Co-imunoprecipitação ensaio usando proteínas nucleares endógenas de células cultivadas em condições de hipóxicos
2 de agosto de 2018
Aqui nós descrevemos uma co-imunoprecipitação para estudar interações da proteína-proteína entre endógenas proteínas nucleares em condições de hipóxicos. Este método é adequado para demonstração das interacções entre factores de transcrição e reguladores transcricionais de co em hipóxia.
Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo hipóxico, como interações endógenas e nativas entre fatores de transcrição e seus correguladores transcricionais em condições hipóxicas. A principal vantagem desta técnica é que as células hipóxicas são colhidas em condições hipóxicas e as frações nucleares são utilizadas para a co-imunoprecipitação. Este protocolo usa células 293A do rim embrionário humano cultivadas em quatro placas de 10 centímetros.
Semeie três a cinco vezes 10 a sextas células por prato em 10 mililitros de meio de Eagle modificado de Dulbeco suplementado com 10% de FBS, L-glutamina, piruvato de sódio, penicilina e estreptomicina. Cultive as células em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius a 5%. Vinte e quatro horas após a semeadura, quando as células atingirem 80 a 90% de confluência, coloque dois pratos na subcâmara de hipóxia no porta-luvas da incubadora com 1% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por quatro horas.
Mantenha os outros dois pratos em normóxia. No dia anterior à colheita das células tratadas com hipóxia, pré-equilibre a DPBS para condições hipóxicas, colocando um frasco de reagente de vidro experimental descoberto de 100 mililitros cheio de DPBS na subcâmara de hipóxia por 24 horas. Aproximadamente uma hora antes da colheita das células, coloque uma geladeira contendo gelo na câmara de processamento do porta-luvas, que foi equilibrada para 1% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono.
Transfira o frasco contendo o DPBS hipóxico pré-equilibrado da subcâmara de hipóxia para a câmara de processamento e coloque-o no gelo. Quatro horas após o tratamento da hipóxia, transfira as células da subcâmara de hipóxia para a câmara de processamento que foi pré-equilibrada para 1% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Remova o meio de cultura por aspiração e com uma pipeta de 10 mililitros, lave as células uma vez com 10 mililitros de DPBS hipóxica pré-equilibrada gelada.
Usando uma pipeta de cinco mililitros, adicione 5 mililitros de DPBS pré-equilibrado gelado e desaloje as células raspando com um raspador de células. Inclinar a placa de cultura de células, recolher as células destacadas com uma pipeta de 10 ml e transferir a suspensão celular para um tubo cónico de 15 ml. Mantenha o tubo de células no gelo.
Abra a porta entre as câmaras de processamento e tampão no porta-luvas, ambas pré-equilibradas para 1% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Transfira os tubos cônicos de 15 mililitros em gelo contendo células tratadas com hipóxia da câmara de processamento para a câmara tampão. Abra a porta da câmara tampão e remova completamente as células do porta-luvas.
Pulverizar as células hipóxicas e as células normóxicas por centrifugação a 1000 vezes g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Um kit de extração nuclear será usado para este procedimento. Comece ressuspendendo suavemente cada pellet celular em 500 microlitros de tampão de lise NL, suplementado com coquetel de inibidor de protease 1X em DTT de 0,1 molar, pipetando para cima e para baixo várias vezes.
Adicione 25 microlitros de solução detergente NP à suspensão da célula e vórtice por 10 segundos na velocidade máxima. Centrifugue a 1000 vezes 10 g a quatro graus Celsius por cinco minutos. Salve o sobrenadante e o pellet nuclear.
Após coletar e armazenar o sobrenadante conforme descrito no protocolo de texto, ressuspender os núcleos celulares contendo pellets em 500 microlitros de tampão de lise NL, suplementado com coquetel inibidor de protease 1X e DTT 0,1 molar por vórtice por cinco segundos na velocidade máxima. Ressuspenda o pellet nuclear em 50 microlitros de tampão de extração NX1, complementado com coquetel de inibidor de protease 1X, pipetando o pellet para cima e para baixo várias vezes. Incube no gelo por 30 minutos.
A cada cinco minutos, vórtice por 10 segundos na velocidade máxima. Centrifugar a 12 000 x g a quatro graus Celsius durante 10 minutos. Colete o sobrenadante e transfira para dispositivos de minidiálise com o volume máximo de 100 microlitros por unidade para dessalinização.
Tampe os mini dispositivos de diálise e coloque-os em um dispositivo de flutuação. Coloque o dispositivo de flutuação em um béquer contendo 500 mililitros de tampão de diálise pré-resfriado. Tenha cuidado para evitar o contato direto com a pele ou a inalação do tampão de diálise, pois ele contém PMSF.
Incube a quatro graus Celsius com agitação suave por 30 minutos. Após 30 minutos, colete as amostras do canto dos dispositivos de minidiálise e transfira para novos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Centrifugue a 12 mil vezes g a quatro graus Celsius por 10 minutos.
Alíquota de 25 microlitros de cada sobrenadante em um tubo de centrífuga de 1,5 microlitro e armazene a 80 graus Celsius negativos. Preparar as esferas de sepharose AG da proteína a utilizar na imunopreciptação. Pipete 50 microliteras de grânulos em cada um dos quatro tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro e adicione 500 microlitros de tampão DPBS por tubo.
Pellet as contas por centrifugação. Descarte o sobrenadante e ressuspenda os grânulos em 100 microlitros de tampão TBS. Adicione dois microlitros de anticorpo monoclonal anti-ARNT de camundongo ou imunoglobulina G de camundongo que foi preparada reconstituindo 0,7 miligramas de IgG de camundongo em 500 microlitros de tampão TBS.
Leve os tubos de microcentrífuga contendo os grânulos para uma câmara fria. Coloque-os em um rotador de tubo e incube a 10 rpm por duas horas. Após duas horas, peletizar as esferas por centrifugação e descartar os sobrenadantes.
Diluir 200 microgramas do lisado de proteína nuclear preparado anteriormente em 800 microlitros de tampão de imunoprecipitação. Incube o lisado com as esferas acopladas a anticorpos a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, pelete as esferas por centrifugação a 3000 vezes g por dois minutos a quatro graus Celsius.
Descarte o sobrenadante. Adicione um mililitro de TBS gelado contendo 0,2% NP-40 a cada tubo e gire para baixo. Desta forma, lave as contas três vezes com TBS gelada contendo 0,2% NP-40.
Ferva as esferas em 50 microlitros de tampão de amostra Laemmli a 95 graus Celsius por cinco minutos. Centrifugue as esferas a 10 mil vezes g a quatro graus Celsius por cinco minutos. Colete o sobrenadante e descarte as contas.
Os níveis de expressão na localização subcelular dos componentes do complexo HIF-1 após o tratamento com hipóxia foram examinados em HEK293A células. Como esperado, os níveis totais de HIF-1a foram regulados positivamente por hipóxia, enquanto os níveis de ARNT em lisados celulares totais não foram significativamente alterados. Além disso, a hipóxia induziu o acúmulo nuclear de HIF-1a e ARNT.
Experimentos de co-imunoprecipitação foram realizados usando extratos nucleares de células HEK293A expostas a condições normóxicas ou hipóxicas. Como mostrado aqui, o HIF-1a foi co-imunoprecipitado junto com ARNT dos extratos nucleares de células HEK293A hipóxicas, indicando que o HIF-1a interage com ARNT em condições hipóxicas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da hipóxia explorarem as interações proteicas nucleares endógenas e suas condições hipóxicas.
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Visão Geral
Este artigo descreve um protocolo de co-imunoprecipitação projetado para investigar interações proteína-proteína entre proteínas nucleares endógenas sob condições hipóxicas. O método é particularmente útil para examinar interações entre fatores de transcrição e seus co-reguladores transcricionais durante a hipóxia.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Pesquisa em Hipóxia
Contexto
- Compreender as interações proteicas é fundamental no estudo das respostas celulares à hipóxia.
- Fatores de transcrição desempenham um papel significativo na regulação gênica em condições de baixa concentração de oxigênio.
- A co-imunoprecipitação permite a análise dessas interações em um ambiente celular nativo.
- Este protocolo utiliza células renais embrionárias humanas 293A para estudar essas interações.
Objetivo do Estudo
- Elucidar as interações entre fatores de transcrição e co-reguladores transcricionais em condições hipóxicas.
- Fornecer um método confiável para estudar interações proteicas em um ambiente hipóxico controlado.
- Aprimorar a compreensão dos mecanismos celulares em resposta a níveis baixos de oxigênio.
Métodos Utilizados
- Células humanas do rim embrionário 293A são cultivadas em meios específicos.
- As células são submetidas a condições hipóxicas em uma câmara de luvas.
- A co-imunoprecipitação é realizada em frações nucleares obtidas sob hipóxia.
- O protocolo detalha as condições e o tempo específicos para resultados ideais.
Resultados Principais
- O método demonstra com sucesso interações proteicas sob condições hipóxicas.
- Foram identificadas interações-chave entre fatores de transcrição e co-reguladores.
- Os resultados fornecem insights sobre os mecanismos regulatórios ativos durante a hipóxia.
- Essa abordagem pode ser aplicada a estudos futuros em pesquisas relacionadas à hipóxia.
Conclusões
- O protocolo de co-imunoprecipitação é eficaz para estudar interações proteicas em condições hipóxicas.
- Compreender essas interações pode levar a avanços na pesquisa sobre hipóxia.
- Este método pode ser adaptado para diversos estudos envolvendo interações proteicas em diferentes contextos celulares.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Estudar interações endógenas entre proteínas sob condições hipóxicas fisiologicamente relevantes permite uma validação mais precisa de alvos em vias de doenças induzidas pela hipóxia. Essa abordagem reduz artefatos provenientes de sistemas de superexpressão, melhorando a confiança preditiva no estágio inicial de descoberta. Ela contribui para a redução de riscos mecanicistas ao esclarecer os complexos nativos de fatores de transcrição envolvidos na regulação da angiogênese, eritropoiese e glicólise.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvos
- Valor Científico: Permite a investigação das interações endógenas entre HIF-1α e ARNT sob hipóxia, apoiando testes de hipóteses sobre alvos.
- Valor Operacional: Utiliza fracionamento nuclear para concentrar proteínas relevantes e evitar interferências citoplasmáticas.
- Valor Científico: Fornece dados de co-imunoprecipitação nativa que refletem a formação fisiológica de complexos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Gera lisados nucleares padronizados para leituras consistentes de coimunoprecipitação.
- Valor Operacional: O pré-equilíbrio dos tamponamentos em condições hipóxicas garante a reprodutibilidade do ensaio e previne artefatos de reoxigenação.
- Valor Científico: Permite a avaliação quantitativa das interações entre fatores de transcrição sob tensões de oxigênio definidas.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Relaciona a sinalização de hipóxia com saídas transcricionais relevantes em modelos isquêmicos e tumorigênicos.
- Valor Operacional: Utiliza proteínas endógenas, evitando artefatos de superexpressão que comprometem a relevância translacional.
- Valor Científico: Apoia a descoberta de biomarcadores ao identificar complexos nucleares estáveis sob hipóxia.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere em fluxos de trabalho de descoberta precoce, nos quais o engajamento do alvo e a validação da via exigem condições fisiologicamente relevantes.
- Biologia da Descoberta: Apoia a validação da via HIF-1 ao confirmar interações nativas em extratos nucleares.
- Triagem: Permite o desenvolvimento de ensaios para recrutamento de co-reguladores sob hipóxia utilizando frações nucleares padronizadas.
- Análises: Gera resultados de co-imunoprecipitação que permitem a comparação entre estados de interação em condições normóxicas e hipóxicas.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se a modelos pré-clínicos nos quais o HIF-1 induz programas de expressão gênica relevantes para doenças.
- Reutilização Empresarial: O protocolo pode ser adaptado para estudar outros pares de fatores de transcrição em hipóxia ou outras condições de estresse.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança na validação do alvo ao utilizar proteínas endógenas em condições próximas às fisiológicas.
- Valor Operacional: O manuseio padronizado da hipóxia e a extração nuclear melhoram a reprodutibilidade entre laboratórios.
- Valor Estratégico: Reduz o risco de falsos positivos decorrentes da superexpressão, melhorando a eficiência na seleção de compostos promissores.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização baseada em dados de moduladores da via HIF-1 com base em evidências de interação nativa.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cultivo celular hipóxico e técnicas de extração de proteínas nucleares.
- Depende do acesso a uma câmara ou caixa de luvas com controle de hipóxia para exposição consistente ao O2.
- Necessita de protocolos padronizados para pré-equilibração com DPBS e fracionamento nuclear para evitar variabilidade.
- A adaptação a outros tipos celulares pode exigir otimização da eficiência de extração nuclear.
- Limitado pela disponibilidade de anticorpos validados para imunoprecipitação endógena sob condições de hipóxia.
