parafina. Armazene a quatro graus Celsius até a hora de usar.
Quando estiver pronto para iniciar o teste, coloque uma seringa de precursor de hidrogel preparado em banho-maria a 37 graus Celsius por uma hora. Enquanto a seringa está aquecendo, ligue e inicialize o reômetro. Após uma hora, retire a seringa do banho-maria.
Faça a extrusão de aproximadamente 0,5 mililitros do precursor na plataforma do reômetro. No painel de controle, clique no botão triângulo para baixo. Aguarde até que o instrumento de medição desça para a posição de corte.
Usando uma espátula, corte qualquer excesso de precursor que escapou da borda do instrumento de medição e descarte o material supérfluo. Em seguida, pipete o óleo mineral na borda do instrumento de medição. Aguarde até que o óleo sele totalmente o limite.
No painel de controle, clique em Continuar. Em seguida, clique no botão Iniciar. Após a conclusão do teste, solte a ferramenta de medição e clique no botão triângulo para cima.
Remova o instrumento de medição. Limpe o instrumento de medição e a plataforma com etanol 70%. Primeiro, varreduras completas de amplitude e temperatura conforme descrito no protocolo de texto.
Para iniciar uma varredura de tempo isotérmica, clique em Meus Aplicativos e clique no modelo para Teste de tempo-temperatura isotérmico. Clique na etapa Medição no fluxo de trabalho. Em seguida, clique na tensão de oscilação variável e abra a janela de configuração.
Defina a tensão de oscilação para 0.1% e defina a frequência de oscilação para um hertz. Na janela pull-up, defina o número de pontos de dados como 120. Defina a frequência de coleta de dados para um ponto por minuto.
Clique no botão Adicionar para adicionar a variável de temperatura. Clique na temperatura variável e defina-a para 25 graus Celsius. Clique com o botão direito do mouse na etapa Dispositivo, Mover para o ponto de medição no fluxo de trabalho.
Clique em Excluir. Em seguida, clique na etapa Dispositivo, Definir valor. Desmarque a caixa Aguarde até que o valor seja atingido e defina o valor para 25 graus Celsius.
Clique em Imagem, Título, Botões na tela inferior. Desmarque a caixa Continuar. Em seguida, clique na etapa Começar, nomeie o projeto e salve-o.
Agora carregue a amostra na plataforma do reômetro e inicie o teste seguindo o protocolo de teste geral descrito anteriormente. Depois disso, observe o G linha e o G duplo linha versus o tempo. Encontre o ponto de cruzamento de G linha e G linha dupla e determine o tempo no ponto de cruzamento.
Em seguida, clique em Tabela, copie todos os dados e cole-os em um arquivo de texto. Para medir a resistência ao escoamento em vários momentos de gelificação, clique em Meus aplicativos. Clique no modelo para Tensão de escoamento e fluxo, semelhante a gel.
Nomeie este projeto. Em seguida, clique na etapa Iniciar no fluxo de trabalho. No menu superior, clique em Inserir.
Em seguida, no menu suspenso, selecione Aguarde. Abra a janela de configuração e defina o tempo de espera para 50 minutos. Clique em Iniciar e, em seguida, clique em Inserir novamente.
Selecione Dispositivo no menu suspenso. Abra a janela de configuração, selecione Temperatura e defina-a para 25 graus Celsius. Desmarque a caixa Aguarde até que o valor seja atingido.
No fluxo de trabalho, selecione a etapa Medição. Selecione a variável Tensão de cisalhamento e abra a janela de configuração. Defina a tensão de cisalhamento inicial e final para zero e 10.000 pascal, respectivamente.
Em seguida, clique em Calculadora, defina a densidade de pontos para 0,2 ponto por pascal. Na guia Pontos de dados à esquerda, defina um ponto por segundo. Na parte inferior da janela pull-up, selecione a guia Controle de eventos, defina o critério Parar a medição se a taxa de cisalhamento for maior que 100 por segundo.
Carregue a amostra na plataforma do reômetro e inicie o teste seguindo o protocolo de teste geral descrito anteriormente. Após a conclusão do teste, clique em Diagrama para observar a curva de tensão-deformação. Repita este teste para tempos de espera de 30, 40 e 50 minutos.
As etapas a seguir devem ser executadas em condições estéreis. Para começar, esterilize a bioimpressora borrifando-a completamente com etanol 70% e expondo-a à luz ultravioleta durante a noite. Remova uma seringa de precursor de hidrogel do armazenamento e aqueça-a em banho-maria a 37 graus Celsius por uma hora.
Transferir um frasco em T de células previamente cultivadas de uma incubadora de CO2 para a cabine de biossegurança. Descarte o meio de cultura e enxágue as células duas vezes com DPBS. Adicione uma solução de tripsina-EDTA aquecida às células.
Incube a 37 graus Celsius por seis minutos. Depois disso, desative a tripsina adicionando o mesmo volume de FBS. Retire a seringa do precursor de hidrogel do banho-maria e limpe-a.
Esterilize a seringa com etanol 70% antes de transferi-la para o gabinete de biossegurança. Faça a extrusão de aproximadamente três mililitros de precursor de hidrogel em um cartucho de impressão de 10 mililitros. Misture o precursor com células MDA-MB-231-GFP a uma concentração de um milhão de células por mililitro, pipetando-o lentamente para evitar a produção de bolhas.
Cubra o cartucho com as tampas da extremidade e superior e feche-o com filme de parafina. Em seguida, centrifugue a 834 vezes g por um minuto para eliminar quaisquer bolhas de gás. Repita todo esse processo para os outros precursores.
Depois disso, esterilize todos os três cartuchos com etanol 70%. Carregue os cartuchos esterilizados nas câmaras da bioimpressora. No software de controle da impressora, clique em manual.
Em seguida, expanda a guia Cabeçote da ferramenta no software de controle da impressora. Clique em um cartucho na interface gráfica no lado esquerdo, defina a temperatura do cartucho para 25 graus Celsius e aguarde 35 minutos para permitir que o precursor atinja as condições de impressão. Repita isso para os outros dois cartuchos.
No software de controle da impressora, expanda a guia Cabeça da ferramenta. Clique em um cartucho na interface gráfica e, em seguida, clique no botão de medição curta para medir a posição da ponta do bico. Repita isso para os outros dois cartuchos.
Em seguida, posicione uma microplaca de poliestireno transparente no estágio da impressora. Abra o arquivo de código G e altere a pressão para 200 quilopascais para todos os cartuchos. Retorne ao software de controle e clique na guia Gerador de andaime.
Selecione um ponto para iniciar a impressão e clique no botão Executar. Repita este processo para obter três réplicas. Depois disso, adicione uma solução de cloreto de cálcio a 100 milimolares por um minuto para reticular os modelos.
Enxágue duas vezes com DPBS. Em seguida, use uma espátula para transferir cuidadosamente os modelos para uma placa de seis poços revestida com agarose. Adicione cinco mililitros de DMEM a cada poço e incube a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, substituindo o meio de cultura celular a cada três dias.
Neste estudo, sistemas tridimensionais de hidrogel são fabricados para recapitular microambientes tumorais in vivo e facilitar a formação de esferoides tumorais multicelulares. Uma varredura de temperatura do precursor A3G7 mostra que G double prime é maior que G prime a 37 graus Celsius, o que valida as propriedades conhecidas do precursor. À medida que a temperatura diminui, o precursor sofre gelificação física devido ao emaranhamento físico espontâneo das moléculas de gelatina em uma formação de tripla hélice.
Tanto o G prime quanto o G double prime aumentam a temperatura e convergem a 30,6 graus Celsius, indicando uma transição sol-gel. A microscopia confocal do modelo de hélice impresso mostra que as células MDA-MB-231-GFP começam a desenvolver esferoides 15 dias após o início do período de cultura, e os esferoides continuam a aumentar em tamanho e número até o dia 30. Algumas das células IMR-90-mCherry também são vistas formando aglomerações.
Após 30 dias de cultivo, as células IMR-90-mCherry puderam ser observadas na região inicialmente ocupada pelas células MDA-MB-231-GFP, enquanto as células MDA-MB-231-GFP puderam ser vistas na região dominada por IMR-90-mCherry. Isso implica possíveis eventos de migração no modelo. A microscopia confocal do modelo de disco revela que as células MDA-MB-231-GFP se comportam de forma semelhante ao modelo de hélice, resultando em um hidrogel carregado de esferóides após 21 dias de cultivo.
Uma vez dominada, essa técnica de impressão de modelos pode ser feita em duas horas, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de manter o hidrogel e as células o mais frescos possível, não misturar lotes de hidrogel antigos com novos e trabalhar em condições estéreis para evitar resultados enganosos. Seguindo este procedimento, outros métodos como microscopia eletrônica de varredura e lapso de tempo podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como porosidade do material, taxa de migração celular e remodelação da matriz.
A implicação dessa técnica se estende à terapia do câncer porque esse modelo in vitro permite estudos sistematicamente controlados da formação e comportamento do tumor em sistemas de co-cultura. Além das células de câncer de mama, o modelo também pode ser prontamente aplicado a sistemas que usam outros tipos de células em vários locais iniciais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar modelos 3D de doenças heterogêneas preparando adequadamente os hidrogéis, incorporando células e imprimindo o material dentro da janela de impressão ideal.
Não se esqueça de que trabalhar com amostras biológicas pode ser extremamente perigoso e precauções como usar equipamentos de proteção individual, como luvas, jaleco e óculos de segurança durante a realização deste procedimento.
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Visão Geral
Este estudo apresenta um novo modelo heterogêneo de câncer de mama utilizando células tumorais imortalizadas e fibroblastos em um bioink bioprintável de alginato/gelatina. O modelo imita efetivamente o microambiente tumoral in vivo, permitindo a formação de esferoides tumorais multicelulares e fornecendo insights sobre os mecanismos de tumorigênese.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Biologia do Câncer
- Microambiente Tumoral
- Técnicas de Bioimpressão
Contexto
- Compreender a formação e a progressão tumoral é fundamental na pesquisa sobre câncer.
- Modelos 3D podem replicar melhor as condições in vivo em comparação com culturas tradicionais em 2D.
- Células estromais, como fibroblastos, desempenham um papel significativo na biologia tumoral.
- Materiais bioprintáveis devem ser tanto funcionais quanto compatíveis com as células.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um modelo de tumor 3D economicamente viável e reprodutível.
- Investigar as interações entre células tumorais e células estromais.
- Facilitar a pesquisa sobre tumorigênese e sinalização celular.
Métodos Utilizados
- Preparação de um bioink de alginato/gelatina passível de bioprintagem.
- Mistura de alginato e gelatina em um ambiente controlado.
- Avaliação das propriedades reológicas e da compatibilidade com células.
- Demonstração visual das técnicas de preparação de hidrogéis.
Resultados Principais
- O modelo apoia com sucesso a formação de esferoides tumorais multicelulares.
- Demonstrou baixo custo e alta reprodutibilidade em estudos de tumores.
- Forneceram informações sobre os mecanismos de tumorigênese.
- Destacou a importância das propriedades dos materiais na bioprintagem.
Conclusões
- Este modelo 3D é uma ferramenta valiosa para a pesquisa do câncer.
- Ele aprimora a compreensão das interações entre tumor e estroma.
- Estudos futuros podem aproveitar este modelo para explorar estratégias terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este modelo de hidrogel bioprintável atende à necessidade crítica de sistemas in vitro fisiologicamente relevantes que recapitulem as interações entre tumor e estroma na pesquisa do câncer. Ao permitir o cultivo de longo prazo e a formação de esferoides tumorais multicelulares, ele oferece suporte à desmistificação mecanicista no estágio inicial de descoberta e melhora a confiabilidade preditiva na validação de alvos. A plataforma fornece uma alternativa escalonável e reprodutível aos cultivos em 2D e aos modelos animais para o estudo dos mecanismos de tumorigênese.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar as interdependências entre tumor e estroma e a validação funcional de alvos em um microambiente tridimensional heterogêneo.
- Valor Operacional: Apoia a verificação de hipóteses com componentes estromais para reduzir falsos positivos na seleção de alvos.
Desenvolvimento de Ensaios e Triagem
- Valor Científico: Fornece um sistema padronizado e reproduzível de cultura 3D para triagem de compostos em modelos de tumores contendo estroma.
- Valor Operacional: Facilita a prontidão do ensaio por meio de bioprintagem de alto rendimento e propriedades consistentes do hidrogel.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Modela a migração de células tumorais e interações estromais relevantes para vias de invasão e metástase.
- Valor Operacional: Permite estudos longitudinais (>30 dias) para apoiar a continuidade pré-clínica e a observação de biomarcadores.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho iniciais de descoberta ao fornecer um sistema relevante para a doença, útil para a validação de alvos e identificação de compostos iniciais, com resultados que orientam decisões de prosseguir ou não por meio de leituras fenotípicas e mecanicistas.
- Biologia da Descoberta: Apoia a desmistificação mecanicista ao modelar a formação tumoral e a interação estromal em um ambiente tridimensional controlado.
- Triagem: Permite a avaliação padronizada de compostos em culturas co-cultivadas de tumor e estroma bioprintados, com leituras quantitativas da formação de esferoides.
- Análises: Gera dados de imagem e migração com resolução temporal para comparar condições e avaliar o impacto terapêutico.
- Pesquisa Translacional: Modela a continuidade do microambiente tumoral relevante para humanos, desde a descoberta até a validação pré-clínica.
- Reutilização Corporativa: Estabelece uma tecnologia em plataforma para geração reprodutível de modelos tridimensionais em diversos tipos de câncer e configurações estromais.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança no alvo por meio da modelagem fisiologicamente relevante das interações entre tumor e estroma e da formação de esferoides.
- Valor Operacional: Oferece alta reprodutibilidade e baixo custo na produção em larga escala de modelos tridimensionais complexos.
- Valor Estratégico: Melhora a tomada de decisões de avançar/não avançar ao reduzir a ambiguidade mecanicista em programas oncológicos em estágios iniciais.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos com base na dependência estromal e no potencial tumorigênico em modelos validados.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em bioprintagem, reologia de hidrogéis e técnicas de cultivo celular estéreis.
- Requer instrumentação com reômetro e bioprinter com controle de temperatura e capacidade de esterilização por UV.
- Exige procedimentos operacionais padronizados para a preparação de hidrogéis, encapsulação celular e reticulação para garantir consistência entre os lotes.
- Requer adaptação dos tipos e concentrações celulares ao modelar diferentes sistemas estroma-tumor.
- Limitado pela necessidade de condições estéreis e manipulação cuidadosa para prevenir a formação de bolhas durante a mistura e a impressão.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:04
Title
0:55
Preparation of the A3G7 Hydrogel Precursor
2:49
General Testing Protocol
4:15
Measurements of Rheological Properties of Hydrogels
8:15
Creating a Cell-laden A3 G7 Hydrogel Precursor
11:14
3D Printing Models
12:52
Results: Cell Spheroid Formation Induced by 3D Bioprintable Hydrogel Systems
14:50
Conclusion
