Comportamentais de testes para avaliar déficits funcionais causados pela implantação de microeletrodos no córtex Motor rato roedor

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da engenharia neural, como se a implantação do dispositivo tem implicações para a função motora a longo prazo. A principal vantagem dessa técnica é que, em contraste com a histologia final, o comportamento contínuo fornece uma medição global e em tempo real da função motora ao longo do estudo. Para iniciar este procedimento, injete no animal um antibiótico cefalosporínico por via subcutânea para prevenir infecções e um anti-inflamatório não esteróide para o controle da dor.

Em seguida, aplique pomada oftálmica nos olhos do animal para evitar que sequem. Usando cortadores de unhas de pequenos animais, apare as unhas dos pés para evitar que o animal arranhe as suturas durante a cicatrização da ferida após a cirurgia. Em seguida, forneça um analgésico local com uma injeção subcutânea de bupivacaína na área da incisão na cabeça do animal.

Monte o animal em uma estrutura estereotáxica usando barras de ouvido para evitar que a cabeça se mova durante a cirurgia. Em seguida, coloque uma almofada de aquecimento de água circulante sob o animal para manter sua temperatura interna. Em seguida, esfregue a área cirúrgica usando uma solução alternada de Betadine e esfoliantes de isopropanol.

Em seguida, faça uma pinça do dedo do pé de acordo com o protocolo institucional para garantir que o animal esteja sob o plano cirúrgico. Para preparar o animal para a implantação, faça uma incisão de aproximadamente uma polegada ao longo da linha média para expor o crânio. Remova o periósteo sem corte usando um aplicador com ponta de algodão e pare qualquer sangramento usando um pedaço de gaze.

Em seguida, retraia o tecido circundante usando pinças jacaré ou hemostáticos. Depois que o crânio for limpo, aplique algumas gotas de adesivo tecidual à base de cianoacrilato no crânio exposto para melhorar a colagem do cimento dentário em etapas posteriores. No hemisfério escolhido, marque a região do córtex motor correspondente ao movimento da pata dianteira, criando um corte no osso.

Remova uma parte do crânio usando uma broca odontológica de ponta arredondada de 1,75 milímetros, levando em consideração especial para não perfurar muito rápido ou muito profundamente. A broca deve ser aplicada no crânio de forma intermitente para evitar superaquecimento. Usando solução salina e sucção leve, remova quaisquer detritos ósseos do crânio.

Tenha cuidado para não danificar a dura-máter durante a perfuração. Em seguida, use rongeurs finos ou microfórceps curvos para remover o osso restante. Depois, reflita a dura-máter usando uma palheta de 45 graus com gancho fino.

Limpe qualquer sangramento usando um aplicador com ponta de algodão e soro fisiológico, tomando cuidado para não tocar diretamente na superfície do cérebro. Para inserir o microeletrodo no córtex motor, monte cuidadosamente o microeletrodo esterilizado no suporte universal na estrutura estereotáxica, tomando cuidado para não bater na haste do eletrodo. Certifique-se de que o cabeçote stage conector de interface do eletrodo esteja firmemente preso pelo suporte.

Usando o micromanipulador na estrutura estereotáxica, posicione cuidadosamente a ponta do eletrodo sobre a craniotomia aberta. Abaixe suavemente o eletrodo aproximadamente dois milímetros no cérebro. Tome cuidado para evitar qualquer vasculatura visível sempre que possível.

Para inserção manual/manual, conforme demonstrado aqui, micropinças são usadas para inserir o microeletrodo fictício não funcional de silicone. Assim que o eletrodo estiver no lugar, solte cuidadosamente o conector do suporte universal e retraia o braço de inserção. Limpe cuidadosamente qualquer sangramento ao redor do eletrodo usando um aplicador com ponta de algodão e soro fisiológico.

Posteriormente, sele a craniotomia ao redor do eletrodo implantado usando um elastômero de silicone. Em seguida, fixe o eletrodo no crânio usando cimento dental. Quando o cimento estiver completamente seco, junte as bordas da incisão na frente e atrás da tampa da cabeça de cimento e suture-as.

Para implantes não funcionais, toda a incisão pode ser fechada. Para iniciar o teste de grade de campo aberto, coloque o animal no centro da grade, de costas para o testador. Deixe o animal correr livremente por três minutos enquanto grava um vídeo.

Quando o animal tiver concluído o teste, remova-o da grade e limpe-a completamente com esterilizante à base de dióxido de cloro. Analise o número de linhas de grade cruzadas, a distância total percorrida e a velocidade máxima do animal como métricas da função motora grossa usando um software de rastreamento de vídeo. Para o teste em escada, é necessária uma semana de treinamento antes de registrar as pontuações iniciais pré-cirúrgicas.

Em seguida, transfira o animal para uma gaiola de retenção limpa temporária para iniciar o teste de escada. Defina a escada de forma que ela faça a ponte entre duas gaiolas. A extremidade inicial da escada repousa sobre uma gaiola limpa e a extremidade final repousa na gaiola doméstica do animal para servir de motivação para completar a corrida.

Posicione a câmera de vídeo usada para filmar o teste da escada em um tripé no centro da escada em torno da altura do degrau. Com uma câmera de vídeo funcionando, segure o animal na linha de partida da escada, permitindo que suas patas dianteiras toquem o primeiro degrau. Permita que o rato atravesse a escada em seu próprio ritmo.

O tempo decorrido entre o momento em que a pata do animal toca o primeiro degrau e a linha de chegada do terceiro ao último degrau determinará o tempo do animal para atravessar. Se o animal se virar na escada ou não se mover por um período de 20 segundos, considere que o animal falha. Atribua a ele um tempo de pontuação de penalidade para cada corrida com falha e determine o tempo de penalidade pelo desempenho mais lento registrado durante o teste pré-operatório.

Permita que cada animal atravesse a escada cinco vezes por dia de teste, com aproximadamente um minuto de descanso entre cada corrida. Calcule a média das três corridas mais rápidas por dia como uma métrica da função motora fina. Além disso, registre o número de vezes que cada uma das patas dianteiras escorrega dos degraus usando um software de rastreamento de vídeo.

Para testes de força de preensão, posicione o medidor de força de preensão na borda do balcão com o guidão estendido sobre o chão. Em seguida, permita que o animal agarre o guidão com as duas patas dianteiras enquanto segura o animal pela base da cauda. Uma vez que o animal tenha um aperto firme com cada pata, puxe-o para longe do metro pela base da cauda com força lenta e constante.

Registar a força máxima de preensão exercida pelo animal pelo medidor de força de preensão. Testar cada animal três vezes por dia de teste, com aproximadamente dois minutos de descanso entre cada teste. Como uma métrica da função motora fina, registre e calcule a média da força máxima de preensão de cada uma das três tentativas.

Diferença significativa no desempenho da grade de campo aberto entre os animais controle e implantado foi observada apenas na primeira semana de testes após o período de recuperação. Não houve diferença no desempenho para o restante do estudo, indicando que não houve déficit da função motora grossa a longo prazo. Além da primeira semana de testes pós-recuperação, os animais de controle cruzam a escada significativamente mais rápido do que os animais implantados.

Os animais implantados não foram capazes de manter as velocidades de cruzamento de escadas pré-operatórias, indicando possíveis déficits na função motora fina. Isso é ainda mais apoiado pelo aumento da ocorrência de deslizamentos da pata direita em animais implantados, correlacionados à região do cérebro que recebe um implante. Os animais de controle geralmente alcançaram resultados de força de preensão significativamente mais altos em comparação com os animais implantados ao longo do estudo.

Além disso, os animais implantados tiveram um desempenho significativamente inferior ao desempenho basal imediatamente após a recuperação, mas melhoraram com o tempo e retornaram ao desempenho inicial. Aqui é mostrada a correlação do desempenho da escada com a intensidade de fluorescência da imunoglobulina G, um marcador da permeabilidade da barreira hematoencefálica. Um coeficiente de correlação de 0,901 foi encontrado, indicando uma correlação muito forte.

Uma vez dominada, esta técnica pode ser realizada em aproximadamente 30 minutos por animal por sessão de teste. Ao tentar este procedimento, é importante reduzir as variáveis ambientais, pois elas podem distrair os animais da tarefa em questão. Após este procedimento, outros métodos, incluindo imuno-histoquímica ou outras técnicas de imagem de luz, podem ser realizados para investigar a resposta celular ou tecidual à microeletrônica implantada.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar um ensaio rápido, simples e repetível para déficits motores grossos e finos que podem surgir da implantação do dispositivo ou lesão no córtex motor primário.