Uma combinatória célula única abordagem para caracterizar o Molecular e imunofenotípica heterogeneidade de tronco humano e populações de Progenitor
25 de outubro de 2018
Granel gene expressão medições nuvem célula individual diferenças nas populações de células heterogêneas. Aqui, descrevemos um protocolo para análise de expressão do gene como unicelular e índice classificação por Florescence ativado celular classificação (FACS) pode ser combinado para delinear a heterogeneidade e immunophenotypically caracterizam populações de células molecularmente distinta.
Este método pode responder a perguntas-chave nos campos de células-tronco e câncer, como como a heterogeneidade de células-tronco e como a terapia em células sensíveis do câncer podem ser isoladas. A principal vantagem deste estudo é que combina análise de expressão genética de células únicas tecnicamente robustas, juntamente com a vaccinose para uma caracterização mais a jusante das subpopulações-alvo. Embora este método possa ser usado para investigar o câncer e a heterogeneidade das células-tronco, ele também pode dar insights sobre o potencial de priming e linhagem de genes.
Para começar o protocolo, em um banco livre de RNA/DNA, preparar tampão de lise suficiente para 96 poços com 10% extra misturando 390 microliters nuclease água livre, 17 microliters de 10%NP-40, 2,8 microliters 10 mililitros dNTP, 10 microliters 0.1 molar DTT e 5,3 microliters RNAse inibidor. Vórtice e gire pelo tubo. Em seguida, distribua quatro microliters de tampão de lise para cada poço de uma placa PCR de 96 poços e sele as placas com película adesiva.
Gire as placas para coletar o líquido na parte inferior. Mantenha as placas no gelo até a triagem celular por um máximo de 24 horas. Uma vez que a máquina FACS tenha sido configurada corretamente, realize a reanálise da população-alvo, classificando pelo menos 100 células-alvo em um novo tubo de microcentrifus de microcentragem com 100 microlitres de tampão de manchas.
Os FACS analisam as células classificadas registrando a amostra classificada e certificando-se de que elas acabem no portão de classificação. Em seguida, configure a classificação de placa de célula única, centralizando a queda em bem A1 na placa de 96 poços. Quando estiver centrado, classifique partículas de 50 a 106 micrômetros em todos os poços ao redor da borda de uma placa vazia de 96 poços para garantir que todos os poços obterão uma célula no centro de cada poço.
Remova o filme adesivo das placas. Classifique uma única célula de Lin-CD34 mais células CD38 menos em 92 dos 96 poços. Ative a classificação de índice no software de classificação FACS para salvar o perfil imunofenópico para CD45RA, CD49F e CD90 para cada célula.
Classifique dois poços com 10 e 20 células, respectivamente, para controles de linearidade na amplificação pcr. Poços H1 e H2 são geralmente usados. Mantenha dois poços sem células como nenhum controle de modelo, geralmente poços H3 e H4. Sele as placas com filme adesivo claro e gire as placas a 300 vezes a gravidade por um minuto.
Es clique para congelar as placas em gelo seco. Em seguida, armazená-los a menos 80 graus Celsius. Faça transcrição reversa e mix de amplificação de alvo específico adicionando 632,5 microliters de mistura de reação de duas vezes, 101,2 microliters Taq/SuperscriptIII, 151,8 microliters primer mix e 0,7 microliters cravados no RNA de controle.
Vórtice a solução e gire-a para baixo para coletar o líquido na parte inferior do tubo. Mantenha a mistura no gelo até que esteja pronta para ser adicionada à amostra. Em seguida, descongele as placas de lise no gelo.
Adicione 8,75 microliters da transcrição reversa previamente preparada e mix de amplificação de alvo específico a 92 poços, incluindo a linearidade e nenhum controle de modelo. Adicione 8,75 microliters sem mistura de controle de transcrição reversa aos quatro poços restantes. Em seguida, sele as placas com filme adesivo claro e gire as placas para coletar líquido na parte inferior.
Realize a transcrição reversa e a amplificação específica do alvo executando a placa em uma máquina PCR de acordo com o programa pré-amplificador. Prepare a placa de carregamento de ensaios, tubondo três microliters de reagente de carga de ensaio para cada poço de uma placa de 96 poços. Adicione três microliters de cada primer a poços individuais na placa de carregamento do ensaio.
Sele a placa com o filme adesivo e gire-a para baixo. Depois de girar a placa, prepare a placa de diluição, canalizando oito microlitadores de água livre nuclease em todos os poços de uma placa de 96 poços. Adicione dois microliters de amostra amplificada à placa de diluição.
Sele a placa com filme adesivo. Misture vórtice a placa por 10 segundos. Em seguida, gire para baixo a placa.
Em seguida, prepare a mistura de carregamento de amostras misturando cuidadosamente 352 microliters de mistura mestre com 35,2 microliters de reagente de carregamento de amostra. Prepare a placa de carregamento da amostra aliquoting 3,3 microliters de mistura de carga para cada poço de uma placa de 96 poços. Adicione 2,7 microliters da amostra diluída em cada poço da placa de carregamento da amostra.
Sele a placa com o filme adesivo e gire-a para baixo. Tire um novo 96 por 96 chip microfluido. Prepare as entradas cutucando-as com uma seringa com um boné para garantir que elas possam ser movidas.
Adicione o volume total das seringas a cada válvula enquanto inclina o chip para 45 graus e pressione a válvula. Prime o chip com o controlador IFC. Carregue cada entrada de ensaio com 4,25 microliters de cada um dos poços na placa de carregamento do ensaio e evite bolhas.
Se aparecerem bolhas no poço, remova-as com uma ponta de pipeta. Continue carregando cada entrada de amostra com 4,25 microliters de cada um dos poços na placa de carregamento da amostra, evitando bolhas, e se aparecerem bolhas removendo-as com uma ponta de pipeta. Carregue o chip com o controlador circuito fluido integrado ou controlador IFC.
Verifique se o chip parece uniforme e que todas as câmaras foram carregadas. Remova o pó da superfície do chip tocando-o com fita adesiva. Finalmente, execute o chip na plataforma de expressão genética microfluida multiplex.
Um mapa de calor de uma corrida bem sucedida exibe a expressão uniformemente espalhada entre as amostras com um forte sinal de cerca de sete a 25 CTs. Esta curva de amplificação de RNA de controle verifica que todos os poços têm expressão clara de cerca de 10 tomografias com pouca ou nenhuma variação, validando que as reações de pré-amplificação e qPCR foram bem sucedidas para todas as células. Análise de Componentes Princípios ou PCA que visualiza as semelhanças entre grupos celulares usando a redução de dimensões pode ser útil para distinguir aglomerados de células molecularmente distintas entre si aqui identificando quatro subgrupos.
Para identificar o imunofenótipo das células de diferentes aglomerados moleculares, carregue o arquivo FCS de índice em FlowJo. Abra o editor de script e cole o script do índice, pressione Run. Cada célula estará agora em um portão separado.
Adicione cada célula ao editor de layout e colora-as de acordo com o agrupamento definido molecularmente do SCXV disponível no arquivo sample_complete_data.xls. As tramas FACS mostram a expressão do marcador de superfície celular para os marcadores hematopoiéticos de células-tronco CD90 e CD45RA que podem ser usados para discriminar entre os clusters e isolá-los para análise funcional. Após este procedimento, outra técnica como o sequenciamento do RNA de subpopulações recém-descobertas ou experimentos in vitro e in vivo pode ser realizada para responder a perguntas adicionais como qual mecanismo molecular causa essa heterogeneidade e como a subpopulação difere funcionalmente.
Essa estratégia abriu caminho para os pesquisadores não apenas investigarem a heterogeneidade em hematopoiese normal e maligna, mas também podem ser usados para isolar prospectivamente as subpopulações descobertas para estudá-las melhor.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo que combina a análise de expressão gênica em nível de célula única com classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) para explorar a heterogeneidade em populações celulares. O objetivo é caracterizar tipos celulares molecularmente distintos, particularmente no contexto de células-tronco e câncer.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Biologia Celular
- Neurociência
- Pesquisa sobre Câncer
Antecedentes
- Medições de expressão gênica em massa podem ocultar diferenças individuais entre células.
- Compreender a heterogeneidade das células-tronco é fundamental para avanços terapêuticos.
- A FACS permite o isolamento de populações celulares específicas para análise detalhada.
- Este método fornece informações sobre o preparo gênico e o potencial de linhagem.
Objetivo do Estudo
- Para delinear a heterogeneidade em populações celulares.
- Para caracterizar imunofenotipicamente tipos celulares distintos.
- Para investigar os efeitos de terapias sobre células cancerígenas sensíveis.
Métodos Utilizados
- Preparação do tampão de lise para análise de célula única.
- Uso da triagem de células ativada por fluorescência (FACS).
- Análise da expressão gênica em célula única.
- Caracterização posterior de subpopulações-alvo.
Resultados Principais
- O método revela efetivamente a heterogeneidade das células-tronco.
- Permite o isolamento de populações específicas de células cancerígenas.
- Foram obtidas informações sobre o pré-condicionamento gênico e o potencial de linhagem.
- O protocolo é tecnicamente robusto e reprodutível.
Conclusões
- Essa abordagem aprimora a compreensão da diversidade celular.
- Apresenta aplicações potenciais tanto na pesquisa com células-tronco quanto em oncologia.
- A combinação de técnicas fornece uma análise abrangente das populações celulares.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Essa abordagem combinatória em única célula resolve um gargalo crítico na pesquisa com células-tronco e câncer ao preservar a resolução em nível de única célula durante o perfilhamento molecular, permitindo a identificação precisa de subpopulações raras que impulsionam a resistência terapêutica ou a diferenciação de linhagem. Ao associar marcadores imunofenotípicos a perfis de expressão gênica com resolução em única célula, o método aumenta a confiança na validação de alvos e apoia a redução de riscos mecanicistas em estágios iniciais de descoberta. A abordagem fornece um fluxo de trabalho escalável e reprodutível para gerar dados quantitativos e multimodais que orientam decisões de avançar ou interromper esforços de priorização de alvos e identificação de compostos líderes.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite a investigação de hipóteses terapêuticas ao resolver a heterogeneidade molecular e imunofenotípica em populações de células-tronco e progenitoras.
- Valor Operacional: Apoia a validação funcional de alvos por meio da correlação da expressão de marcadores de superfície com painéis gênicos pré-selecionados, reduzindo falsos positivos na seleção de alvos.
- Valor Preditivo: Facilita a identificação de subpopulações molecularmente distintas para isolamento posterior, aumentando a confiabilidade nas avaliações do potencial de linhagem e da ativação gênica inicial.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prontidão do Ensaio: Gera dados padronizados e quantitativos de expressão gênica associados à classificação por índice FACS, permitindo triagem reprodutível de estados moleculares em populações celulares.
- Escalabilidade: Compatível com formatos de 96 poços e plataformas microfluídicas, permitindo triagem de médio rendimento de painéis gênicos pré-definidos em amostras humanas primárias.
- Reprodutibilidade: Minimiza a variabilidade técnica por meio da lise individual de células em tampão e etapas de pré-amplificação, garantindo detecção consistente de transcritos de baixa abundância.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Continuidade Translacional: Permite o isolamento prospectivo de subpopulações molecularmente definidas para validação funcional in vitro e in vivo, conectando a descoberta ao desenvolvimento pré-clínico.
- Alinhamento de Biomarcadores: Apoia a identificação de assinaturas de marcadores de superfície correlacionadas com agrupamentos moleculares, auxiliando no desenvolvimento de biomarcadores translacionais para estratificação de pacientes.
- Avanço Ajustado ao Risco: Fornece insights mecanicistas sobre a heterogeneidade que orientam a seleção de modelos pré-clínicos e reduzem o risco biológico em estágios avançados do desenvolvimento terapêutico.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se integra aos fluxos de trabalho de descoberta inicial ao permitir o perfilamento de alta resolução de populações heterogêneas antes da identificação de compostos líderes, especialmente em cânceres impulsionados por células-tronco e em programas de medicina regenerativa. Ele posiciona a caracterização molecular e fenotípica como uma capacidade contínua e reutilizável, e não como um ensaio isolado, apoiando o aprimoramento iterativo de alvos.
- Biologia Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses e a elucidação de vias ao associar a expressão gênica em nível de célula única a perfis imunofenotípicos, permitindo a redução de riscos biológicos de alvos em contextos hematopoiéticos e oncogênicos.
- Triagem: Fornece saídas quantitativas prontas para ensaios a partir de cDNA pré-amplificado, facilitando a comparação confiável de estados moleculares entre células únicas classificadas.
- Análise: Permite análise de componentes principais (PCA) e visualização em mapas de calor para identificar agrupamentos moleculares e correlacioná-los à expressão de marcadores de superfície, possibilitando a discriminação de subpopulações.
- Pesquisa Translacional: Conecta o agrupamento molecular à validação funcional mediante o isolamento prospectivo de subpopulações para sequenciamento de RNA subsequente ou ensaios in vivo.
- Reutilização Empresarial: Estabelece um protocolo padronizado para análise multiplexada de células únicas, que pode ser adaptado entre diferentes sistemas modelo e áreas terapêuticas, reduzindo o desenvolvimento metodológico redundante.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva na validação de alvos ao resolver a heterogeneidade molecular mascarada em análises em massa.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio de protocolos padronizados de lise, pré-amplificação e qPCR, compatíveis com infraestrutura existente de FACS e microfluídica.
- Valor Estratégico: Melhora a eficiência do capital ao permitir a identificação precoce de subpopulações funcionalmente relevantes, reduzindo investimentos em alvos inviáveis.
- Impacto no Portfólio: Apoia a priorização ajustada ao risco ao fornecer uma justificativa mecanicista para avançar populações molecularmente definidas para validação pré-clínica.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em classificação por índice FACS, manipulação de células isoladas e plataformas de qPCR em microfluídica.
- Depende do acesso a classificadores de células ativados por fluorescência com capacidade de classificação por índice e sistemas de expressão gênica em microfluídica.
- Necessita padronização entre equipes para o preparo do tampão de lise, estratégias de seleção na classificação e pipelines de análise de dados.
- A adaptação a sistemas não hematopoéticos pode exigir otimização dos painéis de marcadores de superfície e condições de lise.
- As limitações práticas incluem restrições na produtividade relacionadas à velocidade de classificação e ao carregamento do chip microfluídico, sendo mais adequado para painéis focados do que para triagem de todo o transcriptoma.
