Name: Co-imunoprecipitação ensaio usando proteínas nucleares endógenas de células cultivadas em condições de hipóxicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprenda a realizar co-imunoprecipitação de proteínas nucleares endógenas em células HEK293A sob hipóxia. Este método permite investigar interações entre fatores de transcrição e co-reguladores em condições de baixo oxigênio.

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Agradecemos o Prof Assoc. Sin Tiong Ong para a utilização da estação de hipóxia. Este trabalho foi apoiado pelo seguinte: Singapura Ministério da educação, MOE 1T1-02/04 e MOE2015-T2-2-087 (para cá), Lee Kong Chian da faculdade de medicina, Universidade Tecnológica de Nanyang arranque grant M4230003 (p.o.b.), o Conselho Sueco de pesquisa, o Erling Persson Fundação da família, a Novo Nordisk Foundation, o Stichting af Jochnick Foundation, associação sueca de Diabetes, a companhia de seguros Scandia, a pesquisa do Diabetes e Wellness, Fundação do cais von Kantzow, o Programa de investigação estratégica em Diabetes no Karolinska Institutet, a ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage e a Fundação de Wallenberg Alice e Knut.

Esta seção de protocolo, que usa o rim embrionário humano 293A célula (HEK293A), s segue as diretrizes do Comitê de ética pesquisa humana em Nanyang Technological University, Singapore.
1. indução de hipóxia em células HEK293A
<ol><li>Prepare-se quatro pratos de 10cm e sementes de 3 – 5 x 106 HEK293A células por prato em 10 mL Dulbecco modificado suplementado do Eagle (DMEM, glicose de 4,5 g/L) com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM L-glutamina, piruvato de sódio de 110 mg/L, 100 U/mL penicilina e 100 mg / estreptomicina mL. Cultura de células em um 37 ° C, 5% CO2 incubadora. Nota: Célula semeadura deve ser realizada em uma câmara de segurança biológica (CSB). As superfícies de todos os materiais sejam colocados o BSC devem ser limpo com álcool 70%.</li>
	<li>24 h após a semeadura, quando as células têm alcançado a confluência de 80-90%, colocou dois pratos a hipóxia subchamber no porta-luvas incubadora (ver Tabela de materiais) com 1% de O2 e 5% CO2 a 37 ° C e manter os outros dois pratos no normoxia (21% O 2, 5% CO2 a 37 ° C) por 4 h. usar um conjunto de células hipóxicos e normoxic para avaliar o tratamento de hipóxia por western blot e utilizar o outro conjunto de células para as experiências de co-imunoprecipitação. Nota: Os níveis de oxigênio podem ser definidos em 0 – 5% e a duração do tratamento a hipóxia pode ser variado dependendo do tipo de célula e estudo objetivo.</li>
</ol>2. toda célula e extração Nuclear
Nota: Consulte a tabela 1 para obter informações sobre buffers usados no presente protocolo.
<ol><li>
As células de controle de normoxia da colheita.
	<ol>
<li>Remova a mídia de cultura por aspiração e enxágue as células com 10 mL DPBS (PH 7,0-7,2) utilizando uma pipeta de 10 mL. Nota: Evite tocar a monocamada de células com a pipeta. Durante a lavagem, pipete suavemente o DPBS abaixo o muro da placa de cultura de células para evitar a perda de células.</li>
		<li>Pipetar 5 mL DPBS gelada na placa e raspe as células da superfície da placa em PBS gelado com um raspador de célula.</li>
		<li>Transferir a suspensão de eritrócitos para tubos cônico de 15 mL e manter no gelo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Colha as células cultivadas em condições de hipóxicos.
	<ol>
<li>Pre-equilibrar a DPBS às condições de hipóxicos, colocando um descoberta 100 mL experimento reagente frasco de vidro cheio de DPBS no subchamber de hipóxia (1% O2 e 5% CO2 a 37 ° C) por 24 h de antecedência.</li>
		<li>Aproximadamente 1 h antes da colheita de células a hipóxia tratada, coloque uma caixa de gelo contendo gelo na câmara de processamento do porta-luvas, que a solução foi equilibrada para 1% O2 e 5% de CO2. O frasco contendo a pre-equilibrado DPBS hipóxica da hipóxia subchamber para a câmara de processamento de transferência e colocá-lo no gelo.</li>
		<li>4 h após o tratamento de hipóxia, transferir as células de subchamber a hipóxia para a câmara de transformação que tem sido pre-equilibrada para 1% O2 e 5% de CO2.</li>
		<li>Remova a mídia de cultura por aspiração e enxágue as células uma vez com 10 mL geladas DPBS hipóxicos pre-equilibradas com um 10 mL pipeta.</li>
		<li>Adicione 5 mL geladas DPBS pre-equilibradas com um 5 mL pipeta e desalojar as células por raspagem com uma espátula de célula.</li>
		<li>Inclinação da placa de cultura de células e coletar as células desanexadas usando uma pipeta de 10 mL. Transferir a suspensão de eritrócitos em DPBS para tubos cônico de 15 mL e manter no gelo.</li>
		<li>Abra a porta entre as câmaras processamento e tampão do porta-luvas, as quais foram previamente equilibradas para 1% O2 e 5% de CO2. Transferi os tubos cônico de 15 mL contendo células de hipóxia tratada da câmara de processamento para a câmara de tampão de gelo. Abra a porta da câmara reserva e remova completamente as células no porta-luvas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pelota tanto as células normoxic de 2.1 e as células hipóxicos de 2.2 por centrifugação a 1.000 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>
Prepare a célula inteira extratos.
	<ol>
<li>Resuspenda as pelotas de célula em 500 µ l de tampão de lise do ensaio (RIPA) imunoprecipitação rádio gelada contendo 50 mM pH cloridrato de Trisaminomethane (Tris-HCl) 8.0, 150 mM de cloreto de sódio (NaCl), 1% preparar-tipo NP-40 (NP-40), 0,5% de sódio Deoxycholate do, e 0,1% Dodecil sulfato de sódio (SDS), suplementado com 1 x coquetel de inibidor de protease (ver Tabela de materiais) pipetando as pelotas de célula acima e para baixo várias vezes.</li>
		<li>Transferir os lisados celulares para novos tubos de microcentrifuga de 1,5 mL e manter no gelo por 30 min com ocasional num Vortex.</li>
		<li>Centrifugue os lisados celulares a 13.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C.</li>
		<li>Recolher o sobrenadante, alíquota 50 µ l do sobrenadante para tubos de 1,5 mL microcentrifuga e armazenar a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparar os extratos nucleares usando uma extração nuclear kit (veja a tabela de materiais).
	<ol>
<li>Resuspenda suavemente as pelotas de célula em 500 µ l de tampão de Lise NL suplementado com 1 x coquetel de inibidor de protease e 0,1 M ditiotreitol (DTT) pipetando as pelotas de célula acima e para baixo várias vezes.</li>
		<li>Adicione 25 µ l de solução detergente NP para a suspensão de células e vórtice para 10 s na velocidade máxima.</li>
		<li>Centrifugação a 10.000 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>O sobrenadante (extratos citoplasmáticos), alíquota 50 µ l do sobrenadante para tubos de 1,5 mL microcentrifuga, de coletar e armazenar a-80 ° C.</li>
		<li>Resuspenda o pellet contendo núcleos de célula em 500 µ l de tampão de Lise NL suplementado com 1 x coquetel de inibidor de protease e 0,1 M DTT vortexing para 5 s na velocidade máxima.</li>
		<li>Centrifugar a 10.000 x g por 5 min a 4 ° C e salvar a pelota nuclear.</li>
		<li>Resuspenda o pellet nuclear em 50 µ l de Buffer de extração NX1 suplementado com 1 x coquetel de inibidor de protease pipetando a pelota subindo e descendo várias vezes.</li>
		<li>Incubar durante 30 min no gelo, num Vortex para 10 s cada 5 min na velocidade máxima.</li>
		<li>Centrifugar a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Do desalt os extratos nucleares.
	<ol>
<li>Recolha o sobrenadante da etapa 2.5.9 e transferência para os dispositivos de diálise mini com um volume máximo de 100 µ l por unidade.</li>
		<li>Tampe os dispositivos mini diálise e colocá-los em um dispositivo de flutuação.</li>
		<li>Colocar o dispositivo de flutuação em um béquer contendo 500 mL de tampão de diálise pre-refrigerados (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 20% de glicerol, 100 mM de cloreto de potássio (KCl), 0,2 ácido etilenodiaminotetracético de mM (EDTA), 0,2 mM phenylmethylsulfonyl fluoreto (PMSF) e 0,5 mM DTT) e incube por 30 min a 4 ° C, com agitação suave. Cuidado: PMSF é perigosa. Evite o contato direto com a pele ou por inalação.</li>
		<li>Coletar as amostras do canto dos dispositivos mini diálise e transferir para novos tubos de microcentrifuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugar a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C, alíquota 25 µ l de cada sobrenadante para um tubo de 1,5 mL microcentrifuga e armazenar a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. avaliação do tratamento hipóxia por detecção da expressão da proteína e localização Subcellular de HIF-1 α
<ol><li>Determinar a concentração de proteína da célula inteira ou nuclear/citoplasmática extrai usando o ensaio de microplacas de bicinchoninic ácido (BCA) proteína ensaio kit de acordo com as instruções de18 do fabricante.</li>
	<li>Diluir os lisados celulares em 1 x Laemmli amortecedor da amostra contendo 5% 2-Mercaptoetanol e ferva a 95 ° C por 5 min. Cuidado: Não toque na superfície do bloco de aquecimento, uma vez que pode causar queimaduras.</li>
	<li>
Separe as proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida sulfato dodecyl de sódio (SDS-PAGE).
	<ol>
<li>Carrega quantidades iguais de proteínas (25 µ g) em cada poço de um geles de SDS-PAGE prefabricado de gradiente (4 – 20%), juntamente com 3 µ l do marcador de peso molecular.</li>
		<li>Funcione o gel em marcha tampão contendo 2,5 mM Tris, glicina 19,2 mM, 0,01% SDS, PH8.3 por 30 min a 200 V.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transferi as proteínas do gel para a membrana de nitrocelulose.
	<ol>
<li>Monte o sanduíche de transferência (papel de filtro-gel-membrana-filtro de papel) com o gel do lado do ânodo e a membrana do lado do cátodo da fita.</li>
		<li>Coloque a fita no tanque de transferência preenchido com buffer de transferência contendo 2,5 mM trisaminomethane (Tris), glicina 19,2 mM e 20% de metanol. Cuidado: O metanol é inflamável e deve ser armazenado dentro do armário de armazenamento líquido inflamável.</li>
		<li>Efectue a transferência para 1 h a 100 V na sala fria.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bloquear o borrão em 10 mL de tampão de bloqueio contendo 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0.1 Tween 20 e 5% leite desnatado por 1h à temperatura ambiente em um shaker.</li>
	<li>Incubar o blot com anticorpo anti-HIF-1 α (diluição de 1/500), a mesma reserva de bloqueio durante a noite a 4 ° C.</li>
	<li>Lave a mancha por 5 min por 3 vezes cada vez com 50 mL TBS-T.</li>
	<li>Incubar o blot com peroxidase de rábano (HRP)-anticorpo secundário conjugado (diluição de 1/1.000) em 10 mL TBS-T contendo 5% desnatado leite seco por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave a mancha por 5 min por 3 vezes cada vez com 50 mL TBS-T.</li>
	<li>Mix de 500 µ l cada de chemilumescent reforçada (ECL) reagente A e B em um tubo de 1,5 mL microcentrifuga e vórtice brevemente.</li>
	<li>Aplicar o substrato ECL para o Borrão e incubar durante 1 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>
Capture os sinais quimioluminescente usando um dispositivo de carga acoplada (CCD) sistema de imagens baseado em câmera.
	<ol>
<li>Escorra o excesso substrato ECL tocando a borda da membrana com um papel absorvente e colocar a membrana em um protetor de folha.</li>
		<li>Coloque a membrana sobre a bandeja de amostra do CCD sistema de imagens baseado em câmera.</li>
		<li>Lançar o software de processamento de imagem (consulte a Tabela de materiais) e capturar as imagens com as seguintes configurações: arquivo → novo protocolo → único canal → configuração protocolo → Gel de imagem (aplicativo: Chemi; Área da imagem: Gel pronto Bio-Rad; Exposição de imagens: O software automaticamente irá otimizar o tempo de exposição para intensas bandas) protocolo de execução → Nota: O tempo de exposição pode ser ajustado manualmente para conseguir as imagens ideais.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. imunoprecipitação e detecção de proteínas de Immunoprecipitated
<ol><li>Lave a 50 µ l de grânulos de proteína A/G sepharose em 500 µ l de tampão TBS em tubos de 1,5 mL microcentrifuga e os grânulos de pelotas por centrifugação a 3.000 x g por 2 min a 4 ° C.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e ressuspender as contas em 100 µ l de tampão TBS.</li>
	<li>Adicione 2 µ l de anticorpo monoclonal anti-ARNT de rato (1,4 mg/mL) ou mouse imunoglobulina G (IgG) (1,4 mg/mL) que foi preparado pela reorganização do mouse 0,7 mg IgG no buffer TBS 500 µ l.</li>
	<li>Coloque os tubos de microcentrifuga de 1,5 mL contendo os grânulos em um rotador de tubo e incubar durante 2 h a 10 rpm na sala fria. Nota: Lidar com os tubos suavemente e manter a suspensão contendo os grânulos no fundo do tubo.</li>
	<li>Os grânulos de pelotas por centrifugação a 3.000 x g por 2 min a 4 ° C e descartar os sobrenadantes.</li>
	<li>Dilua 200 µ g da proteína nuclear lisada obtida na etapa 2.6.5 em 800 µ l de buffer IP consistindo de 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 180 mM de NaCl, 20% de glicerol, 0,2% x NP-40 e 1 inibidor da protease cocktail. Incubar o lisado com os grânulos de anticorpos acoplados obtidos na etapa 4.5 durante a noite a 4 ° C.</li>
	<li>Os grânulos de pelotas por centrifugação a 3.000 x g por 2 min a 4 ° C, descartar os sobrenadantes e lave os grânulos 3 vezes com 1 mL gelada TBS contendo 0,2% NP-40.</li>
	<li>Ferva os grânulos em 50 amortecedor da amostra Laemmli µ l a 95 ° C por 5 min.</li>
	<li>Centrifugue os grânulos a 10.000 x g por 5 min a 4 ° C, recolher o sobrenadante e descartar os grânulos. Nota: O sobrenadante pode ser armazenado a 4 ° C para o curto prazo ou a-20 ° C, a longo prazo.</li>
	<li>Detecta a presença de HIF-1 α partir os complexos de proteína immunoprecipitated pelo borrão ocidental, conforme descrito no passo 3.3 em diante. Nota: A quantificação da proteína não é necessária para esta etapa. Carregar o volume completo (50 μL) do líquido sobrenadante de cada amostra em cada poço de um geles de SDS-PAGE prefabricado de gradiente (4 – 20%)</li>
</ol>

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<li>Holmquist-Mengelbier, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recruitment+of+HIF-1alpha+and+HIF-2alpha+to+common+target+genes+is+differentially+regulated+in+neuroblastoma%3A+HIF-2alpha+promotes+an+aggressive+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Recruitment of HIF-1alpha and HIF-2alpha to common target genes is differentially regulated in neuroblastoma: HIF-2alpha promotes an aggressive phenotype.</a> Cancer Cell. 10 (5), 413-423 (2006).</li>
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<li>Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+protein+protein+interactions+in+salt+solutions+and+implications+for+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization.</a> Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).</li>
<li>Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+endothelial+cell+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase+expression+by+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia.</a> J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).</li>
<li>Caradec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desperate+house+genes%27%3A+The+dramatic+example+of+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia.</a> Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).</li>
</ol>

Os autores declaram não há conflitos de interesse.

O complexo HIF-1 é um mestre regulador da homeostase celular oxigênio e regula uma infinidade de genes envolvidos em diferentes respostas adaptativas celulares à hipoxia. Identificação de novas proteínas de interação de HIF-1 é importante para a compreensão da transdução de sinal de hipoxia. Co-imunoprecipitação experimentos são comumente usados para estudos de IPP para delinear as vias de transdução de sinal de celular. No entanto, superexpressão de proteínas é ainda amplamente utilizada e isso pode levar a artefatos ex...

Hipóxia ocorre quando insuficiente oxigênio é fornecido para as células e tecidos do corpo. Desempenha um papel crítico em vários processos fisiológicos e patológicos, tais como a diferenciação de células-tronco, inflamação e câncer1,2. Hypoxia-inducible fatores (transplanta) funcionam como heterodímeros, compostos por uma subunidade α oxigênio-regulado e uma subunidade β constitutivamente expressa ARNT também conhecido como3. Até à data, foram identificadas três isoformas de três subunidades de HIF-β (ARNT/HIF-1 β, ARNT2 e ARNT3) e as subunidades de HIF-α (HIF-1 α, HIF-2α e HIF-3α). HIF-1 α e ARNT ubiquitously são expressos, Considerando que o HIF-2α, HIF-3α, ARNT2 e ARNT3 têm mais restrito de padrões de expressão4. A complexo de proteína HIF-1 é o regulador chave da resposta hipoxia. Em condições de hipóxicos, HIF-1 α torna-se estabilizado, então translocates ao núcleo e dimeriza com ARNT5. Posteriormente, este complexo liga de nucleotídeos específicos conhecidos como elementos responsivos de hipóxia (HREs) e regula a expressão de genes-alvo envolvidos nos diversos processos, incluindo a angiogênese, eritropoiese e glicólise6. Além desta resposta "canônica", a via de sinalização de hipóxia é também conhecida por crosstalk com múltiplas resposta celular, sinalização de vias como entalhe e Nuclear Factor-kappa B (NF-κB)7,8,9.
A identificação das proteínas de interação romance HIF-1 é importante para uma melhor compreensão da hipóxia via de sinalização. Em contraste com ARNT, que é insensível aos níveis de oxigênio e constitutivamente expressa, níveis de proteína HIF-1 α estão fortemente regulamentados pelos níveis de oxigênio celular. No normoxia (21% de oxigênio), proteínas de HIF-1 α são rapidamente degradadas10,11. A meia-vida curta de HIF-1 α no normoxia apresenta desafios técnicos específicos para a deteção da proteína da célula extratos, bem como para a identificação das proteínas HIF-1 α-interagindo. Além disso, vários fatores de transcrição, incluindo aqueles do complexo HIF-1 translocar para o núcleo sob condições de hipóxia12,13,14. A maioria dos atuais métodos utilizados para estudos PPI é executada usando não-fisiológica superexpressão de proteínas. Tal superexpressão da proteína foi relatado para causar defeitos celulares diferentes através de vários mecanismos, incluindo a sobrecarga de recursos, desequilíbrio estequiométrico, interações promíscuas e via modulação15,16. Em termos de estudos PPI, a superexpressão da proteína pode levar a falso negativo positivo, ou mesmo falso, resultados, dependendo das propriedades da proteína e funções das proteínas Blumental. Portanto, os métodos atuais para estudos PPI tem que ser modificado a fim de revelar o IPP fisiologicamente relevantes sob condições de hipoxia. Nós demonstramos anteriormente a interação entre o HIF-1 e o fator de transcrição família Ets GA-proteína (GABP) em células de P19 hipóxicos, que contribui para a resposta do promotor Hes1 à hipóxia17. Aqui, descrevemos um co-imunoprecipitação para estudar PPIs entre endógenas proteínas nucleares em condições de hipóxicos. A interação entre o HIF-1 α e ARNT é mostrada como uma prova de conceito. Este protocolo é apropriado para demonstrar as interações entre os fatores de transcrição e reguladores transcricionais de co em condições de hipóxicos, incluindo mas não limitado à identificação das proteínas de interação de HIF-1.

<table><tbody><tr><td><forte>Material</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.0 M Tampão Tris-HCl, pH 7.4&nbsp;</td><td>1ª BASE</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>Proteína A/G Grânulos de Sepharose</td><td>Abcam</td><td>ab193262</td><td></td></tr><tr><td>Proteína IgG de camundongo natural</td><td>Abcam</td><td>ab198772</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio-Rad</td><td>1610729</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610737</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocelulose Membrana &nbsp; &nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueador de Grau de Blotting</td><td>Bio-Rad</td><td>1706404</td><td>Leite em pó desnatado para aplicações de western blotting</td></tr><tr><td>10x Tris Buffered Saline (TBS)</td><td>Bio-Rad</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>10% Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>1610781</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine Buffer&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610771</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Padrões de Cor Dupla</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG, Anticorpo Ligado a HRP</td><td>Sinalização Celular</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>IgG Anti-camundongo, Anticorpo Ligado a HRP&nbsp;</td><td>Sinalização Celular</td><td>7076</td><td></td></tr><tr><td>Reagente ECL SignalFire</td><td>Sinalização Celular</td><td>6883</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato Dulbecco</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF)</td><td>Merck Millipore</td><td>52332</td><td></td></tr><tr><td>ARNT/HIF-1 beta Anticorpo&nbsp;</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-124&nbsp;</td><td>Concentração: 1,4 mg/mL</td></tr><tr><td>HIF-1 alfa Anticorpo</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-479</td><td>Concentração: 1,0 mg/mL</td></tr><tr><td>YY1 Anticorpo Novus</td><td>Biologicals</td><td>NBP1-46218</td><td>Concentração: 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>Qproteome Nuclear Protein Kit</td><td>Qiagen</td><td>37582</td><td>Tampão de lise NL e Extraction Buffer NX1 são fornecidos no kit</td></tr><tr><td>GAPDH Anticorpo</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47724</td><td>Concentração: 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>Glicerol (&ge; 99%)</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Tampão RIPA</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>127087-87-0</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia modificada' s meio (DMEM, 4.5 g/L de glicose)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>HEK293A linha celular</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>Metanol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protease Inhibitor Tablets&nbsp;</td>Kit de Ensaio de Proteína BCA Pierce <td>88660</td><td></td> <td>da Thermo Fisher</td></tr><tr><td></td> Scientific <td>23225</td><td></td>Ponta de carregamento de gel QSP da <td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>QSP#010-R204-Q-PK</td><td>1-200 uL</td></tr><tr><td>Equipment/Instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&nbsp; Tetra Célula de Eletroforese Vertical para Mini Géis Pré-moldados, com Mini Trans-Blot&nbsp; Módulo e Fonte de Alimentação Básica PowerPac</td><td>Bio-Rad</td><td>1658034</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 15% Mini-PROTEAN TGX Géis de Proteína Pré-moldados</td><td>Bio-Rad</td><td>4561083</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+ System</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>Luva</td><td>BioSpherix</td><td>I-Glove</td><td></td></tr><tr><td>Synergy HTX Leitor de Microplacas Multi-Modo&nbsp;</td><td>BioTek</td><td>BTS1LFTA</td><td></td></tr><tr><td>Costar 5mL Stripette Pipetas Sorológicas</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>Costar 10mL Stripette Pipetas Sorológicas</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Costar 25mL Stripette Pipetas Sorológicas</td><td>Corning</td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-Well Fundo Transparente Microplacas de Poliestireno Preto</td><td>Corning</td><td>3631</td><td></td></tr><tr><td>15mL de Alta Tubos de Centrífuga Cônicos PP Clarity</td><td>Corning</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de Células Pequenas</td><td>Corning</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Gilson&nbsp; Kit de 4 pipetas Pipetman L&nbsp;</td><td>Gilson</td><td>F167370</td><td>P2, P20, P200, P1000 e acessórios</td></tr><tr><td>Tubos de Microcentrífuga de Polipropileno de 1,5mL</td><td>Greiner Bio-One&nbsp;</td><td></td><td></td>616201</tr><tr><td>PIPETBOY acu 2 Pipettor</td><td>INTEGRA Biosciences</td><td>155 000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Armários de armazenamento de líquidos inflamáveis Justrite</td><td>Justrite Manufacturing Co.</td><td>896000</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>Labnet</td><td>S0200</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>NuAire</td><td>NU-5820</td><td></td></tr><tr><td>Agitadores orbitais</td><td>Stuart</td><td>SSL1</td><td></td></tr><tr><td>Rotador de tubo SB3</td><td>Stuart</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 21R Microcentrífuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002470</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 16 Centrífuga</td><td>Thermo Placas</td><td>de Cultura de Tecidos 75004240</td><td></td>Fisher</tr><tr><td>Scientific (100 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer MINI Dispositivo de Diálise</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69580</td><td>10K MWCO, 0.1 mL</td></tr><tr><td>Bóias de Flutuação para 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dispositivos de Diálise</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69588</td><td></td></tr><tr><td>LSE Aquecedores de Banho Seco Digital</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1168H25</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; 1300 Classe II da Série A2, Tipo A2 Bio Armários de Segurança</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-261-308</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Software de Laboratório</td><td>Bio-Rad</td><td>1709691</td><td></td></tr></tbody></table>

co-imunoprecipitação ensaio usando proteínas nucleares endógenas de células cultivadas em condições de hipóxicos

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

Baixos níveis de oxigênio (hipóxia) desencadear uma variedade de respostas adaptativas com o Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complexos atuando como um regulador de mestre. HIF-1 consiste de uma subunidade α oxigênio-regulado de heterodimérica (HIF-1 α) e constitutivamente expressa a subunidade beta (HIF-1 β) também conhecido como aril hidrocarboneto do receptor nuclear translocator (ARNT), regulação de genes envolvidos em diversos processos, incluindo a angiogênese , eritropoiese e glicólise. A identificação das proteínas de interação de HIF-1 é a chave para a compreensão da hipóxia via de sinalização. Além do Regulamento de HIF-1 α estabilidade, a hipóxia também aciona a translocação nuclear de muitos fatores de transcrição, incluindo HIF-1 α e ARNT. Notavelmente, a maioria dos atuais métodos utilizados para estudar tais interações da proteína-proteína (PPIs) é baseada em sistemas onde os níveis de proteína são artificialmente aumentados através da superexpressão da proteína. Superexpressão da proteína, muitas vezes leva a resultados não-fisiológicos decorrentes de artefatos temporais e espaciais. Aqui nós descrevemos uma co-imunoprecipitação modificada após o tratamento de hipóxia usando proteínas nucleares endógenas e como uma prova de conceito, para mostrar a interação entre o HIF-1 α e ARNT de protocolo. Neste protocolo, as células hipóxicos foram colhidas em condições de hipóxicos e tampão de lavagem de o Dulbecco Phosphate-Buffered salina (DPBS) também foi previamente equilibrado a hipoxia condições antes do uso para mitigar a degradação de proteína ou proteína complexa dissociação durante a reoxigenação. Além disso, as frações nucleares foram posteriormente extraídas para concentrar e estabilizar proteínas nucleares endógenas e evitar possíveis resultados espúrios muitas vezes vistos durante a superexpressão da proteína. Este protocolo pode ser usado para demonstrar endógenas e nativas de interações entre fatores de transcrição e reguladores transcricionais de co em condições de hipóxicos.

Para avaliar a resposta celular a hipóxia, a expressão de níveis e Localização subcellular dos componentes do tratamento de hipóxia seguir HIF-1 complexo foram examinados. HEK293A as células foram cultivadas em condições de hipóxicos para 4h ou mantidos no normoxia como controles. Níveis de proteína HIF-1 α e ARNT foram examinados no celular ou nuclear/citoplasmática extrai pelo borrão ocidental. Como esperados, totais de níveis de HIF-1 α foram upregulated por hipóxia, Considerando que o...

Aqui nós descrevemos uma co-imunoprecipitação para estudar interações da proteína-proteína entre endógenas proteínas nucleares em condições de hipóxicos. Este método é adequado para demonstração das interacções entre factores de transcrição e reguladores transcricionais de co em hipóxia.

Co-imunoprecipitação ensaio usando proteínas nucleares endógenas de células cultivadas em condições de hipóxicos

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo hipóxico, como interações endógenas e nativas entre fatores de transcrição e seus correguladores transcricionais em condições hipóxicas. A principal vantagem desta técnica é que as células hipóxicas são colhidas em condições hipóxicas e as frações nucleares são utilizadas para a co-imunoprecipitação. Este protocolo usa células 293A do rim embrionário humano cultivadas em quatro placas de 10 centímetros.Semeie três a cinco vezes 10 a sextas células por prato em 10 mililitros de meio de Eagle modificado de Dulbeco suplementado com 10% de FBS, L-glutamina, piruvato de sódio, penicilina e estreptomicina. Cultive as células em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius a 5%. Vinte e quatro horas após a semeadura, quando as células atingirem 80 a 90% de confluência, coloque dois pratos na subcâmara de hipóxia no porta-luvas da incubadora com 1% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por quatro horas.Mantenha os outros dois pratos em normóxia. No dia anterior à colheita das células tratadas com hipóxia, pré-equilibre a DPBS para condições hipóxicas, colocando um frasco de reagente de vidro experi

co-immunoprecipitation-assay-using-endogenous-nuclear-proteins-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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Fluxo de trabalho de espectrometria de massa de imunoprecipitação sem rótulos para perfis de interactom nuclear em larga escala

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Aprenda a realizar co-imunoprecipitação de proteínas nucleares endógenas em células HEK293A sob hipóxia. Este método permite investigar interações entre fatores de transcrição e co-reguladores em condições de baixo oxigênio.

Co-imunoprecipitação ensaio usando proteínas nucleares endógenas de células cultivadas em condições de hipóxicos

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