Um ensaio rápido de virulência bacteriana baseada em imagem usando ameba

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da patogênese bacteriana, como quando os efetores de virulência que matam o hospedeiro são expressos em células bacterianas e quais são os estados de virulência das células implantônicas anexadas à superfície? A principal vantagem dessa técnica é que ela é rápida, quantitativa e as células hospedeiras são relativamente fáceis de manusear. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando notamos que a subpopulação implantônica de Pseudomonas anexada à superfície tem diferentes fenótipos de matança de hospedeiros.

Para começar a cultivar E.coli cepa BR durante a noite, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, leve a cultura de E.coli à temperatura ambiente. Usando uma vara de madeira, inocule a ameba em 750 l da cultura.

Adicione imediatamente 700 l da mistura de ameba E.coli a uma placa GYP. Incline a placa para espalhar a cultura uniformemente na superfície da placa. Em seguida, coloque o prato em uma caixa que mantenha alta umidade.

Incube a placa dentro da caixa a 22 C por quatro a cinco dias. Após o término do período de incubação, use uma ponta de pipeta estéril para coletar esporos de ameba da metade da placa. Em seguida, pipete para cima e para baixo para ressuspender a ameba na ponta da pipeta em 1 mL de meio PS.

Transferir a mistura de inoculação para um balão de 250 ml com 25 ml de meio PS suplementado com solução antibiótica antimicótica. Cultive a ameba a 22 C em uma coqueteleira rotativa a 100 rpm. Após o cultivo de Pseudomonas aeruginosa durante a noite, diluir a cultura com meio PSB em uma placa de Petri de 6 cm.

Em seguida, agitar a cultura num rotador de bancada regulado para 100 rpm a 37 C.Primeiro micro-ondas 50 ml de ágar 1% em tampão DB num balão de 250 ml. Adicione 15 L de cálcio AM aos 15 mL de ágar fundido e misture delicadamente. Despeje a mistura de ágar fundido em uma placa de vidro de 12 por 10 cm e deixe o ágar solidificar por dez minutos em temperatura ambiente.

Em seguida, use uma régua de metal e uma grade impressa para cortar a almofada de ágar solidificada em seções menores de 1,5 por 1,5 cm. Certifique-se de que o gel permaneça hidratado até que esteja pronto para uso. Em seguida, para isolar as células presas à superfície, remova o meio líquido da placa de Petri.

Em seguida, lave o prato com 1 mL de tampão de revelação para remover as células planctônicas. Para testar a virulência das células bacterianas ligadas à superfície, adicione 10 L de células de ameba das células bacterianas anexadas à superfície obtidas anteriormente. Para isolar as células planctônicas, transfira 10 L da cultura para uma placa de Petri fresca.

Em seguida, testar a virulência das células planctônicas misturando 10 L de células de ameba com as bactérias planctônicas obtidas anteriormente. Coloque imediatamente a pequena almofada de ágar em cima da mistura de ameba bacteriana apropriada na superfície da placa de Petri. Em seguida, remova o excesso de líquido pipetando suavemente o excesso de líquido e deixe o prato secar por 20 minutos.

Cubra o prato com a tampa e incube-o em temperatura ambiente por mais 40 minutos. Finalmente, use um microscópio de fluorescência para adquirir imagens de pelo menos 100 células de ameba. Neste protocolo, foi testada a virulência de células planctônicas e de Pseudomonas aeruginosa ligadas à superfície.

O tipo selvagem ligado à superfície Pseudomonas aeruginosa matou ameba indicada por uma forma de célula de ameba redonda e pela presença de fluorescência de calceína. Em comparação com as células planctônicas, o tipo selvagem de Pseudomonas aeruginosa teve um alto índice de morte do hospedeiro. As células planctônicas foram consumidas pela ameba indicada pelas formas das células amorfas da ameba e relativamente pouca fluorescência da calceína.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar um novo estoque de calceína AM e células de ameba e acompanhar de perto a densidade óptica da ameba. Após este procedimento, outros métodos, como o perfil de transcrição, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como Quais genes são ativados na subpopulação planctônica e anexada à superfície? Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como conduzir o ensaio rápido de virulência baseado em imagem.