Métodos para a descoberta de novos compostos modulando um Receptor do ácido gama - aminobutírico tipo uma neurotransmissão

O objetivo geral deste vídeo é ilustrar uma cascata de triagem que permite a descoberta de novos ligantes do receptor GABA-A. A vantagem de usar a ligação de radioligantes, o registro eletrofisiológico em oócitos de xenopus e em fatias de cérebro de roedores de maneira literal é que o perfil do composto pode ser melhorado. Por fim, são identificados compostos potentes, subtipos, seletivos e eficazes.

Esta demonstração será realizada por Kumico Kambara e Jenna Tognaccini, bem como Sonia e Daniel Bertrand da HiQScreen e Marie Claire Pflimlin da Roche. Injetar 10 a 50 nanolitros da solução contendo plasmídeo usando uma agulha de microinjeção de vidro com diâmetro de ponta variando até 100 micrômetros montada em um micromanipulador equipado com um sistema de ejeção de pressão ou com um sistema de injeção automatizado. Para iniciar este procedimento, mantenha os oócitos a 17 graus Celsius para evitar a expressão de proteínas de choque térmico.

Armazene a microplaca em uma área de armazenamento termicamente controlada. Em seguida, dissolva os compostos de teste, que foram testados positivos no ensaio de ligação em OR2, a 0,1 e 1000 micromolares para registros eletrofisiológicos e descarte-os em uma placa de polipropileno de fundo plano de 96 poços. Para realizar o registro do grampo de tensão de dois eletrodos, coloque uma placa contendo os oócitos no sistema automatizado.

Programe o sistema de registo automatizado utilizando a interface baseada em ícones com este esquema para a determinação adequada da relação concentração-actividade. Para o ajuste da curva, usando a curva de ativação de concentração ilustrada, plote a amplitude da corrente em função do logaritmo da concentração do agonista. Para registro eletrofisiológico, mantenha o cérebro em solução dACSF borbulhada com carbogênio à temperatura ambiente.

Em seguida, disseque a formação hipocampal esquerda com uma espátula fina. Posteriormente, corte slides transversais de 400 micrômetros de espessura da parte mediana do hipocampo com um picador de tecido. Com um pincel, transfira as fatias para a câmara de gravação e mantenha-as à temperatura ambiente durante 45 minutos.

Em seguida, perfunda as fatias com rACSF borbulhado com carbógeno a 35 graus Celsius e a uma taxa de 1,5 mililitros por minuto. Para registrar um único pico populacional, coloque uma fatia de cérebro na câmara montada no microscópio. Perfunda a fatia com rACSF a uma taxa de três mililitros por minuto.

Usando o extrator de pipeta, puxe uma micropipeta de vidro borossilicato com uma resistência de cerca de dois megaohms. Encha a micropipeta com uma solução contendo dois molares de cloreto de sódio e coloque-a no porta-pipetas. Posicione a micropipeta de registro no estrato piramidal na região CA1 do corte do hipocampo usando o micromanipulador direito.

Em seguida, coloque um eletrodo de irídio de platina bipolar isolado no suporte do micromanipulador esquerdo. Posicione o eletrodo de estimulação nas colaterais de Schaffer na região CA1 do corte hipocampal usando o micromanipulador esquerdo. Usando o gerador de estímulo, forneça um pulso de corrente ao eletrodo de estimulação a cada 30 segundos e aumente gradualmente a força de estimulação até que um pico populacional apareça.

Ajuste a força do estímulo para evocar um pico populacional correspondente a 45% da amplitude máxima que pode ser obtida. Para realizar a inibição de pulso emparelhado, forneça dois pulsos de corrente ao eletrodo de estimulação a cada 30 segundos usando o gerador de estímulo. Defina a força do estímulo para evocar um pico populacional correspondente a 45% da amplitude máxima.

Para testar os compostos, faça diluições dos compostos a serem testados em ACSF de modo que a concentração final de DMSO não seja superior a 0,1%Adicione DMSO à solução de controle na mesma concentração da solução composta. Registre um pico populacional de pulso único ou emparelhado evocado por estímulos colaterais de Schaffer a cada 30 segundos por pelo menos 30 minutos. A forma do pico populacional deve ser estável durante este período de linha de base.

Em seguida, prepare um béquer com rACSF carbogenado contendo uma concentração fixa do composto a ser testado e perfunda a fatia do hipocampo com a solução durante o registro de picos populacionais de pulso único ou emparelhado. Além disso, avalie a recuperação do efeito composto perfundindo a fatia com rACSF carbogenado sem o composto. Aqui é mostrada uma representação esquemática de uma fatia do hipocampo de rato, as colaterais de Schaffer originárias dos axônios das células piramidais CA3 projetando-se na arborização dendrítica dos neurônios piramidais CA1.

Micropipetas foram colocadas no estrato piramidal para registrar picos populacionais e no estrato radiado para registros dendríticos de potenciais pós-sinápticos excitatórios de campo. O eletrodo de estimulação foi colocado dentro das colaterais de Schaffer. Esta figura mostra picos populacionais evocados pelos estímulos emparelhados aplicados através do mesmo eletrodo estimulante em um intervalo de 20 milissegundos.

A resposta da população ao segundo estímulo é de menor amplitude do que a resposta ao primeiro estímulo. Picos populacionais foram registrados na ausência e presença de beta CCM, um receptor GABA A não seletivo NAM. O CCM beta aumentou a amplitude do segundo pico populacional, bloqueando parcialmente qualquer inibição gabaérgica feed-forward.

Após este procedimento, outros métodos como farmacocinética, ocupação e eficácia do receptor in vivo e farmacologia de segurança podem ser realizados para responder a questões adicionais, como potencial para o desenvolvimento clínico dos compostos identificados.