Name: Uma combinatória célula única abordagem para caracterizar o Molecular e imunofenotípica heterogeneidade de tronco humano e populações de Progenitor (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-25T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Aprenda a combinar análise de expressão gênica de célula única com FACS para caracterizar heterogeneidade em populações de células-tronco e câncer. Este método revela tipos celulares distintos e potencial de linhagem.

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Este trabalho é apoiado por subsídios da sociedade sueca de câncer, o Conselho Sueco de pesquisa, a sociedade sueca para pesquisa médica, o sueco Childhood Cancer Foundation, a Fundação de Ragnar Söderberg e The Knut e Alice Wallenberg Foundation

1. preparação das placas de Lise
<ol><li>Usando um banco livre de RNA/DNA, prepare o suficiente do lysis para 96 poços, com 10% extra, misturando 390 água livre da nuclease µ l, 17 µ l de 10% NP-40, 2,8 µ l 10 mM dNTP, 10 µ l 0,1 M DTT e inibidor de RNAse 5,3 µ l (ver Tabela de materiais). Vórtice e spin-down.</li>
	<li>Distribuir 4 µ l de tampão de Lise para cada poço de uma placa PCR bem 96 e selar as placas com película adesiva. Spin para baixo os tubos para coletar o líquido na parte inferior das placas. Mantém as placas no gelo até a célula classificação (máximo 24 h).</li>
</ol>2. preparação de células para triagem de célula
<ol><li>Descongele o número adequado de células (aqui, CD34 enriquecido tronco hematopoiético e células progenitoras) para o experimento. 1 x 106 células são apropriadas para aproximadamente três placas de 96 poços de single-células com controles de classificação.</li>
	<li>Transferência de células descongeladas para um tubo cônico de 15 mL e adicionar 1 mL FBS cada 30 s até um volume total de 8 mL é atingido. Girar as células em uma centrífuga a 350 x g durante 10 minutos a 4 ° C e remover o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células em 8 mL de tampão de coloração (PBS com 2% FBS) e centrifugar a 350 x g durante 10 minutos a 4 ° C e remover o sobrenadante.</li>
	<li>Os eritrócitos de coloração, 200 µ l de buffer e remover células para manchas de controle.</li>
	<li>Fazer fluorescência menos um controles (FMO) para cada fluoróforo, manchando uma fração das células em 50 µ l de tampão de coloração. Neste exemplo, 6 tubos de microcentrifuga com 20.000 células são usados como FMOSs. Observe que o número de células deve ser ajustado dependendo da população investigada. Adicione todos os anticorpos na mesma concentração como a mancha de amostra, com exceção de um para cada tubo.</li>
	<li>Fazer manchas única para cada fluoróforo manchando uma fração de células no buffer de 50 µ l de cada fluoróforo usado. Neste exemplo são utilizados 6 tubos microcentrifuga com 20.000 células. Observe que o destino de cada anticorpo precisa ser expresso pelas células usadas para controles. Adicione cada anticorpo na mesma concentração como a mancha de amostra em tubos individuais. Além disso, manter 20.000 células imaculadas em 50 µ l como um controle imaculado.</li>
	<li>Para a amostra de célula, acrescente os anticorpos em sua concentração adequada. Usados aqui são CD34-FITC numa concentração de 1/100, 1/50, CD38-APC CD90-PE 1/10, 1/50 CD45RA-bv421, CD49F-PECy7 1/50 e Mix de linhagem: CD3-PECy5 1/50, CD2-PECy5 1/50, CD19-PECy5 1/50, 1/50 de CD56-PECy5, CD123-PECy5 1/50, CD14-PECy5 1/50, CD16-PECy5 1/50, e CD235a-PECy5 1/1000.</li>
	<li>Incube as células com anticorpos por 30 min no gelo no escuro.</li>
	<li>Lavam-se células com 3 mL de tampão de coloração. Centrifugar as células a 350 x g durante 10 minutos a 4 ° C e remover o sobrenadante.</li>
	<li>Ressuspender as células e repita o passo 2.9.</li>
	<li>Resuspenda amostra em 500 µ l e FMO em 100 µ l de tampão com células 7AAD e filtro de 1/100 de coloração através de um filtro de 50 µm para obter uma suspensão de célula única.</li>
</ol>3. célula de triagem
<ol><li>Certifique-se de que a máquina de FACS é definida corretamente com atraso de entrega e instalação do citômetro e rastreamento (CST) que recentemente foram executados de acordo com as instruções do fabricante, para garantir que as células adequadas são classificadas. Para células hematopoiéticas, é recomendado o uso do mícron 85 bocal e máxima velocidade de 4, enquanto a taxa de evento ideal é entre 800 e 2000 eventos/s.</li>
	<li>Corrigir para sobreposição espectral, realizando a compensação de fluorescência e conjunto de portões de acordo com FMO controles ou controles internos negativos.</li>
	<li>Execute a reanálise da população alvo, classificando a pelo menos 100 células de destino em um novo tubo de microcentrifuga com 100 µ l de tampão de mancha. FACS analisar as células classificadas pela gravação da amostra classificada e certifique-se de que eles acabam na porta do tipo.</li>
	<li>Instalação placa de célula simples classificação por centrar a queda no poço A1 em um prato bem 96. Quando está centrado, tipo 50 – 100 6 µm de partículas em todos os poços em torno da borda de um prato vazio de 96 bem para garantir que todos os poços terá uma cela no centro de cada poço.</li>
	<li>Se possível, um controle adicional para garantir que as células viáveis são classificadas pode ser adicionado, classificando single-células para crescimento em vitro . As células hematopoiéticas podem ser cultivadas em placas bem de fundo U 96 em 100 µ l SFEM com estreptomicina de penicilina de 1%, 100 ng/mL, FLT3L, TPO e SCF. Analise cada poço após 3 dias na cultura para colônias de célula, usando um microscópio.</li>
	<li>Remova a película adesiva de placas. Tipo uma única célula de interesse (aqui Lin-CD34 + CD38-células) em 92 de 96 poços, ativar índice-classificação-nos FACS classificação software para salvar o perfil imunofenotípica para outros marcadores de interesse (aqui CD45RA, CD49f e CD90) para cada célula única.</li>
	<li>Classificar dois poços com células de 10 e 20, respectivamente para controles de linearidade na amplificação por PCR. Poços de H1 e H2 são usados geralmente.</li>
	<li>Manter dois poços sem quaisquer células como não-modelo controla, geralmente poços H3 e H4.</li>
	<li>Selar as placas com película adesiva e girar as placas a 300 x g por 1 min antes snap congelando em gelo seco.</li>
	<li>Armazenar as placas congeladas a-80 ° C. Nota: Ponto de parada segura. Classificada e lisadas células podem ser mantidas a-80 ° C para armazenamento a longo prazo.</li>
</ol>4. inverter a transcrição e a amplificação de destino específico
<ol><li>Prepare a mistura de cartilha para todos os destinos do gene 96 adicionando 2 µ l de cada par de primer, incluindo limpeza gene primers e primers para cravado no controle do RNA, em um 1,5 mL tubo livre de RNAse num banco livre de RNA/DNA. Se usar menos de 96 cartilhas, adicione uma quantidade equivalente de água livre de nuclease para os primers faltando. As primeiras demão são ordenadas separadamente para combinar com o painel do gene desejado.</li>
	<li>Fazer a transcrição reversa e amplificação de destino específico mistura adicionando 632.5 µ l 2 x a mistura de reação, 101.2 µ l Taq/SuperscriptIII, mistura de Primer 151.8 µ l e 0,7 µ l cravado no controle do RNA. Pré-forma esta etapa em um banco de DNA gratuito. Mix por num Vortex e spin para baixo para coletar o líquido no fundo do tubo. Manter-se no gelo até adição à amostra.</li>
	<li>Faça transcrição reversa-não mistura de controle por quatro poços misturando 27,5 µ l da mistura de reação de 2x, 1.76 µ l da enzima Taq, 6.6 µ l de mistura da primeira demão e 2.64 µ l de água livre de nuclease. Spike no controle do RNA. Execute esta etapa em um banco de DNA gratuito. Vórtice e spin para baixo para coletar o líquido na parte inferior do tubo e manter em gelo até adição de amostra.</li>
	<li>Descongele o lisado placas no gelo. Adicione 8,75 µ l da transcrição reversa previamente preparada e mistura de amplificação de destino específico para 92 poços, incluindo os controles de linearidade e não-modelo. Adicione 8,75 µ l do mix de controle não-reverso transcrição nos quatro poços restantes. Selar as placas com película adesiva e rotação para baixo para coletar líquido na parte inferior das placas.</li>
	<li>Pré-forma transcrição reversa e amplificação de destino específico, executando a placa em uma máquina PCR de acordo com o programa do pré-amplificador; Passo 01:50 ° C por 60 min, passo 2: 95 ° C por 2 min, passo 3: 95 ° C por 15 s, passo 4: 60 ° C por 4 min, repetir os passos 3 – 4 24 vezes e finalmente passo 5: 8 ° C para sempre.</li>
	<li>Depois de PCR está completo, manter a placa a 8 ° C para armazenamento de curto prazo e -20 ° C para armazenamento a longo prazo. Nota: Ponto de parada segura. Material amplificado pode ser mantido a 8 ° C para armazenamento de curto prazo e a-20 ° C para armazenamento a longo prazo.</li>
</ol>5. preparação da amostra e placas de ensaio para análise da expressão de Gene de Microfluidic Multiplex
<ol><li>Preparar o ensaio carregando a placa por pipetagem 3 reagente de carregamento do ensaio µ l de cada poço de uma placa bem 96. Adicione 3 µ l de cada primer para poços individuais no ensaio de placa de carregamento.</li>
	<li>Placa com película adesiva e spin para baixo para coletar líquido na parte inferior das placas do selo.</li>
	<li>Prepare a placa de diluição por pipetagem µ l 8 de nuclease água livre em todos os poços de uma placa bem 96. Adicione 2 µ l de amostra amplificada para a placa de diluição, tornando uma diluição final de 1:5.</li>
	<li>Placa com película adesiva do selo, misture por placa num Vortex para 10 s e finalmente girar para baixo para coletar líquido na parte inferior das placas.</li>
	<li>Prepare a mistura de carregamento da amostra misturando cuidadosamente 352 µ l do mix mestre com 35,2 µ l de reagente de carregamento de amostra. Prepare a placa de carregamento da amostra por alíquotas 3.3 µ l de mistura para cada poço de uma placa bem 96 a carregar.</li>
	<li>Adicione 2,7 µ l da amostra diluída em cada poço da amostra carregando a placa.</li>
	<li>Placa com película adesiva e spin para baixo para coletar líquido na parte inferior das placas do selo.</li>
</ol>6. carregamento de Microfluidic Chip
<ol><li>Tire um novo chip de microfluidic 96 x 96. Prepare entradas, picando-os com uma seringa com tampa em ter a certeza de que eles podem ser movidos.</li>
	<li>Remova as bolhas de seringas. Adicione o volume completo de seringas para cada válvula enquanto o chip de inclinação de 45 graus e pressionando para baixo a válvula. O primeiro chip com o controlador da IFC.</li>
	<li>Carrega a cada entrada de ensaio com 4,25 µ l de cada um dos poços no ensaio de placa de carregamento. Evite bolhas. Se as bolhas aparecem no poço, removê-los com a ponta da pipeta.</li>
	<li>Continuar a carregar a cada entrada de amostra com 4,25 µ l de cada um dos poços na amostra carregando a placa, evitar bolhas e se aparecem bolhas, remova-os com a ponta da pipeta.</li>
	<li>Carregar o chip com o controlador da IFC.</li>
	<li>Verifique se o chip parece mesmo e que todas as câmaras foram carregadas. Remova o pó da superfície do chip por tocá-lo com fita adesiva. Execute o chip na plataforma de expressão do gene microfluidic multiplex.</li>
</ol>7. executando o Chip na plataforma de expressão do Gene de Microfluidic Multiplex
<ol><li>Depois de carregar o chip para a plataforma de expressão do gene microfluidic multiplex, o nome da amostra.</li>
	<li>Definir ROX como corante passiva. Conjunto único teste e FAM-MGB como fluorescência. Use padrão 96x96 v2 como protocolo. Inicie-executar.</li>
	<li>Chip de remover quando executar é completa.</li>
</ol>8. preliminar análise da gerência de Chip
<ol><li>Carregar dados no software de análise de PCR em tempo real.</li>
	<li>Carregar o gene nomes e nomes de células colando layouts de célula e o gene de um arquivo delimitado por tabulação.</li>
	<li>Abra o Visualizador de imagens e selecione ROX como corante. Verifique se todos os poços tem tintura passiva ROX.</li>
	<li>Investiga se todas as parcelas de amplificação olhem okey, com uma curva suave de amplificação com sem espinhos (semelhantes a Figura 3E).</li>
	<li>Certifique-se de que todos os single-células têm expressão de cravado no controle do RNA para certificar-se de que todos foram carregados corretamente.</li>
	<li>Certifique-se de que todas as células têm expressão de gene das tarefas domésticas e, portanto, foram classificadas corretamente.</li>
	<li>Certifique-se que 10 a 20 controles de linearidade de célula tem aproximadamente 1 CT diferença para validar a amplificação linear.</li>
	<li>Verifique se há expressão nas amostras controle noRT. Se a expressão for detectado no noRT considere mudar sondas para pontas de prova que não detecta o DNA genômico para execuções subsequentes.</li>
	<li>Exporte dados em ficheiros csv para posterior análise.</li>
</ol>9. célula única análise usando SCExV
Nota: Um filme introdutório é presente20 para introduzir a ferramenta. Aqui, uma recomendação curta de como fazer a análise usando os controles introduzidos no protocolo é apresentada.
<ol><li>Ligue para o SCexV site20.</li>
	<li>Upload de arquivos CSV exportados.</li>
	<li>Escolheu o controle cravado no RNA como controle positivo. Remova qualquer célula que tem um controle de RNA CT acima de 25. Normalize os dados de expressão mediana do controle do RNA.</li>
	<li>Clique em "aqui -> Analyze". Remova noRT, notemplate, controles de célula de 10 e 20 na opção excluir células.</li>
	<li>Aglomerado de células com a abordagem de clusterização de escolha com o número esperado de clusters. Valores de exportação analisado.</li>
</ol>10. classificação de índice de análise
<ol><li>Abra o software de análise de FACS e carregar as amostras indexadas.</li>
	<li>Abra o editor de scripts e execute o script disponível de Quinn J. et al . 21
</li>
	<li>Agora que o software de análise de FACS deveria ter feito um portão para cada uma das células simples, abra o editor de layout e cor das células de acordo com o agrupamento de SCexV (disponível no arquivo chamado "Sample_complete_Data.xls").</li>
</ol>

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<li>Schulte, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Index+sorting+resolves+heterogeneous+murine+hematopoietic+stem+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Hematology%22%5BJournal%5D)">Index sorting resolves heterogeneous murine hematopoietic stem cell populations.</a> Experimental Hematology. 43 (9), 803-811 (2015).</li>
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Os autores não têm nada para divulgar.

Nos últimos anos, a análise da expressão de gene de célula única tornou-se uma adição valiosa para definir a heterogeneidade de várias populações de nível23. O advento das tecnologias de sequenciamento de RNA teoricamente fornece a possibilidade de medir a transcriptoma inteira de uma célula, no entanto, esses métodos são complicados por variações em profundidades de sequenciamento de célula para célula e abandono. Célula única qPCR oferece uma análise sensível e robusta da expressão de centenas d...

Cada célula individual do sangue é acreditada para residir em uma hierarquia de celular, onde as células-tronco formam o ápice em cima de uma série de progenitores intermediários cada vez mais comprometidos que eventualmente terminal se diferenciar em células efetoras final carregando específicas funções biológicas1. Muito do conhecimento sobre como os sistemas de células-tronco são organizados foi gerado no sistema hematopoiético, em grande parte devido a capacidade de isolar prospectivamente distintas populações hematopoiéticas altamente enriquecidas para células-tronco ou progenitoras vários2 , classificando o FACS. Isto permitiu para muitas dessas populações a serem analisados funcionalmente ou molecularmente, predominantemente através da expressão do gene de perfil3,4. No entanto quando analisando a expressão gênica das diferenças individuais de em massa das populações entre as células são em média para fora e perdeu5. Assim, incapacidade para detectar variações de célula para célula dentro frações heterogêneas célula pode confundir nosso entendimento de processos biológicos críticos se pequenos subconjuntos de células esclarecem a função biológica inferida do que a população6, 7. Por outro lado, investigação das assinaturas de expressão do gene na célula única resolução oferecem uma possibilidade de delinear a heterogeneidade e contornar a sombra influências de sobre-representados subconjuntos de células8.
Até à data têm sido desenvolvidos muitos protocolos para análise de expressão do gene de célula única; com cada abordagem tendo suas próprias limitações. O método mais antigo foi RNA fluorescente em situ hibridação (RNA-FISH), que mede um número limitado de transcrições de cada vez, mas é o único que permite a investigação de RNA localização9,11. Início métodos usando PCR e qPCR para detectar que um único ou poucos transcrições foram também desenvolvidos12. No entanto, estas ultimamente foram substituídas por métodos baseados em microfluídica que podem analisar simultaneamente a expressão de centenas de transcrições por célula em centenas de células através da qPCR e assim permitir para o uso de análise dimensional elevada heterogeneidade Pre-determinado gene painéis10,13. Recentemente tecnologias baseadas em sequenciamento de RNA tem tornar-se amplamente utilizadas para análise de célula única, como estes teoricamente podem medir a transcriptoma inteira de uma célula e, assim, adicionar uma dimensão exploratória a heterogeneidade análise10, 14. análise de qPCR multiplexados e sequenciamento de RNA de célula única têm características diferentes, assim, a justificativa para usar um dos métodos depende a pergunta, bem como o número de células na população-alvo. A alta produtividade e baixo custo por célula juntamente com características imparciais, exploratórias de sequenciamento de RNA de célula única são desejáveis quando célula desconhecida ou grandes populações são investigadas. No entanto, a sequenciação do ARN de célula única também é inclinada para sequenciamento transcrições abundantes altas mais frequentemente enquanto transcrições com baixa abundância são propensas a desistentes. Isso pode levar a dados consideravelmente complexos que coloca exigências de alta na análise de bioinformatic revelar importantes sinais moleculares que são muitas vezes sutis ou ocultas em ruído técnica15. Assim, para tecidos bem caracterizados, qPCR célula única análise usando pre-determinada painéis cartilha selecionados para funcionalmente importantes genes ou marcadores moleculares podem servir como uma abordagem sensível, simples para determinar a heterogeneidade de um população. No entanto, deve notar-se que em relação à célula única RNA-seq, o custo de cada célula é geralmente maior para métodos de célula única qPCR. Aqui, descrevemos uma abordagem que combina monocelulares RT-qPCR (modificado de J. Teles et al 16), índice de FACS classificação17 e bioinformática análise18 para simultaneamente caracterizam a heterogeneidade molecular e imunofenotípica dentro das populações.
Nesta abordagem, a população de células de interesse está manchada, e single-células são classificadas por FACS diretamente em tampão de Lise em placas de PCR de 96 poços. Simultaneamente, os níveis de expressão de um conjunto adicional de marcadores de superfície celular são registrados para cada célula única durante FACS-classificação, um método que é conhecido como índice de classificação. O material de lisados celulares é posteriormente amplificado e a expressão do gene de um conjunto selecionado de genes analisados com RT-qPCR, usando uma plataforma microfluidic. Esta estratégia permite a análise molecular da caracterização de célula única, bem como simultânea classificada de expressão do cada célula marcador da pilha-superfície. Mapeando diretamente molecularmente distintos subconjuntos de células para a expressão dos marcadores classificadas de indexado, as subpopulações podem ser vinculadas a um imunofenótipo específico que pode ser usado para seu isolamento em perspectiva. O método é descrito passo a passo na Figura 1. Um painel pre-determinado gene mais contribui para uma maior resolução da expressão do gene alvo, desde que contorna a medição dos genes abundantes irrelevantes que caso contrário pode ocluir os sinais de expressão do gene sutil. Além disso, a amplificação de destino específico, transcrição reversa de um passo e amplificação permite a medição robusta de baixas transcrições expressadas, como factores de transcrição ou RNAs não-poli-adenylated. Importante, qPCR métodos permitem a medição de mRNA de proteínas da fusão, que são importantes na investigação de determinadas doenças malignas,19. Finalmente, o foco número dos genes investigados, baixas taxas de abandono, e limitado as diferenças técnicas entre as células fazem este método facilmente analisado em comparação com métodos dimensionais mais elevados, como célula única RNA-Seq Seguindo o protocolo, pode ser realizada uma experiência inteira, de classificação células para resultados analisados, no prazo de três dias, tornando este um método simples e rápido para análise de expressão do gene de célula única sensível, elevado-throughput.

<table><tbody><tr><td>CD14 PECY5</td><td>eBioscience</td><td>15-0149-42</td><td>Clone: 61D3</td></tr><tr><td>CD16 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>302010</td><td>Clone: 3G8</td></tr><tr><td>CD56 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>304608</td><td>Clone: MEM-188</td></tr><tr><td>CD19 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>302210</td><td>Clone: HIB19</td></tr><tr><td>CD2 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>300210</td><td>Clone: RPA-2.10</td></tr><tr><td>CD3 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>300310</td><td>Clone: HIT3a</td></tr><tr><td>CD123 PECY5</td><td>Biolegend</td><td>306008</td><td>Clone: 6H6</td></tr><tr><td>CD235A PECY5</td><td>BD Pharma</td><td>559944</td><td>Clone GAR2</td></tr><tr><td>CD34 FITC</td><td>Biolegend</td><td>343604</td><td>Clone: 561</td></tr><tr><td>CD38 APC</td><td>Biolegend</td><td>303510</td><td>Clone: Hit2</td></tr><tr><td>CD90 PE</td><td>Biolegend</td><td>328110</td><td>Clone: 5E10</td></tr><tr><td>CD45RA BV421</td><td>BD biociência</td><td>560362</td><td>Clone: HI100</td></tr><tr><td>CD49f Pecy7</td><td>eBioscience</td><td>25-0495-82</td><td>Clone: eBioGOH3</td></tr><tr><td>FBS</td><td>HyClone</td><td>SV30160.3</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>HyClone</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>Placa de fundo em u de 96 poços</td><td>VWR</td><td>10861-564</td><td></td></tr><tr><td>SFEM</td><td>Tecnologias de células-tronco</td><td>9650</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina estreptomicina</td><td>HyClone</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>Peprotech</td><td>300-18</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>Peprotech</td><td>300-07</td><td></td></tr><tr><td>FLT3L</td><td>Peprotech</td><td>300-19</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 15 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorph tube</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.001</td><td></td></tr><tr><td>CST beads</td><td>BD</td><td></td><td></td>642412</tr><tr><td>Contas Accudrop</td><td>BD</td><td>345249</td><td>6 &micro; m partículas&nbsp;</td></tr><tr><td>Filme adesivo Clear</td><td>Thermo scientific&nbsp;</td><td>AB-1170</td><td></td></tr><tr><td>Filme adesivo Folha</td><td>Thermo scientific&nbsp;</td><td>AB-0626</td><td></td></tr><tr><td>Placa PCR de 96 poços</td><td>Axygen</td><td>PCR-96M2-HS-C</td><td></td></tr><tr><td>PCR tubo de 1,5 mL</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-L-C</td><td></td></tr><tr><td>T100 PCR cycler</td><td>BioRad</td><td>186-1096</td><td></td></tr><tr><td>10% NP40</td><td>Thermo scientific&nbsp;</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>10 mM dNTP</td><td>Takara</td><td>4030</td><td></td></tr><tr><td>0.1 M DTT</td><td>Invitrogen</td><td>P2325</td><td></td></tr><tr><td>RNAsout</td><td>Invitrogen</td><td>10777-019</td><td>Inibidor de RNAse</td></tr><tr><td>CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit</td><td>Invitrogen</td><td>11753-100</td><td></td></tr><tr><td>Água sem neuclet</td><td>Invitrogen</td><td>11753-100</td><td>do kit CellsDirect</td></tr><tr><td>2x Reaction Mix</td><td>Invitrogen</td><td>11753-100</td><td>do kit</td></tr><tr><td>CellsDirect SuperScript III RT/Platinum Taq Mix</td><td>Invitrogen</td><td>11753-100</td><td>do kit CellsDirect</td></tr><tr><td>Platinum&nbsp; Taq&nbsp; DNA Polimerase</td><td>Invitrogen</td><td>10966026</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Cells-to-CT Control Kit</td><td>Invitrogen</td><td>4386995</td><td></td></tr><tr><td>Xeno RNA</td> Control <td>Invitrogen</td><td>4386995</td><td>From TaqMan Cells-to-CT Control</td></tr><tr><td>20x Xeno RNA Control Taqman Gene Expression Assay</td><td>Invitrogen</td><td>4386995</td><td>From TaqMan Cells-to-CT Control Kit</td></tr><tr><td>96.96 Sample/Loading Kit&mdash; 10 IFCs</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M10-96.96</td><td></td></tr><tr><td>2x Reagente de Carregamento de Ensaio</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>De 96.96 Kit de Amostra/Carregamento</td></tr><tr><td>20x GE Sample Reagent de Carregamento</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>De 96.96 Kit de Amostra/Carregamento</td></tr><tr><td>de Fluido de linha de controle&nbsp;</td><td>Fluidigm</td><td></td><td>From 96.96 Kit de Amostra/Carregamento</td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4369016</td><td></td></tr><tr><td>BioMark HD</td><td>Fluidigm</td><td>BMKHD-BMKHD</td><td></td></tr><tr><td>96.96 Dynamic Array IFC</td><td>Fluidigm</td><td>BMK-M10-96.96GT</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo V10</td><td>TreeStar</td><td>TreeStar</td><td></td></tr><tr><td>Análise de PCR em tempo real Fluidigm</td><td>Fluidigm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CD179a.VPREB1</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00356766_g1</td><td></td>científica</tr><tr><td>ACE</td><td>Thermofisher científica</td><td>Hs00174179_m1</td><td></td></tr><tr><td>AHR</td><td>Thermofisher Hs00169233_m1 científica</td><td>BCR_ABL.52</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Thermofisher Hs03043652_ft científica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BCR_ABL41</td><td>Thermofisher Hs03024541_ft</td><td></td><td></td>científica</tr><tr><td>BMI1</td><td>Thermofisher Hs00995536_m1</td><td></td><td></td>científica</tr><tr><td>CCNA2</td><td>Thermofisher Hs00996788_m1</td><td></td><td></td>científica</tr><tr><td>CCNB1</td><td>Thermofisher Hs01030099_m1</td><td></td><td></td>científica</tr><tr><td>CCNB2</td><td>Thermofisher Hs01084593_g1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>científica CCNC</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01029304_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCNE1</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01026535_g1</td><td></td></tr><tr><td>CCNF</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00171049_m1</td><td></td></tr><tr><td>CCR9</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01890924_s1</td><td></td></tr><tr><td>CD10. Hs00153510_m1 científica MME</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00158218_m1</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td>científica<td>CD11a</td><td>Thermofisher</td></tr><tr><td>científica CD11c.ITAX</td><td>Thermofisher Hs00174217_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>científica CD123. IL3RA</td><td>Thermofisher Hs00608141_m1</td><td></td><td></td>científica</tr><tr><td>CD133. PROM1</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01009250_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD151</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00911635_g1</td><td></td></tr><tr><td>CD220. INSR</td><td>Thermofisher Hs00961554_m1</td><td></td><td></td>científica</tr><tr><td>CD24. HSA</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs03044178_g1</td><td></td></tr><tr><td>NCOR1</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01094540_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD26. DPP4</td><td>Thermofisher Hs00175210_m1</td><td></td><td></td>científica</tr><tr><td>CD274</td><td>Thermofisher científica</td><td>Hs01125301_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD276</td><td>Thermofisher científica</td><td>Hs00987207_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD32. FCGR2B</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01634996_s1</td><td></td></tr><tr><td>CD33</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01076281_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD34</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00990732_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD344. FZD4</td><td>Thermofisher Hs00201853_m1</td><td></td><td></td>científica</tr><tr><td>CD352. SLAMF6</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01559920_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD38</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01120071_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD4</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01058407_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD41. ITGA2B</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01116228_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD49f.ITGA6</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01041011_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD56. NCAM1</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00941830_m1</td><td></td>científica</tr><tr><td>CD9</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00233521_m1</td><td></td>científica</tr><tr><td>CD97</td><td>Thermofisher científica</td><td>Hs00173542_m1</td><td></td></tr><tr><td>CD99</td><td>Thermofisher Hs00908458_m1</td><td></td><td></td>científica</tr><tr><td>CDK6</td><td>Thermofisher Hs01026371_m1</td><td></td><td></td>científica</tr><tr><td>CDKN1A</td><td>Thermofisher Hs00355782_m1</td><td></td><td></td>científica</tr><tr><td>CDKN1B</td><td>Thermofisher</td><td>Hs01597588_m1</td><td></td>científica</tr><tr><td>CDKN1C</td><td>Thermofisher Hs00175938_m1</td><td></td><td></td>científica</tr><tr><td>CEBPa</td><td>Thermofisher Hs00269972_s1</td><td></td><td></td>científica</tr><tr><td>CSF1r</td><td>Thermofisher Hs00911250_m1</td><td></td><td></td>científica</tr><tr><td>CSF2RA</td><td>Thermofisher científica</td><td></td><td></td>Hs00531296_g1</tr><tr><td>Hs01114427_m1</td><td></td>científica<td>CSF3RA</td><td>Thermofisher</td></tr><tr><td>E2A. TCF3</td><td>Thermofisher Hs00413032_m1</td><td></td><td></td>científica</tr><tr><td>EBF1</td><td>Thermofisher</td><td>Hs01092694_m1</td><td></td>científica</tr><tr><td>ENG</td><td>Thermofisher Hs00923996_m1</td><td></td><td></td>científica</tr><tr><td>EPOR</td><td>Thermofisher Hs00959427_m1</td><td></td><td></td>científica</tr><tr><td>ERG</td><td>Thermofisher Hs01554629_m1</td><td></td><td></td>científica</tr><tr><td>FLI1</td><td>Thermofisher </td><td>Hs00956711_m1</td><td></td>científica</tr><tr><td>FLT3</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00174690_m1</td><td></td>científica</tr><tr><td>FOXO1</td><td>Thermofisher Hs01054576_m1</td><td></td><td></td>científica</tr><tr><td>GAPDH</td><td>Thermofisher Hs02758991_g1</td><td></td><td></td>científica</tr><tr><td>GATA1</td><td>Thermofisher científica</td><td>Hs00231112_m1</td><td></td></tr><tr><td>GATA2</td><td>Thermofisher científica</td><td></td><td></td>Hs00231119_m1</tr><tr><td>Hs00231122_m1 científica GATA3</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00382207_m1</td><td></td></tr><tr>científica <td></td><td>GFI1</td><td>Thermofisher</td> científica Hs01118947_g1 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>científica HLF</td><td>Thermofisher Hs00171406_m1</td><td></td><td></td></tr> científica <tr><td>HMGA2</td><td>Thermofisher Hs00171569_m1 científica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HOXA5</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00430330_m1</td><td></td>científica</tr><tr><td>HOXB4</td><td>Thermofisher Hs00256884_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>científica ID2</td><td>Thermofisher</td><td>Hs04187239_m1</td><td></td>científica</tr><tr><td>IGF2BP1</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00198023_m1</td><td></td>científica</tr><tr><td>IGF2BP2</td><td>Thermofisher Hs01118009_m1</td><td></td><td></td></tr><tr><td>científica IKZF1</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00172991_m1</td><td></td></tr><tr><td>IL1RAP</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00895050_m1</td><td></td></tr><tr><td>IL2RG</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00953624_m1</td><td></td></tr><tr><td>IRF8</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00175238_m1</td><td></td></tr><tr><td>ITGB7</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01565750_m1</td><td></td></tr><tr><td>KIT</td><td>Thermofisher científico</td><td></td><td></td>Hs00174029_m1</tr><tr><td>Lin28B</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01013729_m1</td><td></td></tr><tr><td>LMO2</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00153473_m1</td><td></td></tr><tr><td>LYL1</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01089802_g1</td><td></td></tr><tr><td>Meis1</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01017441_m1</td><td></td></tr><tr><td>mKi67</td><td>Thermofisher Hs01032443_m1 científico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MPL</td><td>Thermofisher</td><td>Hs00180489_m1</td><td></td></tr><tr><td>científica MPO</td><td>Thermofisher Hs00924296_m1</td><td></td><td></td>científica</tr><tr><td>NFIB</td><td>Thermofisher</td><td>científica Hs01029175_m1</td><td></td></tr><tr><td>Notch1</td><td>Thermofisher científica</td><td>Hs01062011_m1</td><td></td></tr><tr><td>Pten</td><td>Thermofisher Hs02621230_s1 científica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RAG2</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01851142_s1</td><td></td></tr><tr><td>RPS18</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01375212_g1</td><td></td></tr><tr><td>RUNX1</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00231079_m1</td><td></td></tr><tr><td>Shisa2</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01590823_m1</td><td></td></tr><tr><td>Spi1</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs02786711_m1</td><td></td></tr><tr><td>Estéril.IgH</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00378435_m1</td><td></td></tr><tr><td>TAL1</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs01097987_m1</td><td></td></tr><tr><td>THY1</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00264235_s1</td><td></td></tr><tr><td>Tim.3.HAVCR2</td><td>Thermofisher científico</td><td>Hs00958618_m1</td><td></td></tr><tr><td>VWF</td><td>Thermofisher Hs00169795_m1</td><td></td><td></td> científico</tr></tbody></table>

uma combinatória célula única abordagem para caracterizar o molecular e imunofenotípica heterogeneidade de tronco humano e populações de progenitor

A Combinatorial Single-cell Approach to Characterize the Molecular and Immunophenotypic Heterogeneity of Human Stem and Progenitor Populations

Caracterização imunofenotípica e análise molecular tem sido muito utilizados para delinear a heterogeneidade e definir populações de células distintas. FACS é inerentemente um ensaio de célula única, no entanto antes da análise molecular, as células de destino são isoladas frequentemente prospectivamente a granel, perdendo assim a resolução de célula única. Análise da expressão de gene de célula única fornece um meio para compreender diferenças moleculares entre células individuais em populações de células heterogêneas. Na análise de células em massa uma sobre-representação de um tipo de células distintas resulta em preconceitos e oclusões de sinais de células raras com importância biológica. Utilizando o FACS índice classificação acoplado a análise da expressão de gene de célula única, populações podem ser investigadas sem perda de resolução de célula única enquanto células com expressão de marcador de superfície de célula intermediária também são capturadas, permitindo a avaliação de a relevância da expressão do marcador de superfície contínua. Aqui, descrevemos uma abordagem que combina célula única transcrição reversa quantitativo PCR (RT-qPCR) e FACS índice classificação para caracterizar simultaneamente o molecular e imunofenotípica heterogeneidade dentro de populações de células.
Em contraste com os métodos de sequenciamento de RNA célula única, o uso de qPCR com amplificação de destino específico permite para medições robustas de baixa abundância transcrições com menos interrupções, enquanto isso não é confundido por questões relacionadas às variações de célula para célula em leitura profundidade. Além disso, por diretamente esse método de buffer de ordenação de índice único-células em Lise, permite para a síntese do cDNA e pré-amplificação alvo específico para ser executada em uma única etapa, bem como quanto à correlação de assinaturas moleculares posteriormente derivadas com superfície celular expressão do marcador. A abordagem descrita foi desenvolvida para investigar single-células hematopoiéticas, mas também têm sido utilizados com sucesso em outros tipos de células.
Em conclusão, a abordagem aqui descrita permite medição sensível da expressão de RNAm para um painel de genes pré-selecionados com a possibilidade para desenvolver protocolos para isolamento prospectivo subsequente de subpopulações molecularmente distintas.

O protocolo descrito é rápida, facilmente realizada e altamente confiável. Uma visão geral sobre a montagem experimental está apresentada na Figura 1. O protocolo inteiro, desde a triagem de single-células, a amplificação de destino específico, medições de expressão de gene e análise preliminar pode ser realizado em três dias. Um exemplo dos resultados analisados sob a forma de um mapa de calor que representa dados analisados preliminares da análise da expres...

Granel gene expressão medições nuvem célula individual diferenças nas populações de células heterogêneas. Aqui, descrevemos um protocolo para análise de expressão do gene como unicelular e índice classificação por Florescence ativado celular classificação (FACS) pode ser combinado para delinear a heterogeneidade e immunophenotypically caracterizam populações de células molecularmente distinta.

Uma combinatória célula única abordagem para caracterizar o Molecular e imunofenotípica heterogeneidade de tronco humano e populações de Progenitor

Immunophenotypic characterization and molecular analysis have long been used to delineate heterogeneity and define distinct cell populations. FACS is ...

Este método pode responder a perguntas-chave nos campos de células-tronco e câncer, como como a heterogeneidade de células-tronco e como a terapia em células sensíveis do câncer podem ser isoladas. A principal vantagem deste estudo é que combina análise de expressão genética de células únicas tecnicamente robustas, juntamente com a vaccinose para uma caracterização mais a jusante das subpopulações-alvo. Embora este método possa ser usado para investigar o câncer e a heterogeneidade das células-tronco, ele também pode dar insights sobre o potencial de priming e linhagem de genes.Para começar o protocolo, em um banco livre de RNA/DNA, preparar tampão de lise suficiente para 96 poços com 10% extra misturando 390 microliters nuclease água livre, 17 microliters de 10%NP-40, 2,8 microliters 10 mililitros dNTP, 10 microliters 0.1 molar DTT e 5,3 microliters RNAse inibidor. Vórtice e gire pelo tubo. Em seguida, distribua quatro microliters de tampão de lise para cada poço de uma placa PCR de 96 poços e sele as placas com película adesiva.Gire as placas para coletar o líquido na parte inferior. Mantenha as placas no gelo até a triagem celular por um máximo de 24 horas. Uma vez que a máquina

a-combinatorial-single-cell-approach-to-characterize-molecular

Research

JoVE Journal

Genetics

Genética

Um método para analisar a distribuição de células progenitoras hematopoiéticas da medula óssea em citometria de fluxo, bem como para isolar eficazmente altamente purificados de células estaminais hematopoiéticas (HSCs) é descrito. O processo de isolamento é essencialmente baseado no enriquecimento de células magnética c-kit + e classificação celular para purificar HSCs para estudos celulares e moleculares.

Análise fenotípica e Isolamento de Células-Tronco Hematopoéticas Murino e Lineage comprometidos Progenitores

Ensaio única expressão gênica de células é necessária para a compreensão da heterogeneidade de células-tronco.

Profiling Individual células estaminais embrionárias humanas por RT-PCR quantitativo

Este protocolo descreve a forma de avaliar a expressão de uma grande variedade de genes ao nível clonal. De uma única célula RT-qPCR produz resultados altamente confiáveis, com uma forte sensibilidade para centenas de amostras e genes.

Expressão Gênica de uma única célula Usando Multiplex RT-qPCR Caracterizar Heterogeneidade de rara populações linfóides

Desenvolvemos um novo protocolo para estudar a dinâmica da população heterocelular em resposta a perturbações. Este manuscrito descreve uma plataforma baseada em imagens que produz conjuntos de dados quantitativos para a caracterização simultânea de múltiplos fenótipos celulares de populações heterocelulares de maneira robusta.

Discriminação e Caracterização de Populações Heterocelulares Usando Técnicas de Imagem Quantitativa

Aqui apresentamos a metodologia para a análise clonal de precursores de células-tronco hematopoéticas durante o desenvolvimento embrionário murino. Combinamos que o índice de classificação de células únicas da região de aorta-gônada-mesonephros embrionária com co-cultura de células endoteliais e transplante para caracterizar as propriedades fenotípicas e potencial de enxertia de precursores hematopoiéticos único.

Análise clonal de precursores embrionárias células-tronco hematopoiéticas usando índice de célula única classificação combinada com células endoteliais nicho co-cultura

Apresentamos um método de citometria de fluxo para identificar simultaneamente diferentes tipos de células recuperadas do cérebro do rato ou da medula espinhal. Este método poderia ser explorado para isolar ou caracterizar populações de células puras em doenças neurodegenerativas ou para quantificar a extensão das células que visam a administração in vivo de vetores virais ou nanopartículas.

Caracterização citométrica de fluxo simultâneo de múltiplos tipos de células recuperadas do cérebro do camundongo/medula espinhal através de diferentes métodos de homogeneização

Apresentamos aqui uma técnica baseada em citometria de fluxo que permite medir simultaneamente o número de divisões celulares, o fenótipo celular de superfície e o parentesco celular. Essas propriedades podem ser testadas estatisticamente usando uma estrutura baseada em permutação.

Avaliação Simultânea de Parentesco, Número de Divisão e Fenótipo por Citometria de Fluxo para Células-Tronco Hematopoéticas e Progenitoras

O sucesso da transcriptômica de célula única/núcleo único e multi-ômica depende em grande parte da qualidade das células/núcleos. Portanto, o isolamento de células/núcleos do tecido e sua purificação devem ser altamente padronizados. Este protocolo descreve a preparação de núcleos do cérebro e da medula óssea para o ensaio de multioma de núcleo único a jusante.

Preparação de Núcleos Cerebrais e de Medula Óssea de Alta Qualidade para Ensaios Multioma de Núcleos Únicos

Este protocolo descreve o uso da classificação de células mesenquimais humanas ativadas por fluorescência usando o método de triagem de célula única. Especificamente, o uso de triagem unicelular pode atingir 99% de pureza das células imunofenotipadas de uma população heterogênea quando combinado com uma abordagem multiparamétrica baseada em citometria de fluxo.

Triagem unicelular de células-tronco mesenquimais imunofenotipadas de dentes decíduos esfoliados humanos

O protocolo aqui apresentado permite a identificação e análise de alta dimensão de células-tronco musculares e progenitoras por citometria de massa de célula única e sua purificação por FACS para estudos aprofundados de sua função. Essa abordagem pode ser aplicada para estudar a dinâmica de regeneração em modelos de doenças e testar a eficácia de intervenções farmacológicas.

Identificação e análise de progenitores miogênicos in vivo durante lesão muscular esquelética aguda por citometria de massa de célula única de alta dimensão

Aqui apresentamos protocolos que permitem o isolamento de células estromais de osso murino, medula óssea, timo e tecido tímico humano compatível com multiômica de célula única.

Isolamento de células estromais de órgãos hematopoiéticos

Aprenda a combinar análise de expressão gênica de célula única com FACS para caracterizar heterogeneidade em populações de células-tronco e câncer. Este método revela tipos celulares distintos e potencial de linhagem.

Uma combinatória célula única abordagem para caracterizar o Molecular e imunofenotípica heterogeneidade de tronco humano e populações de Progenitor (Vídeo) | JoVE Journal

Uma combinatória célula única abordagem para caracterizar o Molecular e imunofenotípica heterogeneidade de tronco humano e populações de Progenitor

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