Name: Métodos para a descoberta de novos compostos modulando um Receptor do ácido gama - aminobutírico tipo uma neurotransmissão (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 16 s
Description: Aprenda a descobrir novos ligantes para receptores GABA A usando ensaios de ligação e gravações eletrofisiológicas em oócitos de Xenopus e fatias cerebrais de roedores. Este método sistemático identifica compostos seletivos com potencial terapêutico.

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Os autores agradecer Judith Lengyel, Maria Karg, Grégoire Friz, Rachel Haab, Marie Claire Pflimlin da Roche e Tifany Schaer e Deborah Paolucci de HiQScreen por sua excelente assistência técnica.

Xenopus laevis são alojados e tratadas de acordo com as diretrizes de Animal do Cantão de Genebra.
1. radioligantes vinculação
<ol><li>
Preparação da placa de ensaio
	<ol>
<li>Prepare-se 1,5 L de buffer de ensaio com 5 mM KCl, 1,25 mM CaCl2, 1,25 mM MgCl2, 120 mM de NaCl e 15 mM Tris; ajuste o pH com HCl a 7,4.</li>
		<li>Prepare os compostos para ser testado na 50.76 µM (por exemplo, um composto em 10 milímetros em um buffer de ensaio 980 µ l em um tubo de microcentrifugadora 5 µ l). Misture bem, usando uma máquina de vórtice em alta velocidade para 2-5 s.</li>
		<li>Prepare uma diluição prévia do flumazenil composto de referência por pipetagem 1 µ l do composto (10 mM) para 1.970 µ l de buffer de ensaio. Misture bem, usando uma máquina de vórtice em alta velocidade para 2-5 s.</li>
		<li>Diluir uma solução stock de flumazenil [3H] com o buffer de ensaio a 4 ° C a 4 nM em um tubo de polipropileno de 50 mL.</li>
		<li>Pipete 50 µ l/poço de buffer de ensaio para as colunas 1 e 3 – 11 de uma microplaca de 96 poços, conforme representado na Figura 2o layout da placa.</li>
		<li>Pipetar 73.2 µ l dos compostos diluído a 50.76 µM (ver passo 1.1.2) na coluna 12 da placa.</li>
		<li>Diluir cada composto, usando uma progressão geométrica sobre 9 passos (1E-10 – 1E–06 M), com um volume de transferência µ l 23,12 e preenchimento de colunas 3-11. Homogeneiza a diluição. Mude a ponta após cada diluição.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diluir as membranas celulares
	<ol>
<li>Descongelar as membranas celulares anteriormente isoladas de um receptor de GABAA humana overexpressing HEK293 (0.025-0,15 mg/mL) para obter 80 mL à temperatura ambiente (RT) e transferir a suspensão para o buffer de ensaio a 4 ° C.</li>
		<li>Ressuspender a solução de membrana ainda a 4 ° C com um homogeneizador de 30 – 40 s a 10.000 – 12.000 rpm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Diluir o diazepam para o controle de ligação não-específica (NSB)
	<ol>
<li>Dilua uma solução stock de diazepam de 4mm com o buffer de ensaio a uma concentração de 40 µM em 5 mL.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Iniciar a reação
	<ol>
<li>Pipetar 50 µ l de 4 nM [3H] flumazenil para cada poço da placa de 96 poços e mantê-lo em um recipiente de água gelada.</li>
		<li>Adicione 100 µ l da preparação de membranas de subtipo de receptor GABAA ter uma concentração de proteína de 0,5 mg/mL.</li>
		<li>Pipete 50 µ l de 40 diazepam µM para coluna 2.</li>
		<li>Incube a placa por 1h no gelo.</li>
		<li>Adicionar 50 µ l de buffer de ensaio em cada poço de uma placa de 96 poços filtro para separação de membrana subsequentes e medição da radioactividade e parar a reação depois.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Parar a reação
	<ol>
<li>Prepare um tampão de lavagem com 50 mM Tris-HCl, pH 7,4.</li>
		<li>Filtre a solução usando uma colhedora de célula de 96 poços. Lavar a placa 3 x com 300 µ l de tampão de lavagem gelada por bem.</li>
		<li>Selar o fundo do prato com um filme plástico e adicionar 40 µ l de coquetel para líquido de cintilação cintilação contando em cada bem e limpe-a com etanol 70%.</li>
		<li>Agite suavemente a placa pelo menos 1 h no RT Deixe pelo menos mais uma hora no RT</li>
		<li>Medir a radioactividade (em CPM), colocando a placa em um contador de cintilação. Permita uma medição para 3 min por bem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análise de dados
	<ol>
<li>Determine que a média para o 8 repetições de ligação não-específica (NSB) e a total vinculação (TB) bem como quanto a duplicatas ou triplica das amostras. Calcule a % de ligação específica (SB) para a média de cada amostra de acordo com a seguinte equação: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq1.jpg"> Aqui, SB total = a TB significa menos a dizer NSB.</li>
		<li>Lote em abcissa o SB % versus em ordenadas as concentrações do inibidor. Ajuste os dados usando a equação de análise de concorrência de único site: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq2.jpg"> Aqui, y = o % do SB, A = o mínimo de y, B = o máximo de y, C = o IC50, X = log10 da concentração do composto concorrente, D = o declive da curva (um coeficiente de Hill).</li>
		<li>Calcular a afinidade de ligação (Ki) usando a meia concentração inibitória máxima (IC50), a constante de dissociação (Kd) de flumazenil [3H] sobre as respectivas membranas9e a concentração de [3H] flumazenil no ensaio de acordo com a seguinte equação de dados usando: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq3.jpg">
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. receptor expressão e gravações em oócitos de Xenopus
<ol><li>Ovários de colheita e preparação do oócito
	<ol>
<li>Preparar a solução estéril de Barth com 88 mM de NaCl, 1 mM KCl, 2,4 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0,82 mM MgSO4.7h2O, 0,33 mM Ca (NO3)2.4h2O e 0,41 mM CaCl2.6h2O, pH 7,4 , suplementado com 100 unidades/mL de penicilina, de 100 µ g/mL Estreptomicina e de 0,25 µ g/mL de anfotericina b.</li>
		<li>Prepare o suporte de x OR2 1 (não CaCl2) com 88,5 mM NaCl, KCl de 2,5 mM, 5 mM HEPES, 1 mM MgCl2.6h2O, pH 7,4.</li>
		<li>Sacrifício uma Xenopus Laevis fêmea por anestesia profunda por 20 min em refrigeração tricaina Metanossulfonato (em uma concentração de 150 mg/L, ajustada a pH 7,4) e bicarbonato de sódio (300 mg/L) seguido por decapitação.</li>
		<li>Colher os ovários rapidamente com uma tesoura limpa e fórceps e colocá-los em 2 pratos de Petri (10 cm) preenchido com 40 mL de 1x solução Barth e antibióticos/antimicótico.</li>
		<li>Armazenar os ovários não-dissociado por até 2 semanas em solução de Barth a 4 ° C.</li>
		<li>Para a dissociação, cortar os ovários com uma lâmina de barbear limpo em pequenas fracções (1 a 2 cm3) e incube-os em 50 mL de meio de OR2 sem CaCl2 (OR2-noCaCl2) contendo 0,2% colagenase (tipo I) 17 – 19 ° c em um girador de 100ml balão com uma agitação lenta para 4-5 h.. verificar se a Barra magnética está colocado a aproximadamente 3 a 5 cm acima do fundo do frasco para evitar o esmagamento de oócitos girador.</li>
		<li>Após 4-5 h, verificar que a maioria dos oócitos é libertada de seu folículo (ou seja, eles nadam ao redor individualmente). Lavá-los 5x com 200 mL de OR2 suplementado com 1,8 mM CaCl2.</li>
		<li>Transferi o defolliculated ovócitos para pratos de Petri (10 cm) preenchido com solução de Barth e antibióticos/antimicóticos e mantém-los pelo menos durante a noite a 17 ° C, antes da injeção do cDNA ou mRNA.</li>
		<li>No dia seguinte, selecione, no âmbito de um binóculo, um oócito saudável, apresentando uma clara e distinta animal contra um polo vegetal (marrom escuro para o polo animal contra luz amarela para o polo vegetal). Use limpas pipetas Pasteur e elimine-os oócitos um por um em um prato bem estéril de cônico 96-injeção. Nota: Nenhum cuidado especial é necessário na colocação de oócitos para as injeções de mRNA; Considerando que, para as injeções de cDNA, é indispensável para orientar os oócitos com polo animal virado para cima.</li>
	</ol></li>
	<li>injeção automática do mRNA ou do cDNA
	<ol>
<li>Sintetiza os mRNAs usando um kit disponível comercialmente, seguindo as instruções recomendadas. Limpe os instrumentos e a mesa com RNase e utilize as luvas de proteção adequadas. Nota: A qualidade do mRNA é determinante para render uma boa expressão, e é indispensável para evitar a degradação do mRNA durante o procedimento de injeção.</li>
		<li>Preparar os cDNAs usando um kit disponível comercialmente e dissolver em água bidestilada uma concentração de 0,2 µ g / µ l, a quantidade desejada.</li>
		<li>Injetar nL 10 – 50 da solução do mRNA em uma concentração de 0,2 µ g / µ l ou 10 nL de cDNA solução em concentrações que variam de 0,02-0,2 µ g / µ l, de preferência em lotes de 95 ovócitos.</li>
		<li>Para a membrana proteínas que requerem múltiplas subunidades (ou seja, receptores de GABAA heteromeric α1β2γ2), misturar os mRNAs correspondentes ou cDNAs na proporção desejada (ou seja, 1:1:1 ou 1:10:1).</li>
		<li>Manter o oócito a 17 ° C para evitar a expressão de proteínas de choque do calor por oócitos; armazene a microplaca em uma área de armazenamento thermo-controlado.</li>
		<li>Dissolver os compostos de teste que foram testados positivo no ensaio de ligação em OR2 em 0.1 – 1.000 µM para gravações eletrofisiológicas e descartá-los fora em uma placa de polipropileno de fundo chato de 96 poços.</li>
	</ol></li>
	<li>Plasmídeos de expressão
	<ol>
<li>Siga os manuais de instrução de kits comercialmente disponíveis para a síntese de mRNA com promotores T7 ou T6 bacterianas e fazer 20 µ l de uma solução a 0,2 µ g / µ l em água livre de RNase.</li>
		<li>Prepare pelo menos 20 µ l de uma solução que contém um vetor de expressão eucariota para a expressão do cDNA, normalmente em 0,2 µ g / µ l dissolvido em água bidestilada.</li>
	</ol></li>
	<li>Microinjeção no oócito e visualização da sua qualidade
	<ol>
<li>Injetar nL 10 – 50 da solução contendo o plasmídeo (ver passo 2.3.1 ou 2.3.2) usar uma agulha de micro-injeção de vidro com um diâmetro de ponta que vão até 100 µm montado em um micromanipulador equipado com um sistema de ejeção de pressão ou com um sistema automatizado de injeção. Nota: No exemplo discutido aqui, oócitos são injetados por lotes de 95 com um sistema automatizado adequado para uso com cDNA ou mRNA.</li>
		<li>Enchem a agulha de injeção de 1 µ l de um corante como o azul de metileno a 1% e injetar os oócitos usando o procedimento padrão (ou no núcleo de cDNA ou no citoplasma de mRNA).</li>
		<li>Elimine os oócitos injetados por cerca de 1 min em água fervente. Corte os oócitos ao meio com uma lâmina de barbear sob um binóculo. Nota: O corante permanece localizado, como mostrado na Figura 3E, permitindo uma observação precisa da injeção.</li>
	</ol></li>
	<li>Gravações de grampo de tensão de dois-eletrodo
	<ol>
<li>Coloque a placa bem, contendo os ovócitos no sistema automatizado, que utiliza o princípio ilustrado na Figura 4. Nota: Em contraste com o sistema de braçadeira do remendo ilustrado na Figura 5, o potencial verdadeiro da membrana da célula é lido pelo eléctrodo de tensão.</li>
		<li>O sistema de gravação automatizada usando o interface baseado em ícones com, por exemplo, o esquema ilustrado na Figura 6 para a determinação da relação atividade concentração do programa.</li>
	</ol></li>
	<li>Encaixe de curva
	<ol>
<li>Analisar os resultados usando o software apropriado, utilizando a curva de ativação de concentração ilustrado, traçar a amplitude atual em função do logaritmo da concentração de agonista.</li>
		<li>Observe a curva sigmoidal que pode posteriormente ser equipada com a equação empírica de Hill na forma: <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57842/57842eq4.jpg"> Aqui, Y= a fração da corrente evocado, CE 50 = a concentração para uma ativação de 50%, x = concentração do composto, nH = o coeficiente de Hill ou aparente cooperatividade.</li>
		<li>Normalize as correntes de uma unidade, dividindo a amplitude de cada resposta contra o valor registado na concentração mais alta para analisar os dados obtidos de uma série de células.</li>
		<li>Determinar a média e erros padrão e perceber o encaixe de curva usando software canonicamente disponível.</li>
	</ol></li>
</ol>3. eletrofisiológicas gravações em fatias de cérebro
Nota: Fatias Hippocampal do rato são preparadas em conformidade com as diretrizes nacionais e institucionais.
<ol><li>
Preparação de fatias de hipocampo
	<ol>
<li>Preparar o dissecação artificial cerebro-líquido espinhal (dACSF) com 124 mM NaCl 124, 2.5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2mm MgSO4.7h2O, 2,5 mM CaCl2 2 H2O, 26mm NaHCO3, glicose de 10 mM e 4 mM sacarose, câmara de gás na garrafa com uma mistura de 95% O2 e 5% de CO2.</li>
		<li>Preparar o gravação artificial cerebro-líquido espinhal (rACSF) com 124 mM NaCl, 5 mM KCl, 1,25 mM KH2PO4, 2mm MgSO4.7h2O, 2,5 mM CaCl2 2 H2O, 25mm NaHCO3e glicose 10 mM Câmara de gás na garrafa com uma mistura de 95% O2 e 5% de CO2.</li>
		<li>Anestesiar os ratos usando uma mistura de 2,5% de isoflurano e oxigênio puro e decapitá-los.</li>
		<li>Corte o couro cabeludo seguindo a linha mediana com um belo par de tesouras. Corte o crânio ao longo da linha mediana, sem danificar o tecido subjacente. Remover o crânio com uma pinça e use uma espátula bem para colher o cérebro.</li>
		<li>Coloque o cérebro na solução dACSF gaseados em RT e dissecar a formação hipocampo esquerda com uma espátula fina.</li>
		<li>Cortar fatias transversais (400 µm de espessura) da parte média do hipocampo com um helicóptero de tecido e transferi-los para a câmara de gravação com o uso de um pincel de pintura. Manter as fatias no RT por 45 min.</li>
		<li>Perfundir as fatias com o rACSF prontinha a 35 ° C e a uma taxa de 1,5 mL/min. bolha a solução com uma mistura de 95% O2 e 5% de CO2. Nota: Após esta etapa, as fatias estão prontas para os experimentos eletrofisiológicos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gravação de pico de população
	<ol>
<li>Coloque uma fatia do cérebro para a câmara de microscópio-montado.</li>
		<li>Perfundir a fatia a uma taxa de 3 mL/min com rACSF.</li>
		<li>Puxe uma micropipeta de vidro borosilicato com o extrator de pipeta tendo uma resistência de ~ 2 MΩ. Nota: Esta micropipeta é usada como um elétrodo de gravação e é eletricamente ligada ao amplificador.</li>
		<li>Encha a micropipeta com uma solução contendo 2 M NaCl e coloque-o no suporte da pipeta do amplificador.</li>
		<li>Posição a micropipeta de gravação no estrato pyramidale na região CA1 da fatia hippocampal usando o micromanipulador certo. Nota: A localização é representada esquematicamente na Figura 7.</li>
		<li>Coloque um eletrodo bipolar isolado de platina/irídio no suporte da esquerda micromanipulador. Nota: Este eletrodo é usado como o eletrodo de estimulação e é eletricamente conectado ao gerador de estímulo.</li>
		<li>Posição do eletrodo de estimulação nas colaterais de Schaffer na região CA1 da fatia hippocampal usando o micromanipulador certo. Nota: A localização é representada esquematicamente na Figura 7.</li>
		<li>Entregar um pulso atual para o eletrodo de estimulação, usando o gerador de estímulo a cada 30 s (100 µs durações, começando em 10 µA) e aumentar gradualmente a força de estimulação até que apareça um pico de população (PS).</li>
		<li>Ajuste a força de estímulo para evocar um PS correspondente a 45% da amplitude máxima que pode ser obtido. PSs são filtrados de 2,4 KHz e digitalizados em 20 KHz usando o amplificador de sinal.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Inibição de pulso emparelhado
	<ol>
<li>Prepare as fatias de cérebro (passo 3.1) e prossiga conforme descrito anteriormente (passos 3.2.1–3.2.7).</li>
		<li>Entregar dois pulsos de corrente (100 µs durações em um intervalo de 20 ms) para o eletrodo de estimulação cada 30 s usando o gerador de estímulo. Defina a força de estímulo para evocar um PS correspondente a 45% da amplitude máxima.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Composto de teste
	<ol>
<li>Fazer diluições dos compostos a ser testado em ACSF prontinha para que a concentração final de DMSO não superior a 0,1%.</li>
		<li>Adicione DMSO para a solução de controle na mesma concentração do que na solução de composto.</li>
		<li>Gravar um single (passo 3.2) ou um PS emparelhado-pulso (passo 3.3) evocada por estímulos colaterais de Schaffer cada 30 s pelo menos 30 min. A forma de PS deve ser estável durante este período de base.</li>
		<li>Prepare um copo com gaseadas rACSF contendo uma concentração fixa do composto a ser testado.</li>
		<li>Perfundir a fatia hippocampal com esta solução enquanto ainda gravava PS único ou emparelhado-pulso.</li>
		<li>Avalie a recuperação do efeito composto por perfusing a fatia com gaseadas rACSF sem o composto. Nota: Para efeitos reversíveis, o PS reverte à sua forma inicial observada durante o período de base antes da aplicação do composto.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Análise de dados
	<ol>
<li>Média os PS vestígios gravados durante o experimento em blocos de 4 usando o software de análise de dados.</li>
		<li>Medir as amplitudes de PS dos traços em média.</li>
		<li>Normalize as amplitudes em percentagem dos valores de base gravada 10 min antes de perfusing um composto.</li>
		<li>Expressar os dados como média ± SEM.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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</ol>

Os autores Frédéric Knoflach e Maria-Clemencia Hernandez são empregados da F. Hoffmann-La Roche AG, 4070 Basel, na Suíça, uma empresa farmacêutica. O autor Daniel Bertrand é um empregado da HiQScreen Sàrl 6, rte de Compois, 1222 Vésenaz Genebra, Suíça, fornecimento de instalações de triagem às empresas farmacêuticas.

O desenvolvimento de novos compostos ativos em um canal de ligante iônicos como os receptores GABAA requer o uso de múltiplas abordagens. Normalmente, o primeiro passo é muitas vezes realizado utilizando ensaios obrigatórios; no entanto, tais medidas são insuficientes para caracterizar a atividade fisiológica de composto ou sua farmacologia precisa. Em particular, um composto que se liga a um receptor pode melhorar ou inibir sua função ou mesmo não produzir nenhum efeito funcional (ficar em silêncio) (ou seja, ligar o receptor sem modificar sua função). Assim, um teste funcional é necessário para uma caracterização completa composta.
Ensaios de vinculação: A principal vantagem do ensaio de ligação é que pode ser conduzida eficientemente em um grande número de amostras que variam até vários milhares, e que fornece afinidades de ligação para as moléculas ativas. Conforme descrito neste documento, o primeiro passo consiste em estabelecer um método para a avaliação dos subtipos de receptor desejado. Ou seja, enquanto a ligação pode ser conduzida nos receptores nativos de frações ou cérebro inteiro, tal método impedirá a determinação das afinidades em subtipos de receptores específicos. É, portanto, necessário usar sistemas de recombinação de moléculas de tela para o alvo desejado. Hoje em dia, um transfection transitória ou estável de cDNAs de subunidade do receptor desejado em linhas celulares oferece um método eficiente e confiável para expressar os subtipos de receptores de interesse (por exemplo, GABAA α5β3γ2). Ligação tradicional ensaios fazem usar de radioligands, mas hoje em dia as técnicas estão disponíveis que evitar a inconveniência de manipulação de radioatividade (por exemplo, ligação de ligante quantitativa baseada em fluorescência).
Expressão funcional em um sistema host: Para expressar genes em um sistema host, a sequência de codificação de interesse deve ser inserida em um plasmídeo que contém os promotores adequadas. Normalmente, para a síntese de mRNA em vitro , os promotores T7 ou T6 bacterianas são usados. Para uma expressão do cDNA, a transcrição do gene de interesse deve ser regulada por um promotor eucariota como CMV (Citomegalovírus) ou equivalente. Hoje em dia, vários plasmídeos, incluindo os dois promotores (i.e., pUNIV, pCMV-6AC, psf-CMV/T7, pCI-neo, pcDNA), estão disponíveis, permitindo uma síntese em vitro de mRNA ou uma expressão do cDNA, conforme mostrado na Figura 15. Uma expressão dos receptores de GABAA pode ser obtida fielmente em linhas celulares ou em oócitos de Xenopus . As vantagens principais deste último são a falta de uma expressão do receptor endógeno, a simplicidade de manipulações e a disponibilidade de um sistema automatizado para microinjeções e gravações. Os procedimentos descritos no presente protocolo ilustram a eficiência do sistema automatizado que permite a injeção de 96 oócitos em cerca de 7 min e não requer nenhuma habilidade de micromanipulação. Lembrando que um único ovário de uma Xenopus contém entre 10.000 – 30.000 ovócitos, é claro que um grande número de medições de célula pode ser realizado em uma única preparação. Além disso, como uma expressão pode ser realizada usando injeções de cDNA, o mesmo plasmídeo contendo os genes de interesse que são desenvolvidos para os experimentos de ligação pode ser usado para uma caracterização funcional sem a necessidade de mais biologia molecular manipulações.
Devido a seu grande tamanho e alta expressão de superfície, um único oócito produz um número de receptores que é aproximadamente equivalente as confluentes em uma placa de Petri de 35mm. No entanto, uma preparação de oócitos e injeção representa uma fração do custo de uma linha de celular, como os experimentos não necessitam de um meio de cultura específico e manipulações estéreis. A ativação de um único canal de GABAA produz alguns picoamperes (10-12) e correntes que variam até dezenas de microampere (10-6) registam-se facilmente em um único ovócito, que confirma a atividade concomitante de vários milhões de receptores durante uma única resposta.
Um primeiro passo para a caracterização de canais iônicos ligante é, muitas vezes, a determinação da afinidade dos receptores de aparente. As experiências que devem ser realizados consistem em aplicar uma série de pulsos de teste breve agonista e plotagem a amplitude do evocado atual ou, em certos casos, a área sob a curva (AUC) em função do logaritmo da concentração de agonista. Como é facilmente viável para microinjeção concentrações diferentes do plasmídeo e relação do mesmo lote de oócitos, este sistema de expressão é particularmente apropriado para tal uma caracterização. Além disso, uma comparação de lotes revelou um elevado grau de estabilidade para diferentes CE50s. A influência da composição na aparente afinidade do receptor, a subunidade é facilmente visualizada usando uma trama de aranha, como exemplificado na Figura 10.
Os resultados da mordaça dois-eletrodo tensão obtidos em oócitos de Xenopus são frequentemente comparados com gravações feitas usando eletrodos de braçadeira do remendo. Considerando que iria além do escopo deste trabalho entrar uma comparação detalhada entre esses dois sistemas, alguns pontos podem ser examinados. Enquanto uma braçadeira do remendo nas células oferece vantagens para uma caracterização biofísica com uma aplicação rápida da droga, seus requisitos são mais complexos do que as das gravações em oócitos de Xenopus dois-eletrodo. Uma dificuldade não negligenciável e primeira é a expressão de uma proteína dada com a necessidade de uma cultura de células, um transeunte ou transfection estável e a identificação das células que expressam a construção desejada. Além disso, é indispensável examinar a possível contribuição da expressão na célula considerada endógeno. Além disso, uma gravação de braçadeira do remendo exige uma pessoa qualificada realizar a micromanipulação sob um microscópio de alta ampliação, enquanto que a pessoa também precisa realizar uma análise adequada durante o experimento para avaliar, por exemplo, a qualidade do selo, a resistência de acesso etc , em contraste, um grampo de tensão de dois-eletrodo gravação, especialmente um usando um sistema automatizado eletrofisiológico, não requer nenhumas habilidades específicas e pode ser conduzida por técnicos de laboratório.
Ao adquirir um set-up eletrofisiológico, consideração de custo é certamente um fator importante que precisa ser analisado cuidadosamente. Por exemplo, enquanto o custo de um sistema automatizado é relativamente alto, uma comparação mais atento revela que a instalação de um equipamento completo de eletrofisiológico inclui a compra de equipamentos, tais como boas Micromanipuladores, uma lente binocular, um amplificador, uma perfusão sistema e uma tabela de antivibração, enquanto também a aquisição de dados e realizar uma análise. Uma comparação de custo entre uma tensão de dois elétrodos braçadeira set-up contra uma afinação de braçadeira do remendo revela discrepâncias ainda mais. Além disso, o sistema automatizado oferece a vantagem de equipamento totalmente automatizado e executado sem vigilância dia e noite.
As propriedades farmacológicas de um composto são determinadas pelo seu modo de ação no receptor. Por exemplo, inibidores do competidor são moléculas que podem entrar na mesma ligação de bolso, ou orthosteric local, como o agonista em si provoca uma competição. Inibidores não-competitivos são compostos que inibem os receptores interagindo em outro site e, no caso de um canal iônicos ligante, que podem entrar e bloquear o poro iônico, por exemplo. Vai além do escopo deste trabalho para examinar os diferentes mecanismos de interação, mas mais informações podem ser obtidas de um livro farmacológico e/ou de outros trabalhos como Bertrand e de Bertrand22.
No caso de moduladores alostéricos, o composto liga em um site que é distinto do site orthosteric, mas a presença da molécula modifica a barreira de energia entre os Estados ativos e outros. Moduladores alostéricos positivos (PAMs) são compostos que reduzem a barreira de energia da descansar para o estado ativo e, portanto, aumentar o efeito do agonista. Para caracterizar possíveis efeitos do PAM, é, portanto, necessário determinar se um risco sobre o composto melhora a resposta para o agonista e, em caso afirmativo, em qual concentração. Os experimentos apresentados na Figura 11 e Figura 14 ilustram os protocolos que podem ser usados com sucesso para a caracterização dos PAMs nos receptores GABAA .
Em alguns casos, a exposição para o PAM sozinho pode ser suficiente para ativar os receptores. Tal atividade pode ser determinada por uma ligeira modificação do protocolo experimental apresentado aqui. Ou seja, em vez de usar um aplicativo co do modulador durante a exposição para o GABA, o protocolo pode ser modificado para a aplicação do primeiro o composto sozinho e, em seguida, na presença do GABA. Uma caracterização da atividade agonista direta será feita pela determinação da amplitude da resposta evocada pelo composto em si e em comparação com a corrente de GABA-evocada.
Experimentos conduzidos em fatias do cérebro, tal como ilustrado na Figura 7, são usados para confirmar a atividade composta em receptores nativos em um circuito inibitório definitivo antes de prosseguir em modelos animais e ao longo da via para ensaios clínicos. O protocolo de gravação e análise de dados relativamente simples permite que o ranking de vários compostos, avaliando seu efeito diferencial moduladora na amplitude do PS. Efeitos não-específicos de compostos que não estão relacionados com o sistema GABA podem também ser detectado (por exemplo, quando são observadas alterações na forma PS). Direto, a neurotransmissão gabaérgica pode ser avaliada nestes casos medindo os efeitos dos compostos em correntes pós-sináptico inibitórios (IPSCs) usando a braçadeira de remendo de células inteiras técnica8.

Aqui, apresentamos os protocolos para a descoberta de compostos ativos nos receptores GABAA , partir de ligação para a fisiologia e farmacologia. Na busca de novas moléculas específicas para receptores GABAA , é crucial para definir, tão precisamente quanto possível, o subtipo de interesse e a avaliação da especificidade dos compostos identificados recentemente (por exemplo, para uma revisão, ver Rudolph e Knoflach1ou Sieghart2). Um caminho típico na descoberta da droga e as etapas que precisam ser alcançados são ilustrados na Figura 1.
Ensaios obrigatórios foram e são ainda largamente utilizados como o primeiro passo na descoberta da droga. No caso de receptores GABAA , eles são otimizados para identificar compostos que ligam para o sítio de ligação de benzodiazepínicos do receptor onde vincular drogas terapeuticamente útil e seguras. Outras técnicas, usando fluorométrica de imagem placa leitor (FLIPR) membrana potencial ensaios baseados em corante vermelho3, detectam compostos como barbitúricos que ligam para sites adicionais que são menos desejáveis, devido ao seu perfil de efeitos colaterais indesejado. Além disso, os corantes utilizados diretamente podem ativar receptores GABAA , assim, questionar a utilidade destes ensaios para descoberta de drogas4. Ensaios de ligação só pode fornecer a evidência de que um determinado composto pode vincular a uma classe de receptores específicos. In vitro ensaios com as membranas celulares são usados para identificar ligandos seletivos de receptores α5β3γ2 GABAA humana. Transitoriamente transfectadas células HEK293, expressando a humana GABAA α5β3γ2, α1β3γ2, α2β3γ2 e α3β3γ2 receptores são utilizadas para preparar as membranas para estes ensaios. O efeito dos ligantes é detectado pela medição da cintilação de flumazenil [3H] vinculado aos receptores de membrana (uma inibição da ligação de flumazenil [3H]). A principal vantagem desta técnica é que uma determinação rápida e eficiente da afinidade de ligação de composto no receptor de interesse é fornecida no receptor de interesse.
Estudos funcionais são essenciais para avaliar a atividade funcional dos compostos e de propor uma explicação fisiológica e farmacológica dos mecanismos causada pela ligação dos compostos para os receptores. Hoje, é bem reconhecido que os receptores GABAA funcional resultam a montagem de cinco subunidades em torno de um eixo de pseudosymmetry formado pelo poro iônico e resultado do conjunto de cinco subunidades idênticas. A maioria dos receptores de GABAA é compostos por dois ou mais diferentes subunidades. O receptor do grande cérebro GABAA , por exemplo, é composto das subunidades α1, β2 e γ2 em uma estequiometria de 2, 2 e 1 respectivamente5,6. Uma reconstituição em um sistema de host como o oócitos de Xenopus ou células HEK293 oferece a possibilidade de explorar rapidamente as propriedades farmacológicas de receptores.
As propriedades farmacológicas dos compostos são então exploradas com gravações extracelulares no cérebro fatias7. Este método permite uma exploração do efeito dos compostos na neurotransmissão e fornece uma maneira eficaz para confirmar os efeitos funcionais dos compostos determinados em sistemas de expressão heteróloga a nível dos receptores nativos em geral ambiente neuronal. Neurotransmissão gabaérgica também pode ser avaliado a nível molecular, medindo-se os efeitos dos compostos em correntes pós-sináptico inibitório (IPSCs)8. Mas o protocolo usado aqui e baseadas em gravações de braçadeira do remendo de células inteiras em fatias do cérebro é mais elaborado e produz uma baixa taxa de transferência.
Finalmente, as forças e fraquezas do em vitro triagem cascata usada para a identificação de α5β3γ2-seletivo ligantes são discutidas na perspectiva das diferentes técnicas e suas limitações intrínsecas. Este trabalho deve fornecer especialistas e não-especialistas no campo dos receptores GABAA uma avaliação útil da combinação de abordagens diferentes em vitro utilizada para enfrentar a descoberta de novos moduladores destes canais iônicos ligante.

<table><tbody><tr><td><forte>Equipamento geral</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 colhetor de células de poço -(Filtermate 196)&nbsp;</td><td>Packard</td><td></td><td>Para filtrar membranas com radioligante ligado</td></tr><tr><td>Contador de cintilação líquida de placa de microtitulação (Top Count NXT)</td><td>Contador de cintilação e luminescência de microplacas</td> <td>Packard</td><td></td></tr><tr><td>Contador de cintilação líquida de frasco (Beta-Couter 2500 TR)</td>Contador de <td>cintilação e luminescência de frasco</td> <td>Packard</td><td></td></tr><tr><td>Manipulador de líquido (Biomek 2000)</td><td>Relha Beckman</td><td></td><td>Para preparar diluições compostas</td></tr><tr><td>Vortex (Vortex Genie 2)</td><td>Scientific industries Inc.</td><td></td><td>Para misturar soluções de estoque compostas</td></tr><tr><td>Homogeneizador de tecidos (Polytron PT1200E)</td><td>Kinematica AG</td><td></td><td>Para ressuspender as preparações de membranas</td></tr><tr><td>Software XLfit5</td><td>Microsoft Excel &nbsp; add-on da IDBS</td><td></td><td>Software de adaptação de curvas</td></tr><tr><td>Smart Pull</td><td>UniPix-Extrator</td><td></td> <td>de eléctrodos</td></tr><tr><td>RoboInject</td><td>Sistemas multicanal-Injeção</td><td></td> <td>automatizada (ovócitos de Xenopus)</td></tr><tr><td>Sistemas multicanal</td><td></td> <td>HiClamp-Pinça</td> <td>de tensão automatizada (Xenopus Ooócitos)</td></tr><tr><td>Sistemas</td><td>multicanal-Dados</td> de mineração <td>de</td> <td>dados Software de Análise</td></tr><tr><td>DataMerger</td><td>MultiChannel</td> <td>Systems-Data</td> <td>Processing Software</td></tr><tr><td>Digidata 1550</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Sistema de aquisição de dados de baixo ruído</td></tr><tr><td>CyberAmp 380 ou equivalente</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td>Programmable Signal Conditioner</td></tr><tr><td>pClamp program suite</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Software para aquisição e análise de dados software</td></tr><tr><td>Mesa antivibrat&nbsp;</td><td>TMC</td><td></td><td>Para evitar vibrações de microeletrodos&nbsp;</td></tr><tr><td>Micromanipuladores Patchstar</td><td>Scientifica</td><td></td><td>Para posicionar com precisão microeletrodos em fatias cerebrais</td></tr><tr><td>Gaiola de Faraday&nbsp;</td><td>Sutter Instruments</td><td></td><td>Para isolar gravações de ruído</td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>Campden Instruments LTD&nbsp;</td><td></td><td>Para preparar fatias de cérebro</td></tr><tr><td>Micropipeta de vidro borossilicato&nbsp;</td><td>Warner Instruments</td><td>GC150TF-10</td><td>Para registrar potenciais extracelulares em fatias cerebrais</td></tr><tr><td>Par trançado, fio de irídio de platina eletrodo de estimulação</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td>Para estimular as fatias cerebrais com corrente</td></tr><tr><td>Gerador de estímulo para estimulação acionada por corrente e tensão</td> Sistemas <td>MultiCanal</td><td>STG4000</td><td>Fornece a corrente para o eletrodo de estimulação</td></tr><tr><td>Plasticware</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtiter placa fundo redondo</td><td>Corning</td><td>#3365</td><td>Usado para o ensaio de ligação</td></tr><tr><td>GF/C filtro de fibra de vidro 96 poços microplaca com 1,2 &micro; m poresize, para ensaios de colheita de células usando um filtro de poço coletor de vácuo&nbsp;</td><td>Packard&nbsp;</td><td>#6005174</td><td>usado para o ensaio</td></tr><tr><td>de ligação Tubos de 50 mL</td><td>Falcon&nbsp;</td><td>#352070</td><td>usado para o ensaio de ligação</td></tr><tr><td>Tubos de trava segura 1,5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120086</td><td>usado para o ensaio de ligação</td></tr><tr><td>Tubos de trava segura 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>#0030 120094</td><td>usado para o ensaio de ligação</td></tr><tr><td>Tubos de envio 180 mL&nbsp;</td><td>Semadeni Europe AG&nbsp;</td><td>#3722</td><td>usado para o ensaio de ligação</td></tr><tr><td>Pony vial Polietileno 6 mL&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>#6013329</td><td>usado para o ensaio de encadernação</td></tr><tr><td>Selo superior&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>#60051859</td><td>usado para o ensaio de encadernação</td></tr><tr><td>Spinner Flask</td><td>Bellco</td><td>BELLCO # 1965-00100</td><td>Spinner Flask</td></tr><tr><td>96&nbsp; Placa de Poço (Cônica)</td><td>Thermo Scientific Milian</td><td>56368</td><td>Placa de injeção para os oócitos</td></tr><tr><td>96&nbsp; Placa de Poço (Fundo Plano)</td><td>Corning (Vitaris Suíça)</td><td>3364-cor</td><td>Placa Composta para o Capilar de Vidro HiClamp</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Hilgenberg (Alemanha)</td><td>-</td><td>vidro borossilicato 1,2 O.D. 0,76 I.D. com filamento</td></tr><tr><td><forte>preparação de RNA</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ambion mMessage mMachine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>para a síntese in vitro</td></tr><tr><td>Produtos químicos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tampão de ensaio: KCl 5 mM; CaCl2 1,25 mM; MgCl2 1,25 mM; NaCl 120 mM; Tris 15 mM ajuste de pH com HCl para 7,4; armazenar até 3 meses a 4 °C.</td><td></td><td></td><td>Usado para ensaio de ligação</td></tr><tr><td>Tampão de lavagem: Tris 50 mM -HCl pH 7,4; armazenar a 4 °C.</td><td></td><td></td><td>Usado para ensaio</td></tr><tr><td>de ligação Solução de estoque de compostos de teste 10 mM em DMSO</td><td></td><td></td><td>Usado para ensaio de ligação</td></tr><tr><td>Flumazenil (RO0151788) 10 mM em DMSO</td><td></td><td></td><td>Usado para ensaio de ligação</td></tr><tr><td>Diazepam 4 mM em DMSO</td><td></td><td></td><td>Usado para ensaio de ligação</td></tr> <tr><td>[3H] -Flumazenil 60-85 Ci / mmol em etanol; armazenar a -20 &deg; C</td><td></td><td></td><td>Usado para ensaio de ligação</td></tr><tr><td>Microscint 40&nbsp;</td><td>Packard&nbsp;</td><td>#6013641</td><td>Usado para ensaio de encadernação</td></tr><tr><td>Ultima Gold&nbsp;</td><td>Perkin Elmer&nbsp;</td><td>#6013329</td><td>Usado para ensaio de ligação</td></tr><tr><td>MS-222</td><td>Sigma</td><td>Sigma # A5040</td><td>MS-222</td></tr><tr><td>AB/AM</td><td>Sigma</td><td>Sigma # A5955</td><td>antibióticos / antimicóticos</td></tr><tr><td>Collagenase</td><td>Sigma</td><td>Sigma # C1030</td><td>Collagenase Tipo I</td></tr><tr><td>Rnase</td><td>Sigma</td><td>Sigma # R2020-250 mL</td><td>RNaseZAP</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>Qiagen # 12362</td><td></td></tr><tr><td>Sais para líquido cefalorraquidiano artificial (NaCl, KCl, etc.)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Membranas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Preparações de membranas congeladas de HEK293 transfectado transitório ou estável superexpressando diferentes subtipos de receptores GABAA humanos: &alfa; 1&beta; 3&gama; 2, &alfa; 2&beta; 3&gama; 2, &alfa; 3&beta; 3&gama; 2, &alfa; 5&beta; 3&gama;2. Ver Ballard et al. 2009 para métodos detalhados.</td><td></td><td></td><td>Usado para ensaio de ligação</td></tr></tbody></table>

métodos para a descoberta de novos compostos modulando um receptor do ácido gama - aminobutírico tipo uma neurotransmissão

Methods for the Discovery of Novel Compounds Modulating a Gamma-Aminobutyric Acid Receptor Type A Neurotransmission

Este apresenta manuscrito um protocolo passo a passo para a seleção de compostos no gama-aminobutírico ácido tipo um receptores (GABAA) e sua utilização para a identificação de novas moléculas ativas em ensaios pré-clínicos de um recombinante em vitro receptor a seus efeitos farmacológicos em receptores nativos em fatias de cérebro de roedor. Para compostos de ligação no local do receptor benzodiazepínico, o primeiro passo é configurar uma tela primária que consiste em desenvolver ensaios obrigatórios de radioligantes em membranas celulares, expressando os principais subtipos de GABAA . Em seguida, aproveitando-se da expressão heteróloga de receptores de GABAA roedores e humanos em oócitos de Xenopus ou células HEK 293, é possível explorar, em ensaios eletrofisiológicos, as propriedades fisiológicas do receptor diferente os subtipos e as propriedades farmacológicas dos compostos identificados. O sistema de oócitos de Xenopus será apresentado aqui, começando com o isolamento dos oócitos e seu microinjection com diferentes mRNAs, até a caracterização farmacológica utilizando tensão de eletrodo de dois grampos. Finalmente, as gravações realizadas em fatias de cérebro de roedor serão descritas que são usados como um teste secundário fisiológico para avaliar a atividade das moléculas em seus receptores nativos em um circuito neuronal bem definido. Extracelulares gravações usando respostas da população de neurônios múltiplos são demonstradas juntamente com a aplicação da droga.

Aqui, apresentamos os protocolos para descobrir compostos ativos nos receptores GABAA , partir de ligação para a fisiologia e farmacologia.

Métodos para a descoberta de novos compostos modulando um Receptor do ácido gama - aminobutírico tipo uma neurotransmissão

This manuscript presents a step-by-step protocol for screening compounds at gamma-aminobutyric acid type A (GABAA) receptors and its use towards the ...

O objetivo geral deste vídeo é ilustrar uma cascata de triagem que permite a descoberta de novos ligantes do receptor GABA-A. A vantagem de usar a ligação de radioligantes, o registro eletrofisiológico em oócitos de xenopus e em fatias de cérebro de roedores de maneira literal é que o perfil do composto pode ser melhorado. Por fim, são identificados compostos potentes, subtipos, seletivos e eficazes.Esta demonstração será realizada por Kumico Kambara e Jenna Tognaccini, bem como Sonia e Daniel Bertrand da HiQScreen e Marie Claire Pflimlin da Roche. Injetar 10 a 50 nanolitros da solução contendo plasmídeo usando uma agulha de microinjeção de vidro com diâmetro de ponta variando até 100 micrômetros montada em um micromanipulador equipado com um sistema de ejeção de pressão ou com um sistema de injeção automatizado. Para iniciar este procedimento, mantenha os oócitos a 17 graus Celsius para evitar a expressão de proteínas de choque térmico.Armazene a microplaca em uma área de armazenamento termicamente controlada. Em seguida, dissolva os compostos de teste, que foram testados positivos no ensaio de ligação em OR2, a 0,1 e 1000 micromolares para registros eletrofisiológicos e descarte-os em uma placa de polipropileno de fundo plano de 96 poços. Para realizar o registro do grampo de tensão de dois eletrodos, coloque uma placa contendo os oócitos no sistema automatizado.Programe o sistema de registo automatizado utilizando a interface baseada em ícones com este esquema para a determinação adequada da relação concentração-actividade. Para o ajuste da curva, usando a curva de ativação de concentração ilustrada, plote a amplitude da corrente em função do logaritmo da concentração do agonista. Para registro eletrofisiológico, mantenha o cérebro em solução dACSF borbulhada com carbogênio à temperatura ambiente.Em seguida, disseque a formação hipocampal esquerda com uma espátula fina. Posteriormente, corte slides transversais de 400 micrômetros de espessura da parte mediana do hipocampo com um picador de tecido. Com um pincel, transfira as fatias para a câmara de gravação e mantenha-as à temperatura ambiente durante 45 minutos.Em seguida, perfunda as fatias com rACSF borbulhado com carbógeno a 35 graus Celsius e a uma taxa de 1,5 mililitros por minuto. Para registrar um único pico populacional, coloque uma fatia de cérebro na câmara montada no microscópio. Perfunda a fatia com rACSF a uma taxa de três mililitros por minuto.Usando o extrator de pipeta, puxe uma micropipeta de vidro borossilicato com uma resistência de cerca de dois megaohms. Encha a micropipeta com uma solução contendo dois molares de cloreto de sódio e coloque-a no porta-pipetas. Posicione a micropipeta de registro no estrato piramidal na região CA1 do corte do hipocampo usando o micromanipulador direito.Em seguida, coloque um eletrodo de irídio de platina bipolar isolado no suporte do micromanipulador esquerdo. Posicione o eletrodo de estimulação nas colaterais de Schaffer na região CA1 do corte hipocampal usando o micromanipulador esquerdo. Usando o gerador de estímulo, forneça um pulso de corrente ao eletrodo de estimulação a cada 30 segundos e aumente gradualmente a força de estimulação até que um pico populacional apareça.Ajuste a força do estímulo para evocar um pico populacional correspondente a 45% da amplitude máxima que pode ser obtida. Para realizar a inibição de pulso emparelhado, forneça dois pulsos de corrente ao eletrodo de estimulação a cada 30 segundos usando o gerador de estímulo. Defina a força do estímulo para evocar um pico populacional correspondente a 45% da amplitude máxima.Para testar os compostos, faça diluições dos compostos a serem testados em ACSF de modo que a concentração final de DMSO não seja superior a 0,1%Adicione DMSO à solução de controle na mesma concentração da solução composta. Registre um pico populacional de pulso único ou emparelhado evocado por estímulos colaterais de Schaffer a cada 30 segundos por pelo menos 30 minutos. A forma do pico populacional deve ser estável durante este período de linha de base.Em seguida, prepare um béquer com rACSF carbogenado contendo uma concentração fixa do composto a ser testado e perfunda a fatia do hipocampo com a solução durante o registro de picos populacionais de pulso único ou emparelhado. Além disso, avalie a recuperação do efeito composto perfundindo a fatia com rACSF carbogenado sem o composto. Aqui é mostrada uma representação esquemática de uma fatia do hipocampo de rato, as colaterais de Schaffer originárias dos axônios das células piramidais CA3 projetando-se na arborização dendrítica dos neurônios piramidais CA1.Micropipetas foram colocadas no estrato piramidal para registrar picos populacionais e no estrato radiado para registros dendríticos de potenciais pós-sinápticos excitatórios de campo. O eletrodo de estimulação foi colocado dentro das colaterais de Schaffer. Esta figura mostra picos populacionais evocados pelos estímulos emparelhados aplicados através do mesmo eletrodo estimulante em um intervalo de 20 milissegundos.A resposta da população ao segundo estímulo é de menor amplitude do que a resposta ao primeiro estímulo. Picos populacionais foram registrados na ausência e presença de beta CCM, um receptor GABA A não seletivo NAM. O CCM beta aumentou a amplitude do segundo pico populacional, bloqueando parcialmente qualquer inibição gabaérgica feed-forward.Após este procedimento, outros métodos como farmacocinética, ocupação e eficácia do receptor in vivo e farmacologia de segurança podem ser realizados para responder a questões adicionais, como potencial para o desenvolvimento clínico dos compostos identificados.

methods-for-discovery-novel-compounds-modulating-gamma-aminobutyric

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

Neste trabalho, nós descrevemos um método útil para o estudo ligante fechado função de canal iônico em neurônios de fatias de cérebro de forma aguda isolados. Este método envolve a utilização de uma micropipeta cheia de medicamento para aplicação local de medicamentos para os neurónios gravados utilizando técnicas padrão de fixação de patch.

Aplicação local de Drogas para estudar a função do receptor nicotínico de acetilcolina no cérebro do rato Fatias

Aqui demonstramos a utilização do corante fluorescente Alexa acoplado a α-bungarotoxina para medir GABA A localização do receptor de superfície e endocitose em neurónios do hipocampo. Através da utilização de construções que ostentam uma marca curta extracelular que se liga α-bungarotoxina, análise de proteína da membrana plasmática do tráfico endocítica pode ser alcançado.

Usando um α-Bungarotoxina Binding Tag Site para Estudar GABA um receptor de membrana Localização e Tráfico

Os mecanismos moleculares que coordenam a formação de sinapses inibitórias GABAergic durante a ontogenia são em grande parte desconhecidos. Para estudar estes processos, temos desenvolvido um sistema modelo de co-cultura que incorpora embrionárias neurónios GABAérgicos espinhoso meio de cultura em conjunto com o rim embrionário humano 293 (HEK293) transfectadas estavelmente células que expressam receptores GABA A funcionais.

Formação Sinapse Inibitória em uma co-cultura-tipo que comportem GABAérgicos espinhosos médios neurônios e células HEK293 expressando estavelmente GABA A Receptores

O objetivo do presente protocolo é facilitar o estudo dos receptores de NMDA (NMDAR) em uma escala maior e permitir a análise dos efeitos moduladora de pequenas moléculas e suas aplicações terapêuticas.

Um ensaio de cálcio de alta produtividade-flux para estudar os receptores NMDA com sensibilidade de glicina/D-serina e glutamato

O método de autoradiografia é rotineiramente usado para estudar a ligação de radioligands para cortes de tecido para determinação da farmacologia qualitativa ou quantitativa.

Autoradiografia como um método simples e poderoso para visualização e caracterização de alvos farmacológicos

As interações de GPCR-β-prendedor são um campo emergente na descoberta da droga de GPCR. Métodos precisos, precisos e fáceis de configurar são necessários para monitorar tais interações em sistemas vivos. Nós mostramos um ensaio estrutural da complementação para monitorar interações de GPCR-β-prendedor em pilhas vivas do tempo real, e pode ser estendido a todo o GPCR.

Monitorando GPCR-β-arrestin1/2 interações em tempo real sistemas vivos para acelerar a descoberta de drogas

Este método introduz uma técnica simples para a detecção de liberação endógena de monoamina usando fatias cerebrais agudas. A configuração usa uma placa de 48 poços contendo um suporte de tecido para liberação de monoamina. A monoamina liberada é analisada pelo HPLC juntamente com a detecção eletroquímica. Além disso, esta técnica fornece um método de triagem para a descoberta de drogas.

Um ensaio baseado em placas para a medição da liberação de monoamina endógena em fatias cerebrais agudas

O protocolo descreve a preparação de colunas de cromatografia de afinidade de membrana celular (CMAC) com fragmentos de membrana celular imobilizada contendo proteínas funcionais do receptor B transmembrano. Também é explicado o uso de colunas CMAC na identificação de metabólitos de plantas especializadas interagindo com esses receptores e presentes em complexas misturas naturais.

Colunas de cromatografia de afinidade de membrana celular para identificar metabólitos de plantas especializadas interagindo com tropomyosina quinase imobilizada receptor B

O protocolo demonstra que, realizando microtransplante de membranas sinápticas em oócitos Xenopus laevis , é possível registrar respostas consistentes e confiáveis de receptores de ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazolepropônico e receptores de ácido γ-aminobutírico.

Microtransplantação de Membranas Sinápticas para Reativar Receptores Sínpticos Humanos para Estudos Funcionais

O ensaio químico de reticulação BS3 revela expressão reduzida do receptor GABAA na superfície celular em cérebros de camundongos sob condições de estresse psicossocial crônico.

BS3 Chemical Crosslinking Assay: Avaliando o Efeito do Estresse Crônico na Apresentação do Receptor GABAA na Superfície Celular no Cérebro de Roedores

Aqui, descrevemos um sistema de levedura reconstituindo a γ-secretase humana. Este sistema permite a identificação e o estudo de mutações que afetam a atividade e a triagem de inibidores da γ-secretase (GSIs). Utilizando as propriedades de perda de função dos mutantes familiares da doença de Alzheimer, é possível rastrear moduladores de γ-secretase (GSMs).

Saccharomyces cerevisiae Modelos da doença de Alzheimer para rastrear genes, mutações e produtos químicos que afetam a produção de beta-amilóide pela γ-secretase

Aprenda a descobrir novos ligantes para receptores GABA A usando ensaios de ligação e gravações eletrofisiológicas em oócitos de Xenopus e fatias cerebrais de roedores. Este método sistemático identifica compostos seletivos com potencial terapêutico.

Métodos para a descoberta de novos compostos modulando um Receptor do ácido gama - aminobutírico tipo uma neurotransmissão

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