Determinação da membrana plasmática de particionamento para proteínas associadas perifericamente

Este método pode ajudar a responder a questões-chave em biologia celular, incluindo desvendar as vias de sinalização celular. Portanto, a principal vantagem dessa técnica é que ela realmente não requer nenhuma abordagem microscópica sofisticada. Também é muito rápido e, portanto, utilizável para observação em tempo real da distribuição de proteínas nas células.

A avaliação e quantificação da partição da membrana da proteína associada perifericamente é complicada devido à difração da luz que causa uma mistura de membrana plasmática e fluorescência citoplasmática ao microscópio. Inicie este procedimento com a preparação do material biológico conforme descrito no protocolo de texto. Manchar o material preparado com corante FM 4-64 aplicando um protocolo de coloração apropriado para o material estudado.

Para células BY-2 de tabaco, corar 200 microlitros de suspensão celular com 0,2 microlitros de solução FM 4-64 10 milimolar em dimetilsulfóxido. Para capturar uma seção confocal equatorial por célula, defina uma varredura sequencial de dois canais para o cromóforo usado como etiqueta de proteína e para FM 4-64. Defina também uma resolução óptica mais alta.

Um exemplo de configuração é uma objetiva de imersão em óleo 63 vezes com uma abertura numérica de 1,3 e um tamanho de imagem de 1.024 por 1.024 pixels. Instale o Fiji ImageJ Distribution e o periférico macro necessário. Em Fiji, selecione plug-ins, depois macros, instale no menu principal e especifique o caminho para o arquivo baixado com o periférico de macro ImageJ.

Instale o software do R Project e os pacotes necessários. Execute a Interface Gráfica do Usuário do R, selecione pacotes, instale os pacotes no menu principal e especifique o repositório mais próximo, bem como o pacote ggplot2 para instalação. Baixe o periférico do Pacote R.

Instale-os selecionando pacotes e, em seguida, instale pacotes de arquivos locais. Processe as imagens confocais do marcador citoplasmático. Para fazer isso, importe as imagens para Fiji usando plug-ins, bioformatos e, em seguida, importador de bioformatos no menu Fiji com as configurações padrão.

Execute a macro de opções de importação para uma configuração de análise. Ative a macro selecionando o mesmo item após clicar no menu de proteína periférica da ferramenta de menu. Defina o valor apropriado no campo gaussiano desfoque raio pixel.

Isso influencia a suavização da imagem e a redução de ruído. Um valor baixo é suficiente e não causa perda de informações de imagem. Agora defina um valor no pixel de largura da linha do perfil do campo.

Uma linha mais grossa causa maior suavização das curvas de perfil. Recomenda-se um valor padrão de 10 pixels. Defina um título de imagem, analisando pela definição de delimitadores de amostra e itens exportados.

Clique em OK. Verifique a análise do título na próxima janela de diálogo e clique em OK ou voltar para redefinir. Em seguida, execute uma seleção linear na região da membrana plasmática nas imagens processadas e meça os perfis de fluorescência. Para fazer isso, selecione a linha reta da ferramenta Fiji na barra de ferramentas Fiji.

Clique na imagem e arraste uma linha pela região da membrana plasmática. A linha deve começar no espaço extracelular e deve ser perpendicular à membrana plasmática. Escolha regiões com uma camada mais espessa e homogênea de citoplasma cortical.

O comprimento ideal da seleção linear é de cinco a 10 mícrons. Execute a macro de perfil de tomada clicando na ferramenta de perfil de tomada na barra de ferramentas Fiji. A medição automática dos perfis de fluorescência em ambos os canais será realizada e os dados serão exibidos na janela de resultados.

De acordo com a variabilidade do sinal individual, pegue números representativos dos perfis para cada célula. Execute a macro de dados do perfil de plotagem para visualização gráfica dos perfis medidos. Defina o parâmetro na janela de diálogo da macro chamada.

Mantenha a caixa de seleção usar filtragem para dados de entrada desmarcada. Especifique se o gráfico deve ser criado a partir de dados recentes na janela de resultados de um único arquivo CSV ou de todos os arquivos CSV em um diretório especificado clicando no botão de opção apropriado. Especifique quais fatores de agrupamento serão usados para a plotagem, marcando as caixas de seleção apropriadas.

Selecione o fator I se todos os perfis devem ser exibidos em gráficos exclusivos. Mantenha as caixas de seleção desmarcadas se todos os dados devem ser plotados em um único gráfico. Clique em OK. Especifique o caminho e o nome do arquivo para salvar os resultados ou para eventual importação de dados na próxima janela de diálogo.

Confirme a análise clicando em OK nas janelas de diálogo, mostrando o código R executado. Execute a macro de configuração de filtragem de perfil se alguns perfis plotados tiverem sinais excessivos no espaço extracelular ou intracelular. Em seguida, defina os parâmetros na janela de diálogo da macro chamada.

Para cada canal, defina o limite de intensidade apropriado no file, remova as medições com um sinal extracelular ou intracelular excessivo. Especifique a região onde o limite de intensidade será aplicado no campo em coordenadas X menores ou maiores que e clique em OK. Execute a macro de dados do perfil de plotagem novamente com a caixa de seleção usar filtragem para entrada de dados selecionada. Agora adicione os dados do arquivo salvo anteriormente.

Certifique-se de que todos os perfis aberrantes foram removidos com êxito, caso contrário, melhore os parâmetros de filtragem. Execute a macro create model para criar um modelo da membrana plasmática e da distribuição de fluorescência do citoplasma com base nos dados de calibração. Depois de definir os parâmetros na janela de diálogo da macro chamada, conforme detalhado no protocolo de texto, clique em OK. Especifique o caminho e o nome do arquivo de entrada nas próximas janelas de diálogo e confirme a análise clicando em OK na janela de diálogo que mostra o código R executado.

Em seguida, processe as imagens das células que expressam a proteína de interesse. Importe as imagens e configure a análise como antes. A suavização e a largura da linha devem ser idênticas.

Prossiga para medir os perfis. Verifique a precisão dos perfis plotando e defina a filtragem, se desejar, conforme descrito anteriormente. Execute a macro calculate distribution para o cálculo de uma partição de proteína entre a membrana plasmática e no citoplasma.

Especifique dados de entrada e fontes de modelo e, eventualmente, defina uma filtragem de dados. Mantenha a caixa de seleção ativada para remover resultados com variabilidade residual maior do que se uma filtragem de resultados fosse desejada. Especifique o limite da variabilidade residual máxima permitida que pode ser inexplicada pela decomposição do sinal da medição do perfil individual.

Selecione fatores de agrupamento de amostra, que podem ser usados para criar um gráfico de caixa. Clique em OK, especifique os caminhos de entrada ou saída e confirme a análise clicando em OK na janela de diálogo que mostra o código R executado. Aqui é mostrada uma imagem de uma célula corada com FM 4-64 expressando uma proteína vegetal, que está associada à membrana plasmática via N-miristoilação e interação eletrostática com fosfoinositídeos.

Essas interações foram experimentalmente perturbadas por wortmannin. A importância da N-miristoilação foi testada por mutação em glicina na posição do segundo aminoácido que serve como sítio de N-miristoilação. O efeito da remoção de ambas as habilidades de ligação à membrana plasmática foi testado pelo truncamento do domínio N-terminal da proteína.

O gráfico de caixa resultante mostra uma diminuição da afinidade da membrana plasmática após a mutação do local da N-miristoilação e após o tratamento medicamentoso. Seu efeito mútuo é comparável ao efeito da remoção do domínio N-terminal. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar as principais etapas da análise em uma ordem adequada e como definir seus parâmetros.

Após essa análise, métodos estatísticos como ANOVA podem ser realizados para avaliação estatística dos dados obtidos. Embora esse método tenha sido desenvolvido para células em suspensão de plantas, ele também pode ser aplicado a outras células ou tecidos com membranas plasmáticas lisas e claramente distinguíveis.