Name: Co-imunoprecipitação ensaio usando proteínas nucleares endógenas de células cultivadas em condições de hipóxicos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 17 s
Description: Aprenda a realizar co-imunoprecipitação de proteínas nucleares endógenas em células HEK293A sob hipóxia. Este método permite investigar interações entre fatores de transcrição e co-reguladores em condições de baixo oxigênio.

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Agradecemos o Prof Assoc. Sin Tiong Ong para a utilização da estação de hipóxia. Este trabalho foi apoiado pelo seguinte: Singapura Ministério da educação, MOE 1T1-02/04 e MOE2015-T2-2-087 (para cá), Lee Kong Chian da faculdade de medicina, Universidade Tecnológica de Nanyang arranque grant M4230003 (p.o.b.), o Conselho Sueco de pesquisa, o Erling Persson Fundação da família, a Novo Nordisk Foundation, o Stichting af Jochnick Foundation, associação sueca de Diabetes, a companhia de seguros Scandia, a pesquisa do Diabetes e Wellness, Fundação do cais von Kantzow, o Programa de investigação estratégica em Diabetes no Karolinska Institutet, a ERC ERC-2013-AdG 338936-Betalmage e a Fundação de Wallenberg Alice e Knut.

Esta seção de protocolo, que usa o rim embrionário humano 293A célula (HEK293A), s segue as diretrizes do Comitê de ética pesquisa humana em Nanyang Technological University, Singapore.
1. indução de hipóxia em células HEK293A
<ol><li>Prepare-se quatro pratos de 10cm e sementes de 3 – 5 x 106 HEK293A células por prato em 10 mL Dulbecco modificado suplementado do Eagle (DMEM, glicose de 4,5 g/L) com 10% de soro fetal bovino (FBS), 2 mM L-glutamina, piruvato de sódio de 110 mg/L, 100 U/mL penicilina e 100 mg / estreptomicina mL. Cultura de células em um 37 ° C, 5% CO2 incubadora. Nota: Célula semeadura deve ser realizada em uma câmara de segurança biológica (CSB). As superfícies de todos os materiais sejam colocados o BSC devem ser limpo com álcool 70%.</li>
	<li>24 h após a semeadura, quando as células têm alcançado a confluência de 80-90%, colocou dois pratos a hipóxia subchamber no porta-luvas incubadora (ver Tabela de materiais) com 1% de O2 e 5% CO2 a 37 ° C e manter os outros dois pratos no normoxia (21% O 2, 5% CO2 a 37 ° C) por 4 h. usar um conjunto de células hipóxicos e normoxic para avaliar o tratamento de hipóxia por western blot e utilizar o outro conjunto de células para as experiências de co-imunoprecipitação. Nota: Os níveis de oxigênio podem ser definidos em 0 – 5% e a duração do tratamento a hipóxia pode ser variado dependendo do tipo de célula e estudo objetivo.</li>
</ol>2. toda célula e extração Nuclear
Nota: Consulte a tabela 1 para obter informações sobre buffers usados no presente protocolo.
<ol><li>
As células de controle de normoxia da colheita.
	<ol>
<li>Remova a mídia de cultura por aspiração e enxágue as células com 10 mL DPBS (PH 7,0-7,2) utilizando uma pipeta de 10 mL. Nota: Evite tocar a monocamada de células com a pipeta. Durante a lavagem, pipete suavemente o DPBS abaixo o muro da placa de cultura de células para evitar a perda de células.</li>
		<li>Pipetar 5 mL DPBS gelada na placa e raspe as células da superfície da placa em PBS gelado com um raspador de célula.</li>
		<li>Transferir a suspensão de eritrócitos para tubos cônico de 15 mL e manter no gelo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Colha as células cultivadas em condições de hipóxicos.
	<ol>
<li>Pre-equilibrar a DPBS às condições de hipóxicos, colocando um descoberta 100 mL experimento reagente frasco de vidro cheio de DPBS no subchamber de hipóxia (1% O2 e 5% CO2 a 37 ° C) por 24 h de antecedência.</li>
		<li>Aproximadamente 1 h antes da colheita de células a hipóxia tratada, coloque uma caixa de gelo contendo gelo na câmara de processamento do porta-luvas, que a solução foi equilibrada para 1% O2 e 5% de CO2. O frasco contendo a pre-equilibrado DPBS hipóxica da hipóxia subchamber para a câmara de processamento de transferência e colocá-lo no gelo.</li>
		<li>4 h após o tratamento de hipóxia, transferir as células de subchamber a hipóxia para a câmara de transformação que tem sido pre-equilibrada para 1% O2 e 5% de CO2.</li>
		<li>Remova a mídia de cultura por aspiração e enxágue as células uma vez com 10 mL geladas DPBS hipóxicos pre-equilibradas com um 10 mL pipeta.</li>
		<li>Adicione 5 mL geladas DPBS pre-equilibradas com um 5 mL pipeta e desalojar as células por raspagem com uma espátula de célula.</li>
		<li>Inclinação da placa de cultura de células e coletar as células desanexadas usando uma pipeta de 10 mL. Transferir a suspensão de eritrócitos em DPBS para tubos cônico de 15 mL e manter no gelo.</li>
		<li>Abra a porta entre as câmaras processamento e tampão do porta-luvas, as quais foram previamente equilibradas para 1% O2 e 5% de CO2. Transferi os tubos cônico de 15 mL contendo células de hipóxia tratada da câmara de processamento para a câmara de tampão de gelo. Abra a porta da câmara reserva e remova completamente as células no porta-luvas.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pelota tanto as células normoxic de 2.1 e as células hipóxicos de 2.2 por centrifugação a 1.000 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
	<li>
Prepare a célula inteira extratos.
	<ol>
<li>Resuspenda as pelotas de célula em 500 µ l de tampão de lise do ensaio (RIPA) imunoprecipitação rádio gelada contendo 50 mM pH cloridrato de Trisaminomethane (Tris-HCl) 8.0, 150 mM de cloreto de sódio (NaCl), 1% preparar-tipo NP-40 (NP-40), 0,5% de sódio Deoxycholate do, e 0,1% Dodecil sulfato de sódio (SDS), suplementado com 1 x coquetel de inibidor de protease (ver Tabela de materiais) pipetando as pelotas de célula acima e para baixo várias vezes.</li>
		<li>Transferir os lisados celulares para novos tubos de microcentrifuga de 1,5 mL e manter no gelo por 30 min com ocasional num Vortex.</li>
		<li>Centrifugue os lisados celulares a 13.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C.</li>
		<li>Recolher o sobrenadante, alíquota 50 µ l do sobrenadante para tubos de 1,5 mL microcentrifuga e armazenar a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Preparar os extratos nucleares usando uma extração nuclear kit (veja a tabela de materiais).
	<ol>
<li>Resuspenda suavemente as pelotas de célula em 500 µ l de tampão de Lise NL suplementado com 1 x coquetel de inibidor de protease e 0,1 M ditiotreitol (DTT) pipetando as pelotas de célula acima e para baixo várias vezes.</li>
		<li>Adicione 25 µ l de solução detergente NP para a suspensão de células e vórtice para 10 s na velocidade máxima.</li>
		<li>Centrifugação a 10.000 x g por 5 min a 4 ° C.</li>
		<li>O sobrenadante (extratos citoplasmáticos), alíquota 50 µ l do sobrenadante para tubos de 1,5 mL microcentrifuga, de coletar e armazenar a-80 ° C.</li>
		<li>Resuspenda o pellet contendo núcleos de célula em 500 µ l de tampão de Lise NL suplementado com 1 x coquetel de inibidor de protease e 0,1 M DTT vortexing para 5 s na velocidade máxima.</li>
		<li>Centrifugar a 10.000 x g por 5 min a 4 ° C e salvar a pelota nuclear.</li>
		<li>Resuspenda o pellet nuclear em 50 µ l de Buffer de extração NX1 suplementado com 1 x coquetel de inibidor de protease pipetando a pelota subindo e descendo várias vezes.</li>
		<li>Incubar durante 30 min no gelo, num Vortex para 10 s cada 5 min na velocidade máxima.</li>
		<li>Centrifugar a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Do desalt os extratos nucleares.
	<ol>
<li>Recolha o sobrenadante da etapa 2.5.9 e transferência para os dispositivos de diálise mini com um volume máximo de 100 µ l por unidade.</li>
		<li>Tampe os dispositivos mini diálise e colocá-los em um dispositivo de flutuação.</li>
		<li>Colocar o dispositivo de flutuação em um béquer contendo 500 mL de tampão de diálise pre-refrigerados (20 mM Tris-HCl pH 7,4, 20% de glicerol, 100 mM de cloreto de potássio (KCl), 0,2 ácido etilenodiaminotetracético de mM (EDTA), 0,2 mM phenylmethylsulfonyl fluoreto (PMSF) e 0,5 mM DTT) e incube por 30 min a 4 ° C, com agitação suave. Cuidado: PMSF é perigosa. Evite o contato direto com a pele ou por inalação.</li>
		<li>Coletar as amostras do canto dos dispositivos mini diálise e transferir para novos tubos de microcentrifuga de 1,5 mL.</li>
		<li>Centrifugar a 12.000 x g por 10 min a 4 ° C, alíquota 25 µ l de cada sobrenadante para um tubo de 1,5 mL microcentrifuga e armazenar a-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. avaliação do tratamento hipóxia por detecção da expressão da proteína e localização Subcellular de HIF-1 α
<ol><li>Determinar a concentração de proteína da célula inteira ou nuclear/citoplasmática extrai usando o ensaio de microplacas de bicinchoninic ácido (BCA) proteína ensaio kit de acordo com as instruções de18 do fabricante.</li>
	<li>Diluir os lisados celulares em 1 x Laemmli amortecedor da amostra contendo 5% 2-Mercaptoetanol e ferva a 95 ° C por 5 min. Cuidado: Não toque na superfície do bloco de aquecimento, uma vez que pode causar queimaduras.</li>
	<li>
Separe as proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida sulfato dodecyl de sódio (SDS-PAGE).
	<ol>
<li>Carrega quantidades iguais de proteínas (25 µ g) em cada poço de um geles de SDS-PAGE prefabricado de gradiente (4 – 20%), juntamente com 3 µ l do marcador de peso molecular.</li>
		<li>Funcione o gel em marcha tampão contendo 2,5 mM Tris, glicina 19,2 mM, 0,01% SDS, PH8.3 por 30 min a 200 V.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Transferi as proteínas do gel para a membrana de nitrocelulose.
	<ol>
<li>Monte o sanduíche de transferência (papel de filtro-gel-membrana-filtro de papel) com o gel do lado do ânodo e a membrana do lado do cátodo da fita.</li>
		<li>Coloque a fita no tanque de transferência preenchido com buffer de transferência contendo 2,5 mM trisaminomethane (Tris), glicina 19,2 mM e 20% de metanol. Cuidado: O metanol é inflamável e deve ser armazenado dentro do armário de armazenamento líquido inflamável.</li>
		<li>Efectue a transferência para 1 h a 100 V na sala fria.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bloquear o borrão em 10 mL de tampão de bloqueio contendo 50 mM Tris-Cl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 0.1 Tween 20 e 5% leite desnatado por 1h à temperatura ambiente em um shaker.</li>
	<li>Incubar o blot com anticorpo anti-HIF-1 α (diluição de 1/500), a mesma reserva de bloqueio durante a noite a 4 ° C.</li>
	<li>Lave a mancha por 5 min por 3 vezes cada vez com 50 mL TBS-T.</li>
	<li>Incubar o blot com peroxidase de rábano (HRP)-anticorpo secundário conjugado (diluição de 1/1.000) em 10 mL TBS-T contendo 5% desnatado leite seco por 1h à temperatura ambiente.</li>
	<li>Lave a mancha por 5 min por 3 vezes cada vez com 50 mL TBS-T.</li>
	<li>Mix de 500 µ l cada de chemilumescent reforçada (ECL) reagente A e B em um tubo de 1,5 mL microcentrifuga e vórtice brevemente.</li>
	<li>Aplicar o substrato ECL para o Borrão e incubar durante 1 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>
Capture os sinais quimioluminescente usando um dispositivo de carga acoplada (CCD) sistema de imagens baseado em câmera.
	<ol>
<li>Escorra o excesso substrato ECL tocando a borda da membrana com um papel absorvente e colocar a membrana em um protetor de folha.</li>
		<li>Coloque a membrana sobre a bandeja de amostra do CCD sistema de imagens baseado em câmera.</li>
		<li>Lançar o software de processamento de imagem (consulte a Tabela de materiais) e capturar as imagens com as seguintes configurações: arquivo → novo protocolo → único canal → configuração protocolo → Gel de imagem (aplicativo: Chemi; Área da imagem: Gel pronto Bio-Rad; Exposição de imagens: O software automaticamente irá otimizar o tempo de exposição para intensas bandas) protocolo de execução → Nota: O tempo de exposição pode ser ajustado manualmente para conseguir as imagens ideais.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. imunoprecipitação e detecção de proteínas de Immunoprecipitated
<ol><li>Lave a 50 µ l de grânulos de proteína A/G sepharose em 500 µ l de tampão TBS em tubos de 1,5 mL microcentrifuga e os grânulos de pelotas por centrifugação a 3.000 x g por 2 min a 4 ° C.</li>
	<li>Desprezar o sobrenadante e ressuspender as contas em 100 µ l de tampão TBS.</li>
	<li>Adicione 2 µ l de anticorpo monoclonal anti-ARNT de rato (1,4 mg/mL) ou mouse imunoglobulina G (IgG) (1,4 mg/mL) que foi preparado pela reorganização do mouse 0,7 mg IgG no buffer TBS 500 µ l.</li>
	<li>Coloque os tubos de microcentrifuga de 1,5 mL contendo os grânulos em um rotador de tubo e incubar durante 2 h a 10 rpm na sala fria. Nota: Lidar com os tubos suavemente e manter a suspensão contendo os grânulos no fundo do tubo.</li>
	<li>Os grânulos de pelotas por centrifugação a 3.000 x g por 2 min a 4 ° C e descartar os sobrenadantes.</li>
	<li>Dilua 200 µ g da proteína nuclear lisada obtida na etapa 2.6.5 em 800 µ l de buffer IP consistindo de 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), 180 mM de NaCl, 20% de glicerol, 0,2% x NP-40 e 1 inibidor da protease cocktail. Incubar o lisado com os grânulos de anticorpos acoplados obtidos na etapa 4.5 durante a noite a 4 ° C.</li>
	<li>Os grânulos de pelotas por centrifugação a 3.000 x g por 2 min a 4 ° C, descartar os sobrenadantes e lave os grânulos 3 vezes com 1 mL gelada TBS contendo 0,2% NP-40.</li>
	<li>Ferva os grânulos em 50 amortecedor da amostra Laemmli µ l a 95 ° C por 5 min.</li>
	<li>Centrifugue os grânulos a 10.000 x g por 5 min a 4 ° C, recolher o sobrenadante e descartar os grânulos. Nota: O sobrenadante pode ser armazenado a 4 ° C para o curto prazo ou a-20 ° C, a longo prazo.</li>
	<li>Detecta a presença de HIF-1 α partir os complexos de proteína immunoprecipitated pelo borrão ocidental, conforme descrito no passo 3.3 em diante. Nota: A quantificação da proteína não é necessária para esta etapa. Carregar o volume completo (50 μL) do líquido sobrenadante de cada amostra em cada poço de um geles de SDS-PAGE prefabricado de gradiente (4 – 20%)</li>
</ol>

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<li>Dumetz, A. C., Snellinger-O'brien, A. M., Kaler, E. W., Lenhoff, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+protein+protein+interactions+in+salt+solutions+and+implications+for+protein+crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Patterns of protein protein interactions in salt solutions and implications for protein crystallization.</a> Protein Sci. 16 (9), 1867-1877 (2007).</li>
<li>Graven, K. K., Troxler, R. F., Kornfeld, H., Panchenko, M. V., Farber, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+endothelial+cell+glyceraldehyde-3-phosphate+dehydrogenase+expression+by+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulation of endothelial cell glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase expression by hypoxia.</a> J Biol Chem. 269 (39), 24446-24453 (1994).</li>
<li>Caradec, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Desperate+house+genes%27%3A+The+dramatic+example+of+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Desperate house genes': The dramatic example of hypoxia.</a> Br J Cancer. 102 (6), 1037-1043 (2010).</li>
</ol>

Os autores declaram não há conflitos de interesse.

O complexo HIF-1 é um mestre regulador da homeostase celular oxigênio e regula uma infinidade de genes envolvidos em diferentes respostas adaptativas celulares à hipoxia. Identificação de novas proteínas de interação de HIF-1 é importante para a compreensão da transdução de sinal de hipoxia. Co-imunoprecipitação experimentos são comumente usados para estudos de IPP para delinear as vias de transdução de sinal de celular. No entanto, superexpressão de proteínas é ainda amplamente utilizada e isso pode levar a artefatos ex...

Hipóxia ocorre quando insuficiente oxigênio é fornecido para as células e tecidos do corpo. Desempenha um papel crítico em vários processos fisiológicos e patológicos, tais como a diferenciação de células-tronco, inflamação e câncer1,2. Hypoxia-inducible fatores (transplanta) funcionam como heterodímeros, compostos por uma subunidade α oxigênio-regulado e uma subunidade β constitutivamente expressa ARNT também conhecido como3. Até à data, foram identificadas três isoformas de três subunidades de HIF-β (ARNT/HIF-1 β, ARNT2 e ARNT3) e as subunidades de HIF-α (HIF-1 α, HIF-2α e HIF-3α). HIF-1 α e ARNT ubiquitously são expressos, Considerando que o HIF-2α, HIF-3α, ARNT2 e ARNT3 têm mais restrito de padrões de expressão4. A complexo de proteína HIF-1 é o regulador chave da resposta hipoxia. Em condições de hipóxicos, HIF-1 α torna-se estabilizado, então translocates ao núcleo e dimeriza com ARNT5. Posteriormente, este complexo liga de nucleotídeos específicos conhecidos como elementos responsivos de hipóxia (HREs) e regula a expressão de genes-alvo envolvidos nos diversos processos, incluindo a angiogênese, eritropoiese e glicólise6. Além desta resposta "canônica", a via de sinalização de hipóxia é também conhecida por crosstalk com múltiplas resposta celular, sinalização de vias como entalhe e Nuclear Factor-kappa B (NF-κB)7,8,9.
A identificação das proteínas de interação romance HIF-1 é importante para uma melhor compreensão da hipóxia via de sinalização. Em contraste com ARNT, que é insensível aos níveis de oxigênio e constitutivamente expressa, níveis de proteína HIF-1 α estão fortemente regulamentados pelos níveis de oxigênio celular. No normoxia (21% de oxigênio), proteínas de HIF-1 α são rapidamente degradadas10,11. A meia-vida curta de HIF-1 α no normoxia apresenta desafios técnicos específicos para a deteção da proteína da célula extratos, bem como para a identificação das proteínas HIF-1 α-interagindo. Além disso, vários fatores de transcrição, incluindo aqueles do complexo HIF-1 translocar para o núcleo sob condições de hipóxia12,13,14. A maioria dos atuais métodos utilizados para estudos PPI é executada usando não-fisiológica superexpressão de proteínas. Tal superexpressão da proteína foi relatado para causar defeitos celulares diferentes através de vários mecanismos, incluindo a sobrecarga de recursos, desequilíbrio estequiométrico, interações promíscuas e via modulação15,16. Em termos de estudos PPI, a superexpressão da proteína pode levar a falso negativo positivo, ou mesmo falso, resultados, dependendo das propriedades da proteína e funções das proteínas Blumental. Portanto, os métodos atuais para estudos PPI tem que ser modificado a fim de revelar o IPP fisiologicamente relevantes sob condições de hipoxia. Nós demonstramos anteriormente a interação entre o HIF-1 e o fator de transcrição família Ets GA-proteína (GABP) em células de P19 hipóxicos, que contribui para a resposta do promotor Hes1 à hipóxia17. Aqui, descrevemos um co-imunoprecipitação para estudar PPIs entre endógenas proteínas nucleares em condições de hipóxicos. A interação entre o HIF-1 α e ARNT é mostrada como uma prova de conceito. Este protocolo é apropriado para demonstrar as interações entre os fatores de transcrição e reguladores transcricionais de co em condições de hipóxicos, incluindo mas não limitado à identificação das proteínas de interação de HIF-1.

<table><tbody><tr><td><forte>Material</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.0 M Tampão Tris-HCl, pH 7.4&nbsp;</td><td>1ª BASE</td><td>1415</td><td></td></tr><tr><td>Proteína A/G Grânulos de Sepharose</td><td>Abcam</td><td>ab193262</td><td></td></tr><tr><td>Proteína IgG de camundongo natural</td><td>Abcam</td><td>ab198772</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Bio-Rad</td><td>1610729</td><td></td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample Buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610737</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610710</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocelulose Membrana &nbsp; &nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Bloqueador de Grau de Blotting</td><td>Bio-Rad</td><td>1706404</td><td>Leite em pó desnatado para aplicações de western blotting</td></tr><tr><td>10x Tris Buffered Saline (TBS)</td><td>Bio-Rad</td><td>1706435</td><td></td></tr><tr><td>10% Tween 20</td><td>Bio-Rad</td><td>1610781</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine Buffer&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1610771</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Padrões de Cor Dupla</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG, Anticorpo Ligado a HRP</td><td>Sinalização Celular</td><td>7074</td><td></td></tr><tr><td>IgG Anti-camundongo, Anticorpo Ligado a HRP&nbsp;</td><td>Sinalização Celular</td><td>7076</td><td></td></tr><tr><td>Reagente ECL SignalFire</td><td>Sinalização Celular</td><td>6883</td><td></td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato Dulbecco</td><td>Corning</td><td>21-030-CV</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF)</td><td>Merck Millipore</td><td>52332</td><td></td></tr><tr><td>ARNT/HIF-1 beta Anticorpo&nbsp;</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-124&nbsp;</td><td>Concentração: 1,4 mg/mL</td></tr><tr><td>HIF-1 alfa Anticorpo</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB100-479</td><td>Concentração: 1,0 mg/mL</td></tr><tr><td>YY1 Anticorpo Novus</td><td>Biologicals</td><td>NBP1-46218</td><td>Concentração: 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>Qproteome Nuclear Protein Kit</td><td>Qiagen</td><td>37582</td><td>Tampão de lise NL e Extraction Buffer NX1 são fornecidos no kit</td></tr><tr><td>GAPDH Anticorpo</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-47724</td><td>Concentração: 0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>Glicerol (&ge; 99%)</td><td>Sigma</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Tampão RIPA</td><td>Sigma</td><td>R0278</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio (NaCl)</td><td>Sigma</td><td>71376</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Sigma</td><td>127087-87-0</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Águia modificada' s meio (DMEM, 4.5 g/L de glicose)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995065</td><td></td></tr><tr><td>Ditiotreitol (DTT)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>HEK293A linha celular</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>Metanol&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Protease Inhibitor Tablets&nbsp;</td>Kit de Ensaio de Proteína BCA Pierce <td>88660</td><td></td> <td>da Thermo Fisher</td></tr><tr><td></td> Scientific <td>23225</td><td></td>Ponta de carregamento de gel QSP da <td>Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>QSP#010-R204-Q-PK</td><td>1-200 uL</td></tr><tr><td>Equipment/Instrument</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thick Blot Filter Paper, Precut, 7.5 x 10 cm</td><td>Bio-Rad</td><td>1703932</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&nbsp; Tetra Célula de Eletroforese Vertical para Mini Géis Pré-moldados, com Mini Trans-Blot&nbsp; Módulo e Fonte de Alimentação Básica PowerPac</td><td>Bio-Rad</td><td>1658034</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 15% Mini-PROTEAN TGX Géis de Proteína Pré-moldados</td><td>Bio-Rad</td><td>4561083</td><td></td></tr><tr><td>ChemiDoc XRS+ System</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td></td></tr><tr><td>Luva</td><td>BioSpherix</td><td>I-Glove</td><td></td></tr><tr><td>Synergy HTX Leitor de Microplacas Multi-Modo&nbsp;</td><td>BioTek</td><td>BTS1LFTA</td><td></td></tr><tr><td>Costar 5mL Stripette Pipetas Sorológicas</td><td>Corning</td><td>4487</td><td></td></tr><tr><td>Costar 10mL Stripette Pipetas Sorológicas</td><td>Corning</td><td>4488</td><td></td></tr><tr><td>Costar 25mL Stripette Pipetas Sorológicas</td><td>Corning</td><td>4251</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-Well Fundo Transparente Microplacas de Poliestireno Preto</td><td>Corning</td><td>3631</td><td></td></tr><tr><td>15mL de Alta Tubos de Centrífuga Cônicos PP Clarity</td><td>Corning</td><td>352095</td><td></td></tr><tr><td>Raspador de Células Pequenas</td><td>Corning</td><td>3010</td><td></td></tr><tr><td>Gilson&nbsp; Kit de 4 pipetas Pipetman L&nbsp;</td><td>Gilson</td><td>F167370</td><td>P2, P20, P200, P1000 e acessórios</td></tr><tr><td>Tubos de Microcentrífuga de Polipropileno de 1,5mL</td><td>Greiner Bio-One&nbsp;</td><td></td><td></td>616201</tr><tr><td>PIPETBOY acu 2 Pipettor</td><td>INTEGRA Biosciences</td><td>155 000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Armários de armazenamento de líquidos inflamáveis Justrite</td><td>Justrite Manufacturing Co.</td><td>896000</td><td></td></tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>Labnet</td><td>S0200</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2</td><td>NuAire</td><td>NU-5820</td><td></td></tr><tr><td>Agitadores orbitais</td><td>Stuart</td><td>SSL1</td><td></td></tr><tr><td>Rotador de tubo SB3</td><td>Stuart</td><td>SB3</td><td></td></tr><tr><td>MicroCL 21R Microcentrífuga</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>75002470</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 16 Centrífuga</td><td>Thermo Placas</td><td>de Cultura de Tecidos 75004240</td><td></td>Fisher</tr><tr><td>Scientific (100 mm)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>150350</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer MINI Dispositivo de Diálise</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69580</td><td>10K MWCO, 0.1 mL</td></tr><tr><td>Bóias de Flutuação para 0.1mL Slide-A-Lyzer MINI Dispositivos de Diálise</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>69588</td><td></td></tr><tr><td>LSE Aquecedores de Banho Seco Digital</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>1168H25</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&nbsp; 1300 Classe II da Série A2, Tipo A2 Bio Armários de Segurança</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>13-261-308</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Software de Laboratório</td><td>Bio-Rad</td><td>1709691</td><td></td></tr></tbody></table>

co-imunoprecipitação ensaio usando proteínas nucleares endógenas de células cultivadas em condições de hipóxicos

Co-immunoprecipitation Assay Using Endogenous Nuclear Proteins from Cells Cultured Under Hypoxic Conditions

Baixos níveis de oxigênio (hipóxia) desencadear uma variedade de respostas adaptativas com o Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complexos atuando como um regulador de mestre. HIF-1 consiste de uma subunidade α oxigênio-regulado de heterodimérica (HIF-1 α) e constitutivamente expressa a subunidade beta (HIF-1 β) também conhecido como aril hidrocarboneto do receptor nuclear translocator (ARNT), regulação de genes envolvidos em diversos processos, incluindo a angiogênese , eritropoiese e glicólise. A identificação das proteínas de interação de HIF-1 é a chave para a compreensão da hipóxia via de sinalização. Além do Regulamento de HIF-1 α estabilidade, a hipóxia também aciona a translocação nuclear de muitos fatores de transcrição, incluindo HIF-1 α e ARNT. Notavelmente, a maioria dos atuais métodos utilizados para estudar tais interações da proteína-proteína (PPIs) é baseada em sistemas onde os níveis de proteína são artificialmente aumentados através da superexpressão da proteína. Superexpressão da proteína, muitas vezes leva a resultados não-fisiológicos decorrentes de artefatos temporais e espaciais. Aqui nós descrevemos uma co-imunoprecipitação modificada após o tratamento de hipóxia usando proteínas nucleares endógenas e como uma prova de conceito, para mostrar a interação entre o HIF-1 α e ARNT de protocolo. Neste protocolo, as células hipóxicos foram colhidas em condições de hipóxicos e tampão de lavagem de o Dulbecco Phosphate-Buffered salina (DPBS) também foi previamente equilibrado a hipoxia condições antes do uso para mitigar a degradação de proteína ou proteína complexa dissociação durante a reoxigenação. Além disso, as frações nucleares foram posteriormente extraídas para concentrar e estabilizar proteínas nucleares endógenas e evitar possíveis resultados espúrios muitas vezes vistos durante a superexpressão da proteína. Este protocolo pode ser usado para demonstrar endógenas e nativas de interações entre fatores de transcrição e reguladores transcricionais de co em condições de hipóxicos.

Para avaliar a resposta celular a hipóxia, a expressão de níveis e Localização subcellular dos componentes do tratamento de hipóxia seguir HIF-1 complexo foram examinados. HEK293A as células foram cultivadas em condições de hipóxicos para 4h ou mantidos no normoxia como controles. Níveis de proteína HIF-1 α e ARNT foram examinados no celular ou nuclear/citoplasmática extrai pelo borrão ocidental. Como esperados, totais de níveis de HIF-1 α foram upregulated por hipóxia, Considerando que o...

Aqui nós descrevemos uma co-imunoprecipitação para estudar interações da proteína-proteína entre endógenas proteínas nucleares em condições de hipóxicos. Este método é adequado para demonstração das interacções entre factores de transcrição e reguladores transcricionais de co em hipóxia.

Co-imunoprecipitação ensaio usando proteínas nucleares endógenas de células cultivadas em condições de hipóxicos

Low oxygen levels (hypoxia) trigger a variety of adaptive responses with the Hypoxia-inducible factor 1 (HIF-1) complex acting as a master regulator. ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo hipóxico, como interações endógenas e nativas entre fatores de transcrição e seus correguladores transcricionais em condições hipóxicas. A principal vantagem desta técnica é que as células hipóxicas são colhidas em condições hipóxicas e as frações nucleares são utilizadas para a co-imunoprecipitação. Este protocolo usa células 293A do rim embrionário humano cultivadas em quatro placas de 10 centímetros.Semeie três a cinco vezes 10 a sextas células por prato em 10 mililitros de meio de Eagle modificado de Dulbeco suplementado com 10% de FBS, L-glutamina, piruvato de sódio, penicilina e estreptomicina. Cultive as células em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius a 5%. Vinte e quatro horas após a semeadura, quando as células atingirem 80 a 90% de confluência, coloque dois pratos na subcâmara de hipóxia no porta-luvas da incubadora com 1% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por quatro horas.Mantenha os outros dois pratos em normóxia. No dia anterior à colheita das células tratadas com hipóxia, pré-equilibre a DPBS para condições hipóxicas, colocando um frasco de reagente de vidro experimental descoberto de 100 mililitros cheio de DPBS na subcâmara de hipóxia por 24 horas. Aproximadamente uma hora antes da colheita das células, coloque uma geladeira contendo gelo na câmara de processamento do porta-luvas, que foi equilibrada para 1% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono.Transfira o frasco contendo o DPBS hipóxico pré-equilibrado da subcâmara de hipóxia para a câmara de processamento e coloque-o no gelo. Quatro horas após o tratamento da hipóxia, transfira as células da subcâmara de hipóxia para a câmara de processamento que foi pré-equilibrada para 1% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Remova o meio de cultura por aspiração e com uma pipeta de 10 mililitros, lave as células uma vez com 10 mililitros de DPBS hipóxica pré-equilibrada gelada.Usando uma pipeta de cinco mililitros, adicione 5 mililitros de DPBS pré-equilibrado gelado e desaloje as células raspando com um raspador de células. Inclinar a placa de cultura de células, recolher as células destacadas com uma pipeta de 10 ml e transferir a suspensão celular para um tubo cónico de 15 ml. Mantenha o tubo de células no gelo.Abra a porta entre as câmaras de processamento e tampão no porta-luvas, ambas pré-equilibradas para 1% de oxigênio e 5% de dióxido de carbono. Transfira os tubos cônicos de 15 mililitros em gelo contendo células tratadas com hipóxia da câmara de processamento para a câmara tampão. Abra a porta da câmara tampão e remova completamente as células do porta-luvas.Pulverizar as células hipóxicas e as células normóxicas por centrifugação a 1000 vezes g durante cinco minutos a quatro graus Celsius. Um kit de extração nuclear será usado para este procedimento. Comece ressuspendendo suavemente cada pellet celular em 500 microlitros de tampão de lise NL, suplementado com coquetel de inibidor de protease 1X em DTT de 0,1 molar, pipetando para cima e para baixo várias vezes.Adicione 25 microlitros de solução detergente NP à suspensão da célula e vórtice por 10 segundos na velocidade máxima. Centrifugue a 1000 vezes 10 g a quatro graus Celsius por cinco minutos. Salve o sobrenadante e o pellet nuclear.Após coletar e armazenar o sobrenadante conforme descrito no protocolo de texto, ressuspender os núcleos celulares contendo pellets em 500 microlitros de tampão de lise NL, suplementado com coquetel inibidor de protease 1X e DTT 0,1 molar por vórtice por cinco segundos na velocidade máxima. Ressuspenda o pellet nuclear em 50 microlitros de tampão de extração NX1, complementado com coquetel de inibidor de protease 1X, pipetando o pellet para cima e para baixo várias vezes. Incube no gelo por 30 minutos.A cada cinco minutos, vórtice por 10 segundos na velocidade máxima. Centrifugar a 12 000 x g a quatro graus Celsius durante 10 minutos. Colete o sobrenadante e transfira para dispositivos de minidiálise com o volume máximo de 100 microlitros por unidade para dessalinização.Tampe os mini dispositivos de diálise e coloque-os em um dispositivo de flutuação. Coloque o dispositivo de flutuação em um béquer contendo 500 mililitros de tampão de diálise pré-resfriado. Tenha cuidado para evitar o contato direto com a pele ou a inalação do tampão de diálise, pois ele contém PMSF.Incube a quatro graus Celsius com agitação suave por 30 minutos. Após 30 minutos, colete as amostras do canto dos dispositivos de minidiálise e transfira para novos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Centrifugue a 12 mil vezes g a quatro graus Celsius por 10 minutos.Alíquota de 25 microlitros de cada sobrenadante em um tubo de centrífuga de 1,5 microlitro e armazene a 80 graus Celsius negativos. Preparar as esferas de sepharose AG da proteína a utilizar na imunopreciptação. Pipete 50 microliteras de grânulos em cada um dos quatro tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro e adicione 500 microlitros de tampão DPBS por tubo.Pellet as contas por centrifugação. Descarte o sobrenadante e ressuspenda os grânulos em 100 microlitros de tampão TBS. Adicione dois microlitros de anticorpo monoclonal anti-ARNT de camundongo ou imunoglobulina G de camundongo que foi preparada reconstituindo 0,7 miligramas de IgG de camundongo em 500 microlitros de tampão TBS.Leve os tubos de microcentrífuga contendo os grânulos para uma câmara fria. Coloque-os em um rotador de tubo e incube a 10 rpm por duas horas. Após duas horas, peletizar as esferas por centrifugação e descartar os sobrenadantes.Diluir 200 microgramas do lisado de proteína nuclear preparado anteriormente em 800 microlitros de tampão de imunoprecipitação. Incube o lisado com as esferas acopladas a anticorpos a quatro graus Celsius durante a noite. No dia seguinte, pelete as esferas por centrifugação a 3000 vezes g por dois minutos a quatro graus Celsius.Descarte o sobrenadante. Adicione um mililitro de TBS gelado contendo 0,2% NP-40 a cada tubo e gire para baixo. Desta forma, lave as contas três vezes com TBS gelada contendo 0,2% NP-40.Ferva as esferas em 50 microlitros de tampão de amostra Laemmli a 95 graus Celsius por cinco minutos. Centrifugue as esferas a 10 mil vezes g a quatro graus Celsius por cinco minutos. Colete o sobrenadante e descarte as contas.Os níveis de expressão na localização subcelular dos componentes do complexo HIF-1 após o tratamento com hipóxia foram examinados em HEK293A células. Como esperado, os níveis totais de HIF-1a foram regulados positivamente por hipóxia, enquanto os níveis de ARNT em lisados celulares totais não foram significativamente alterados. Além disso, a hipóxia induziu o acúmulo nuclear de HIF-1a e ARNT.Experimentos de co-imunoprecipitação foram realizados usando extratos nucleares de células HEK293A expostas a condições normóxicas ou hipóxicas. Como mostrado aqui, o HIF-1a foi co-imunoprecipitado junto com ARNT dos extratos nucleares de células HEK293A hipóxicas, indicando que o HIF-1a interage com ARNT em condições hipóxicas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores no campo da hipóxia explorarem as interações proteicas nucleares endógenas e suas condições hipóxicas.

co-immunoprecipitation-assay-using-endogenous-nuclear-proteins-from

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

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