Name: Caracterização das respostas de isotipo de imunoglobulina Timo-dependentes e Timo-independente nos ratos usando ensaio enzima-lig da imunoabsorção (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 15 s
Description: Aprenda a caracterizar respostas de isotipos de imunoglobulina timo-dependentes e timo-independentes em camundongos usando ELISA. Este método permite medir quantitativamente a ativação de células B e a imunidade humoral.

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Este estudo foi suportado pelos institutos nacionais de subsídios saúde R01 CA158402 (P. Xie) e R21 AI128264 (P. Xie), o departamento de defesa conceder W81XWH-13-1-0242 (P. Xie), um prêmio de piloto o Cancer Institute de New Jersey através do Grant número P30CA072720 do Instituto Nacional de câncer (P. Xie), uma concessão biomédica Busch (P. Xie), uma bolsa de Victor Stollar (a. leite) e um B. Anne e James B. Leathem Fellowship (S. Zhu).

Este protocolo segue as diretrizes do Comitê de ética institucional pesquisa animal da Universidade de Rutgers. Todos os mouses são utilizados em conformidade com as diretrizes do NIH e sob um animal protocolo aprovado pelo Comitê de uso e cuidado institucional do Animal.
1. preparação dos ratos e coleção de ingênuo Mouse Sera
<ol><li>Manter todos os ratos para experimentos de imunização em uma determinada instalação livre de patógeno animal.</li>
	<li>Nocaute de gênero de correspondência, jovem adulto (8-12 semanas de idade) de uso e littermate controle de ratos que têm os mesmos pais e gaiolas para estudos de imunização.</li>
	<li>Planeje a imunização e horários de coleta do soro conforme representado na Figura 1.</li>
	<li>Colher soro ingênuo de cada rato em 7 dias (-7) antes de imunização. Siga os procedimentos retro-orbital hemorragia e soro preparação conforme detalhado abaixo na etapa 4.</li>
</ol>2. preparação do TNP-polissacarídeo (um antigénio de TI) e TNP-KLH (um antigénio TD)
<ol><li>Dissolva o pó de antígeno em PBS estéril (pH 7,4) completamente para fazer 0,5 mg/mL do TNP-polissacarídeo estoque e 1 mg/mL de soluções estoque TNP-KLH. Alíquota cada antigénio solução reserva para tubos de microcentrífuga estéril em 0,5 mL/tube e manter as alíquotas a-80 ° C para armazenamento a longo prazo. Evite múltiplas congelamento e degelo das alíquotas do antígeno.</li>
	<li>No dia da injeção, calcular o volume do TNP-polissacarídeo (50 µ g/100 µ l/mouse) ou TNP-KLH (100 µ g/100 µ l/mouse) necessários de acordo com o número de ratos para ser injetado. Descongele o número apropriado de alíquotas TNP-polissacarídeo ou TNP-KLH à temperatura ambiente (RT).</li>
	<li>Para a injeção do TNP-KLH, primeiro dilua o adjuvante de alum (40mg/mL) com 3 volumes de PBS estéril para uma concentração final de 10 mg/mL. Certifique-se que a mistura de adjuvante de alúmen é bem suspensa antes de diluição.</li>
	<li>Combinar a igual volume de chorume de adjuvante de alúmen de 10 mg/mL da etapa 2.3 e a solução de TNP-KLH descongelada (1 mg/mL) em um tubo de polipropileno de 5 mL, misture bem e incubar a 37 ° C por 30 min. Prepare este TNP-KLH/alum misturar na hora antes da injeção.</li>
</ol>3. imunização de camundongos
<ol><li>Execute a injeção intraperitoneal (i.p.) do TNP-polissacarídeo ou alum/TNP-KLH para imunizar os ratos com seringas de insulina 1 mL em um gabinete de segurança biológica. Introduza a agulha em ângulo de aproximadamente 30° de preferência no quadrante inferior direito de cada rato para evitar a injeção em órgãos internos.</li>
	<li>Injete i.p. 100 µ l do TNP-polissacarídeo por rato no dia 0 para a imunização de TI Ag (Figura 1A).</li>
	<li>Injete i.p. 200 µ l da mistura TNP-KLH/alum (preparada na etapa 2.4) por rato no dia 0 para imunização TD Ag. Repita a mesma injeção no dia 21 como uma imunização de reforço para estudos de memória (Figura 1B).</li>
	<li>Após a injeção, retornar cada mouse para sua gaiola e manter todos os ratos injetados na condição de isentos de agentes patogénicos específica.</li>
</ol>4. retro-orbital de sangramento e preparação de soro
<ol><li>Soros de rato em pontos diferentes do tempo da colheita: para a imunização do TNP-polissacarídeo, coletar sera rato em dia -7 e 7 (Figura 1A); para a imunização do TNP-KLH/alum, colete sera rato em dia -7, 7, 14 e 28 (Figura 1B).</li>
	<li>Para Retro-orbital de sangramento, anestesiamos a cada rato com 5% de isoflurano por 1 – 2 min em um armário de biossegurança25. Execute o reflexo pedal para garantir a adequada anestesia de cada rato.</li>
	<li>Segure o mouse anestesiado com uma mão com o indicador e o polegar, puxando a pele ao redor do globo ocular para que o olho se projeta fora do soquete25. Inserir uma pipeta de Pasteur não heparinizado ou tubo capilar em um ângulo de 45° para o canto interno do olho perfurado por baixo do globo ocular,25.</li>
	<li>Exerça uma ligeira pressão para baixo e gire a pipeta ou tubo suavemente a invadir a veia e coletar 150-200 µ l de sangue na pipeta ou tubo. Imediatamente transferir o sangue para um tubo de microcentrífuga estéril 1,5 mL e retornar o mouse para sua gaiola para recuperar.</li>
	<li>Deixe amostras sentar na RT para 1 – 2 h coagular o sangue.</li>
	<li>Centrifugar as amostras de sangue coagulado em 13.000 x g durante 10 minutos a 4 ° C. Transferi o soro claro em cima o coágulo de sangue para um novo tubo de microcentrífuga estéril 1,5 mL.</li>
	<li>Repita a etapa 4.6 mais uma vez para remover o coágulo de sangue residual e coletar o soro claro.</li>
	<li>Alíquota do soro em tubos de microcentrífuga estéril 1,5 mL em 50 µ l/tube e armazenar o sera a-80 ° C.</li>
	<li>Alternam o olho para o sangramento em pontos diferentes de tempo para que cada olho é sangrou no máximo duas vezes por todo o experimento. No terminal do sangramento, recolha a 1 mL de sangue de cada rato antes de eutanásia. Eutanásia o mouse com 5% CO2 , seguido por deslocamento cervical. Nota: As células B esplênica podem ser colhidas para fluxo cytometric análises e estudos de cultura em vitro . Também preparamos o DNA genômico de splenocytes para verificar o genótipo de cada rato.</li>
</ol>5. Mouse Ig isotipo específico ELISA
<ol><li>
Prepare os amortecedores e soluções antes de ELISA.
	<ol>
<li>Prepare 500 mL de tampão de acoplamento (PBS, pH 7,4).</li>
		<li>Preparar 500 mL de solução de lavagem (PBS-T (0,05% Tween 20), pH 7,4).</li>
		<li>Preparar 100 mL de tampão de bloqueio (1% BSA em PBS, pH 7,4, armazenada a 4 ° C).</li>
		<li>Preparar 1 L de tampão de substrato (dietanolamina 1m, pH 9,8 (97 mL de dietanolamina em 1 litro de H2O, pH ajustado usando 10 M HCl) e 0,5 mM MgCl2). Protege o tampão de substrato de luz envolvendo o frasco com papel alumínio. Loja a 4 ° C.</li>
		<li>Prepare 100 mL de solução de paragem (3 M NaOH).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Revesti as placas de ELISA:
	<ol>
<li>Para isotipo Ig do soro total ELISA, revestir as placas de 96 poços imuno com 10 µ g/mL de isotipo específico captura anti-rato policlonal de cabra Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A ou E) Abs no Buffer de acoplamento (PBS) 100 µ l/poço.</li>
		<li>Para o isotipo Ig TNP específicos do ELISA, revesti as placas de 96 poços imuno com 10 µ g/mL do TNP(38)-BSA em PBS em 100 µ l/poço.</li>
		<li>Para alta afinidade específica TNP Ig isotipo ELISA, revesti as placas de 96 poços imuno com 10 µ g/mL do TNP(3)-BSA em PBS em 100 µ l/poço26. Incube as placas a 4 ° C durante a noite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após a incubação do revestimento, lavar os pratos 2 vezes com 200 µ l/poço de PBS-T. Descartar o tampão de lavagem e borrão secar as placas (toque cada placa de cabeça para baixo sobre uma pilha de toalhas de papel) depois de cada lavagem.</li>
	<li>Bloquear as placas: Adicionar 200 µ l/poço de bloqueio de Buffer (1% de BSA em PBS) para as placas revestidas e incubar as placas por 1h no RT</li>
	<li>
Enquanto as placas estão bloqueando, prepare diluições de padrões de isotipo Ig e amostras de soro no bloqueio de Buffer em uma placa de 96 poços separada, não tratada na 150 µ l/poço.
	<ol>
<li>Preparar as normas isotipo Ig da 250 ng/mL como a concentração inicial padrão (St01) e fazer 7 a 10 de 1:2 diluições em série dos padrões de Ig (St02 St07 ou St10, Figura 2).</li>
		<li>Prepare o soro de rato amostras a uma diluição de 1: 100 ou 1: 500 fator como a diluição inicial e fazer 3 ou 4 de 01:10 diluições em série por total isotipo Ig ou 1:5 diluições em série para isotipo Ig TNP específicos de cada amostra de soro(Figura 2). Para IgE ELISA, preparar amostras de soro de rato em um fator de diluição 1:2 como a diluição inicial e fazer 3 de 1:5 diluições de série de cada amostra de soro.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Após o bloqueio, lavar os pratos da etapa 5.4 três vezes com 200 µ l/poço de PBS-T e borrão secar as placas depois de cada lavagem.</li>
	<li>Transferi 100 µ l/poço de diluídos padrões de isotipo Ig (adequados para a captura e detecção Abs) e amostras de soro diluído de passo 5.5 para as placas preparadas na etapa 5.6. Incube as placas com os padrões e amostras a 4 ° C durante a noite.</li>
	<li>Lavar as placas 3 vezes com 200 µ l/poço de PBS-T e borrão seca as placas depois de cada lavagem.</li>
	<li>Em cada prato, adicionar 100 µ l/poço de 10 µ g/mL de uma apropriado da fosfatase alcalina (AP)-anti-rato conjugados específicos do isotipo cabra Ig (M, G1, G2a, G2b, G3, A ou E) Abs diluído em tampão de bloqueio.</li>
	<li>Incubar as placas com Abs AP-conjugado para 1-2 h em RT Para a deteção de IgE, incubar as placas por 1 – 2 h a 37 ° C.</li>
	<li>Prepare-se 1 mg/mL de solução de substrato dissolvendo-se dois comprimidos de substrato de fosfatase 5 mg em 10 mL de tampão de substrato.</li>
	<li>Lavar cada placa 5 vezes com 200 µ l/poço de PBS-T e borrão seca as placas depois de cada lavagem.</li>
	<li>Adicione 100 µ l/poço de solução de substrato em cada prato. Permitir que a reação a desenvolver no RT, que normalmente leva apenas alguns minutos.</li>
	<li>
Leia cada placa em 405 nm, utilizando um leitor de microplacas com seu software associado.
	<ol>
<li>Clique em "configurações" para definir os comprimentos de onda "Lm1" no "405 nm" e clique em "Okey".</li>
		<li>Clique em "modelo" para atribuir "em branco" poços, poços de "normas" e "desconhecido" poços de acordo com a configuração da placa de 96 poços.</li>
		<li>Para poços de "padrões", clique em "série" para definir o "Primeiro exemplo"como"St01", selecione "Iniciar do" no "Top" e definir "Replica" como "2". Verifique o"Amostra Descriptor" e "Valor padrão" de entrada: selecione "unidades"como"ng/mL", definir "valor inicial" como "250", defina o "passo", como "2". Clique em "Okey".</li>
		<li>Clique em "Ler" para ler a placa quando a maioria concentrada padrão atinge uma densidade óptica (OD) de ~ 1.</li>
		<li>Clique no menu "arquivo" e clique em "salvar" para salvar o arquivo.</li>
		<li>Clique em "ler" para ler a placa novamente quando o padrão mais concentrado se aproxima OD405 de ~ 1,5, 2 e 2,5, respectivamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pare a reação adicionando 25 µ l/poço de 3 M de NaOH. Conclua etapas 5.12 a 5.15 por um prato de cada vez.</li>
	<li>
Analise dados de ELISA utilizando o software associado com o leitor de microplacas:
	<ol>
<li>Verifique os valores de OD405 as normas de isotipo Ig de ler arquivos e selecione uma leitura adequada, com boa variedade linear das normas para análise de dados detalhados.</li>
		<li>Selecione o programa de montagem de 4 parâmetros para traçar curvas padrão. Verifica o coeficiente da curva padrão (R2), que é necessária para ser > 0,98 para assegurar dados de boa qualidade.</li>
		<li>Verifique se os valores de OD405 de cada amostra diminuem com o aumento de fatores de diluição. Recupere a concentração de todos os poços da amostra diluída, clicando em "Desconhecidos".</li>
		<li>Selecione um poço apropriado de cada amostra com OD405 na faixa linear da curva padrão do isotipo Ig para o cálculo da concentração.</li>
		<li>Calcular o concentração de isotipo Ig de cada amostra usando a fórmula do soro: soro concentração Ig = concentração bem selecionada x fator de diluição.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Plotar gráficos e realizar análises estatísticas usando um software adequado9,10,11. Fazer gráficos de dispersão vertical de soro níveis de isotipo Ig para comparar as respostas de Ig no mesmo ponto do tempo. Para estudos de resposta de memória TD, fazer as curvas de resposta do tempo-curso para examinar as respostas do isotipo Ig antes e após a imunização de reforço. Use barras de erro para mostrar o desvio padrão (SD) de cada grupo de amostras. Para comparar respostas de isotipo Ig entre dois genótipos de ratos, use o teste pareado t para dados bicaudal para determinar a significância estatística. Defina o valor de p < 0,05 como significativamente diferentes.</li>
</ol>

Os autores têm sem interesses financeiros concorrentes.

Aqui, descrevemos o protocolo para a caracterização de TD e TI Ig isotipo respostas nos ratos usando ELISA. Sucesso da implementação do presente protocolo requer o uso de materiais especificados na tabela 1, incluindo placas de ensaio de ELISA, imunização Ags, anticorpos de isotipo específico do Ig e padrões. Deve ter cuidado para evitar o uso de placas de cultura de tecidos tratada por ELISA. Diluições dos padrões e amostras de soro devem ser feitas em chapas separadas não tratadas (fundo redondo) e em ...

Os linfócitos B são o principal jogador na imunidade humoral e o único tipo de célula em mamíferos que são capazes de produzir anticorpos, também denominados como imunoglobulinas (Ig)1,2. Anticorpos secretados pelas células B fornecem uma formidável defesa contra patógenos através de diversos mecanismos, incluindo a neutralização, opsonização e ativação do complemento, levando a imunidade protetora3a invadir. Secreção de anticorpos pelas células B só é alcançada após a ativação completa das células B específicas, que normalmente requer que duas distintas sinaliza3. Sinal 1 é retransmitido por ligação directa do antígeno (Ag) para o receptor de células B (BCR) expressado na superfície de de células específicas ingênua B3. Dependendo da fonte de sinal 2, ativação de células B pode ser dividida em Timo-dependentes (TD) ou Timo-independente (TI)3,4. Em uma resposta de antígeno de TD, sinal 2 é fornecida pelo cognato CD4 células T ativadas auxiliar (T,H), que expressam CD154, o ligante para o receptor co-estimulatória CD40 expressado em células de B a1,2,3. Em uma resposta de antígeno de TI, sinal 2 vem de qualquer envolvimento de receptores Toll-like (TLRs no caso tipo 1 TI Ag) ou cross-linking extensa dos BCRs (no caso do tipo 2 TI Ag) no B células3,4. Os antígenos de TI (TI-1) do tipo 1 são ligantes microbianas de TLRs, incluindo bacterianos lipopolissacarídeos (LPS), RNAs virais e microbiana CpG DNA4,5. Antígenos de TI (TI-2) do tipo 2 têm estrutura altamente repetitiva e são capazes de entregar prolongada e persistente sinalização à célula B por múltiplos do cross-linking dos BCRs4,6. Exemplos típicos de TI-2 antígenos incluem pneumocócica polissacarídeos e polissacarídeo conjugados hapteno6,7. Antígenos tanto TD e TI podem eliciar respostas de IgM robustas antígeno-específicas e também podem induzir a produção de anticorpos de comutação de isotipo (IgG, IgA e IgE) com a ajuda fornecida por apresentadoras de antígenos (APCs) de células como as células dendríticas (DCs)1 ,2,3. Além disso, ambos TD e TI antígenos são capazes de induzir respostas de memória com a ajuda de APCs, mas TD os antígenos são mais eficientes na indução de memória B célula geração3,8.
Neste protocolo, TD e TI Ig respostas são eliciadas em camundongos intraperitoneal (i.p.) imunização com hemocianina de Lapa 2.4.6-trinitrophenyl-fechadura de antígenos conjugados hapteno modelo (TNP-KLH) e TNP-polissacarídeo (neutro, altamente ramificado e alta massa), respectivamente,10,9,11. Antígenos de TD são geralmente usados com um adjuvante para aumentar a produção de anticorpos12. Aqui em nosso protocolo, TNP-KLH é injetado com alume, um adjuvante comumente utilizado em estudos de imunização12. Outros exemplos de adjuvantes que podem ser usados incluem completa ou incompleta adjutor de Freund (CFA ou IFA), A monofosforil lipídio / dicorynomycolate trealose ("Ribi" adjuvante) e CpG oligodeoxynucleotides, etc.13, 14. após a imunização, soros de rato são colhidos nos pontos de tempo diferentes e anticorpos específicos TNP em soros são quantificados usando o Ig isotipo específico enzima-lig da imunoabsorção ensaio (ELISA)9,10, 11.
ELISA é um ensaio baseado na placa que é amplamente utilizado como uma ferramenta de diagnóstico na medicina e também como uma ferramenta analítica em investigação biomédica15,16. É usado para detectar e quantificar analitos incluindo anticorpos, hormônios, citocinas, quimiocinas e vários antígenos, etc. ELISA pode ser executada em vários formatos diferentes, incluindo directo, indirecto, sanduíche e competitiva ELISA15,16. Em geral, envolve a imobilização do antígeno para uma superfície sólida, geralmente uma placa de microtitulação 96 poços, que é incubada com anticorpo primário. Após a incubação, o anticorpo não acoplado é lavado. Em um ELISA direto, o anticorpo primário diretamente é conjugado a uma enzima (peroxidase de rábano normalmente ou fosfatase alcalina), que pode decompor um substrato cromogénico para produzir uma mudança de cor visível detectada por um instrumento de detecção do sinal tais como uma Espectrofotómetro de15,16. Em contraste, se um anticorpo secundário enzima-lig é usado para ligar o anticorpo primário, então este é considerado um de15,de ELISA indireto16. ELISA direta é mais rápido enquanto ELISA indireta é mais sensível,15,16. Em um sanduíche ELISA, as placas são revestidas com anticorpo "captura" usado para imobilizar o antígeno de interesse nas amostras, e em seguida o antígeno capturado pode ser detectado por outro anticorpo "detecção" de uma forma directa ou indirecta15, 16. ELISA sanduíche oferece alta especificidade, uma vez que o antígeno é detectado por dois diferentes anticorpos do antígeno. Em um ELISA competitivo, a competição é estabelecida entre o antígeno da amostra e o antígeno de placa-limite para a ligação com o anticorpo primário, e em seguida a concentração de antígeno na amostra é quantificada através da medição da redução no sinal do substrato 15 , 16. ELISA competitivo pode ser executada usando o formato acima mencionado direto ou indireto e é útil para a detecção de antígenos pequenos com apenas um epítopo15,16.
Técnicas alternativas para a medição de anticorpos incluem radio-imunoensaio (RIA), ensaio de eletroquimioluminescência (ECL) ensaio e superfície ressonância de plasmon (SPR)17. RIA foi o primeiro imunoensaio desenvolvido que as medidas da presença de um antígeno (ou anticorpos) com alta especificidade e sensibilidade, usando reagentes radiolabeled18,19. No entanto, devido as preocupações de toxicidade radioativa, custos de eliminação, validade e licenças especiais para trabalhar com materiais radioactivos, ELISA é um melhor e mais conveniente técnica comum usa20,21. ECL é um ensaio altamente sensível no qual quimioluminescente reações são iniciadas usando eletricidade para gerar espécies altamente reativas de precursores estáveis na superfície de um eletrodo, em podem ser usadas para medir a quantidade de analitos (tais como antígenos ou anticorpos)22. No entanto, ECL requer um instrumento especial e, portanto, não é tão amplamente usado como ELISA23. SPR é um ensaio direto que pode ser usado para medir a vinculação dos ligantes (EG., anticorpos) para moléculas de imobilizado (EG., antígenos) em um sensor chip superfície24. SPR detecta as interações em tempo real, muito especificamente e não requer a utilização de reagentes rotulados como ELISA. No entanto, SPR também requer um equipamento especial e tem uma sensibilidade mais baixa do que ELISA17. Tendo em conta as limitações dos métodos alternativos, ELISA é a técnica mais adequada e conveniente para o nosso propósito no presente protocolo. Aqui, descrevemos o uso de sanduíche ELISA para a análise dos níveis totais do isotipo Ig e os procedimentos de ELISA indireto para a análise do antígeno-específicas isotipos de Ig.

<table><tbody><tr><td>Leitor de microplacas sintonizáveis VersaMax</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>VERSAMAX</td><td>Equipamento para leitura de chapas</td></tr><tr><td>SOFTmax PRO 5.3</td><td>MDS Analytical Technologies</td><td>Software SOFTmax PRO 5.3</td><td>para leitor de chapas</td></tr><tr><td>GraphPad Prism</td><td>GraphPad</td><td>Prism</td><td>Software para gráficos e estatísticas</td></tr><tr><td>TNP-AECM-polissacarídeo (FICOLL)</td><td>Biosearch Technologies</td><td>F-1300-10</td><td>A TI Ag para imunização</td></tr><tr><td>TNP-KLH</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T-5060-5</td><td>A TD Ag para imunização</td></tr><tr><td>TNP(38)-BSA</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T-5050-10 (taxa de conjugação: 38)</td><td>Revestimento Ag para ELISA TNP</td></tr><tr><td>(3)-BSA</td><td>Biosearch Technologies</td><td>T-5050-10 específico para TNP (taxa de conjugação: 3)</td><td>Revestimento Ag para alta afinidade TNP-específico</td></tr><tr><td>Ig Imject Alum</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>PI-77161</td><td>Adjuvante de alúmen para imunização</td></tr><tr><td>Tubos de polipropileno Falcon</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-959-11A</td><td>Para incubação de TNP-KLH/alum</td></tr><tr><td>BD Seringa de Insulina</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-829-1B</td><td>Para injeção i.p. de camundongos</td></tr><tr><td>Placas Imunológicas de 96 Poços, Fundo Plano</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td>14-245-61</td><td>Para</td></tr><tr><td>microplacas de 96 poços não tratadas ELISA, fundo redondo</td><td>VWR</td><td>82050-622</td><td>Para diluições em série de padrões e amostras</td></tr><tr><td>Substrato de fosfatase, comprimidos de 5 mg Sigma</td><td></td><td>S0942-200TAB</td><td>Substrato AP</td></tr><tr><td>Dietanolamina</td><td>VWR</td><td>IC15251690</td><td>Um componente do tampão de substrato AP</td></tr><tr><td>Cabra anti-rato IgM</td><td>SouthernBiotech</td><td>1020-01</td><td>Captura Ab para camundongo IgM</td></tr><tr><td>Cabra anti-rato IgG1</td><td>SouthernBiotech</td><td>1070-01</td><td>Captura Ab para camundongo IgG1</td></tr><tr><td>Cabra anti-rato IgG2a</td><td>SouthernBiotech</td><td>1080-01</td><td>Captura Ab para camundongo IgG2a</td></tr><tr><td>Cabra anti-rato IgG2b</td><td>SouthernBiotech</td><td>1090-01</td><td>Captura Ab para camundongo IgG2b</td></tr><tr><td>Cabra anti-rato IgG3</td><td>SouthernBiotech</td><td>1100-01</td><td>Captura Ab para rato IgG3</td></tr><tr><td>Cabra anti-rato IgA</td><td>SouthernBiotech</td><td>1040-01</td><td>Captura Ab para rato IgA</td></tr><tr><td>Cabra anti-rato IgE</td><td>SouthernBiotech</td><td>1110-01</td><td>Captura Ab para rato IgE</td></tr><tr><td>AP-Cabra anti-rato IgM</td><td>SouthernBiotech</td><td>1020-04</td><td>Detecção Ab para rato IgM</td></tr><tr><td>AP-Cabra anti-rato IgG1</td><td>SouthernBiotech</td><td>1070-04</td><td>Detecção Ab para rato IgG1</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-mouse IgG2a</td><td>SouthernBiotech</td><td>1080-04</td><td>Detecção Ab para camundongo IgG2a</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-mouse IgG2b</td><td>SouthernBiotech</td><td>1090-04</td><td>Detecção Ab para camundongo IgG2b</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-mouse IgG3</td><td>SouthernBiotech</td><td>1100-04</td><td>Detecção Ab para camundongo IgG3</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-mouse IgA</td><td>SouthernBiotech</td><td>1040-04</td><td>Detecção Ab para mouse IgA</td></tr><tr><td>AP-Goat anti-mouse IgE</td><td>SouthernBiotech</td><td>1110-04</td><td>Detecção Ab para camundongo IgE</td></tr><tr><td>IgM de camundongo padrão</td><td>BD Biosciences</td><td>553472</td><td>IgM específico para TNP, Clone&nbsp; G155-228</td></tr><tr><td>Mouse IgG1 padrão</td><td>BD Biosciences</td><td>554054</td><td>IgG1 específico para TNP, Clone&nbsp; 107.3</td></tr><tr><td>Mouse IgG2a padrão</td><td>BD Biosciences</td><td>556651</td><td>IgG2a específico para TNP, Clone&nbsp; G155-178</td></tr><tr><td>Camundongo IgG2b padrão</td><td>BD Biosciences</td><td>554055</td><td>IgG2b específico para TNP, Clone&nbsp; 49.2</td></tr><tr><td>Camundongo IgG3 padrão</td><td>BD Biosciences</td><td>553486</td><td>IgG3 específico para KLH, Clone&nbsp; A112-3</td></tr><tr><td>IgA de camundongo padrão</td><td>BD Biosciences</td><td>550924</td><td>IgA induzida por óleo mineral, Clone&nbsp; MOPC-320</td></tr><tr><td>IgE de camundongo padrão</td><td>BD Biosciences</td><td>557079</td><td>IgE específica para TNP, Clone&nbsp; C38-2</td></tr></tbody></table>

caracterização das respostas de isotipo de imunoglobulina timo-dependentes e timo-independente nos ratos usando ensaio enzima-lig da imunoabsorção

Characterization of Thymus-dependent and Thymus-independent Immunoglobulin Isotype Responses in Mice Using Enzyme-linked Immunosorbent Assay

Anticorpos, também denominados como diferenciados de imunoglobulinas (Ig), secretadas por linfócitos B, células plasmablasts/plasma, na imunidade humoral fornecem uma formidável defesa contra a invasão de agentes patogénicos através de diversos mecanismos. Um dos principal objetivos da vacinação é induzir proteção anticorpos antígeno-específicos para prevenir infecções fatais. Timo-dependentes (TD) e antígenos de Timo-independente (TI) podem eliciar respostas de IgM robustas antígeno-específicas e também podem induzir a produção de anticorpos de comutação de isotipo (IgG, IgA e IgE) bem como a geração de células B de memória com a ajuda fornecido por apresentadoras de antígenos (APCs) de células. Aqui, descrevemos um protocolo para caracterizar TD e TI Ig isotipo respostas em ratos utilizando ensaio imunoenzimático (ELISA). Neste protocolo, TD e TI Ig respostas são eliciadas em camundongos intraperitoneal (i.p.) imunização com antígenos conjugados hapteno modelo TNP-KLH (em alum) e TNP-polissacarídeo (em PBS), respectivamente. Para induzir resposta de memória TD, uma imunização de reforço do TNP-KLH em alum é dado em 3 semanas após a primeira imunização com o mesmo antígeno/adjuvante. Soros de mouse são colhidos em pontos diferentes de tempo, antes e após a imunização. Total de níveis de Ig de soro e anticorpos específicos TNP são posteriormente quantificados usando o Ig isotipo específico sanduíche e ELISA indireta, respectivamente. Para corretamente quantificar a concentração de soro de cada isotipo Ig, as amostras devem ser apropriadamente diluído para caber dentro da escala linear das curvas padrão. Usando este protocolo, consistentemente obtivemos resultados confiáveis com sensibilidade e alta especificidade. Quando usado em combinação com outros métodos complementares tais como citometria de fluxo, em vitro cultura de esplênica de células B e imuno-histoquímica coloração (IHC), este protocolo permitirá aos pesquisadores uma compreensão abrangente do anticorpo respostas em um determinado ambiente experimental.

Nós usamos este protocolo para investigar as funções de um regulador crítico do sistema imunológico, TRAF3, em TI e TD Ig isotipo respostas9,10,11. TRAF3, directa ou indirectamente regula a transdução de sinal de um número de receptores imunes inatos e adaptativos, incluindo a superfamília de receptores TNF, receptores Toll-like e T celular receptor/CD28, entre outros27<su...

Neste trabalho, descrevemos um protocolo para caracterizar T-dependentes e T-independentes respostas do isotipo de imunoglobulina (Ig) em camundongos usando ELISA. Este método usado sozinho ou em combinação com fluxo cytometry permitirá que os investigadores a identificar diferenças nas respostas de isotipo Ig mediada por células B em camundongos após imunização de antígenos T-dependentes e T-independentes.

Caracterização das respostas de isotipo de imunoglobulina Timo-dependentes e Timo-independente nos ratos usando ensaio enzima-lig da imunoabsorção

Antibodies, also termed as immunoglobulins (Ig), secreted by differentiated B lymphocytes, plasmablasts/plasma cells, in humoral immunity provide a ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia sobre respostas de anticorpos dependentes e independentes induzidas por imunização de antígenos, bem como ativação de células B e reações do centro germinativo. A principal vantagem dessa técnica é que ela fornece medições confiáveis e quantitativas de resposta ao isotipo de Ig com uma comparação direta da ativação de células B e imunidade humoral em camundongos. Para imunização com polissacarídeo TNP, carregue uma seringa de insulina mililitro por camundongo com 100 microlitros de solução de antígeno recém-preparada e insira a agulha no quadrante inferior direito de cada animal em um ângulo de aproximadamente 30 graus para evitar a injeção no órgão inferior.Quando todos os camundongos tiverem sido injetados, devolva os animais às suas gaiolas para serem alojados em uma instalação específica livre de patógenos. Nos momentos experimentais apropriados, coletar 150 a 200 microlitros de sangue de cada animal imunizado por sangramento retro-orbital e permitir que as amostras coagulem em temperatura ambiente por uma a duas horas. No final da incubação, centrifugue as amostras de sangue coagulado e transfira o sor

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Imunologia e Infecção

Este vídeo demonstra um método para avaliar a resposta imune de anticorpos a uma nova vacina adjuvante de nanoemulsão em camundongos pré-imunizados. A imunização aumenta a resposta de anticorpos, conforme confirmado pela determinação dos títulos de anticorpos IgG.

Medindo os níveis de imunoglobulina G contra uma vacina de teste em um soro de camundongo

Com funções efectoras distintas das outras subpopulações de células T, células Th17 foram centralmente implicada na autoimunidade inflamatória. Este protocolo in vitro de diferenciação Th17 proporciona um meio para determinar se os linfócitos T CD4 + naive podem diferenciar-se em células Th17, e para examinar ainda mais o seu papel no auto-imunidade e resposta do hospedeiro.

Isolamento e Th17 Diferenciação de Linfócitos T CD4 Naïve

Descrevemos aqui um método eficaz para o isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo do rato (TEC). O protocolo pode ser utilizada para estudos da função do timo para o desenvolvimento normal das células T, disfunção do timo, e a reconstituição de células T.

Isolamento, identificação e purificação de células epiteliais do timo murino

A análise in vitro da recombinação de troca de classe em camundongos é desafiadora devido às moléculas de IgE citofílicas ligadas aos receptores Fc na superfície das células B.  Descrevemos um método para detecção de IgE usando clivagem mediada por tripsina de IgE ligada à superfície antes da fixação e permeabilização para coloração de fluorescência citoplasmática.

Detecção de True IgE-expressando Rato B células da linhagem

Este relatório fornece uma descrição detalhada do transplante de timi murino de camundongos doadores de diferentes idades sob a cápsula renal de receptores de camundongos imunodeficientes. O objetivo desta abordagem é modelar o desenvolvimento de células T e eventos de seleção tímica in vivo.

Isolamento e Transplante de diferentes envelhecidas murino tímicos enxertos.

As células T CD4+ virgens polarizam para vários subconjuntos, dependendo do ambiente no momento da ativação.  A diferenciação de células T CD4+ virgens em vários subconjuntos efetores pode ser alcançada in vitro através da adição de estímulos de receptores de células T e sinais específicos de citocinas.

Rato Naïve CD4<sup&gt; +</sup&gt; Isolamento de células T e<em&gt; In vitro</em&gt; Diferenciação em subpopulações de células T

Este artigo descreve a metodologia in vivo e in vitro para caracterizar os progenitores de decantação tímica pela análise da cinética de geração, fenótipo e número de suas progênies de células T.

Caracterização de Thymic Settling Progenitores no embrião do rato Usando<em&gt; In Vivo</em&gt; E<em&gt; In Vitro</em&gt; Os ensaios

Um protocolo otimizado é apresentado para a geração de anticorpos monoclonais baseados na tecnologia de hibridoma. Os camundongos foram imunizados com um imunoconjugado. As células do baço foram fundidas por PEG e um impulso elétrico com células de mieloma imortal. As células de hibridoma produtoras de anticorpos foram selecionadas por HAT e triagem ELISA antígeno-específica.

Geração de anticorpos monoclonais murinos pelo hibridoma Tecnologia

Neste estudo, apresentamos uma nova e eficaz protocolo para a isolação de linfócitos de remendos de Peyer (PPs), que podem ser usados posteriormente para ensaios funcionais in vivo e in vitro , bem como estudos de fluxo cytometric t folicular auxiliar e células B de centro germinativo.

Unraveling jogadores-chave da imunidade Humoral: avançado e otimizado protocolo de isolamento de linfócitos de Murine do Peyer Patches

Descrevemos aqui uma simples análise da heterogeneidade do compartimento de células B imunes da murina nos tecidos peritônio, baço e medula óssea por citometria de fluxo. O protocolo pode ser adaptado e estendido a outros tecidos do mouse.

Caracterização citométrica de fluxo do desenvolvimento de células B murinas

Fornecemos um protocolo detalhado para isolar e identificar populações raras de células T específicas de antígenos em pulmões de camundongos por meio de enriquecimento de células T baseadas em esferas magnéticas e tetrâmeros peptídicos: complexo principal de histocompatibilidade (MHC).

Identificação de células T raras específicas de antígenos de pulmões de camundongos com peptídeos: tetrâmeros do complexo principal de histocompatibilidade

Aprenda a caracterizar respostas de isotipos de imunoglobulina timo-dependentes e timo-independentes em camundongos usando ELISA. Este método permite medir quantitativamente a ativação de células B e a imunidade humoral.

Caracterização das respostas de isotipo de imunoglobulina Timo-dependentes e Timo-independente nos ratos usando ensaio enzima-lig da imunoabsorção (Vídeo) | JoVE Journal

Caracterização das respostas de isotipo de imunoglobulina Timo-dependentes e Timo-independente nos ratos usando ensaio enzima-lig da imunoabsorção

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