Name: Um ensaio rápido de virulência bacteriana baseada em imagem usando ameba (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 22 s
Description: Aprenda a medir a virulência bacteriana rapidamente usando D. discoideum como hospedeiro e microscopia de fluorescência. Este método quantitativo permite analisar efeitos de morte celular em apenas uma hora.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

KP e como escreveu e revisou o manuscrito. KP realizados os experimentos e a análise. Este trabalho foi financiado pelo prêmio de transição de carreira do National Institutes of Health (NIH) (K22AI112816) às.

Todos os procedimentos experimentais foram realizados na Universidade da Califórnia, Irvine.
1. buffers e soluções
<ol><li>Prepare o caldo de lisogenia (LB) em um frasco de vidro de 1 L, acrescentando 25 g de mistura de LB-Miller em 1 litro de água bidestilada (ddH2O). Para placas de Petri, adicione um adicional 20 g de ágar-ágar. Autoclave para esterilizar. Despeje a 25 mL de ágar-ágar fundido Petri de 10 cm de diâmetro e deixar para solidificar à temperatura ambiente. Armazenar a mídia líquida à temperatura ambiente e placas de ágar a 4 ° C.</li>
	<li>Preparar pratos de glicose levedura peptona (cigano) em um frasco de vidro de 1 L misturando-se 1 g de D-glicose, extrato de 2 g de peptona, 0,25 g de levedura, 4,2 g de KH2PO4, 5,1 g de Na2HPO47 H2O e 25 g de ágar-ágar em 1 L de DDQ2 O. Autoclave para esterilizar. Despeje a 25 mL de ágar fundido Petri de 10 cm de diâmetro e deixar para solidificar à temperatura ambiente. Loja a 4 ° C.</li>
	<li>Prepare o suporte de peptona S (PS) em uma garrafa de vidro 1L pela mistura de 10g de peptona, extrato de 7 g de fermento, 15 g de D-glicose, 0,12 g de Na2HPO47 H2O, 1,4 g de KH2PO4, 40 µ g de vitamina B12 , e 80 µ g de ácido fólico em 800 mL de DDQ2O. calibrar um medidor de pH eletrônico usando padrões de pH 7 e pH 4 se o medidor de pH não tenha sido usado dentro de um dia.<ol>
<li>Medir o pH do meio PS usando o medidor de pH. Adicione 5 M KOH ou 5 M H3PO4 para ajustar o pH a 6.5. Ajustar o volume final para 1 L usando ddH2O. Filter esterilizar usando filtro de vácuo 0,22 µm e armazenar a 4 ° C. Nota: Proceda com cautela com os ajustes do pH através do uso de equipamento de proteção incluindo luvas, roupas de proteção, óculos de proteção e protecção facial.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare-se 10 x desenvolvimento Buffer Prime (DB') buffer em um frasco de vidro de 1 L, adicionando 3,4 g de KH2PO4, 13,4 g de Na2HPO4 7 H2O e ddH2O para um volume total de 800 mL. Calibre um medidor de pH eletrônico usando padrões de pH 7 e pH 4 se o medidor de pH não tenha sido usado dentro de um dia.<ol>
<li>Medir o pH do buffer usando o medidor de pH eletrônico. Ajuste o pH a 6.5 adicionando suavemente ou 5m KOH ou 5 M H3PO4 conforme necessário. Ajustar o volume final para 1 L usando ddH2O e esterilizar em autoclave. Armazenar em temperatura ambiente. Nota: Proceda com cautela com os ajustes do pH através do uso de equipamento de proteção incluindo luvas, roupas de proteção, óculos de proteção e protecção facial.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Fazer 1 x buffer de desenvolvimento (DB) misturando-se 100 mL de 10 x DB' buffer com 1 mL de esterilizados de MgCl 2 M2, e 1 mL de esterilizados 1 M CaCl2. Ajuste o volume final para 1 L em um frasco de vidro de 1 L usando um de DDQ esterilizado autoclavado2loja O. à temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare PS:DB médio em um frasco de vidro de 1 L misturando-se 100 mL de meio de PS esterilizado, 100 mL de esterilizado 10 x DB' buffer e esterilizado ddH2O para um volume total de 1 L. suplemento com 1 mL de esterilizados de MgCl 2 M2 e 1 mL de esterilizados 1 M CaCl 2. loja a 4 ° C.</li>
	<li>Prepare a solução-mãe de calceína-AM, acrescentando 50 µ l de DMSO para 50 µ g de calceína-AM no recipiente plástico fornecido pelo fabricante. Loja a-20 ° C.</li>
</ol>2. o crescimento e manutenção das amebas
<ol><li>Cresce Escherichia coli estirpe b/r17 como fonte de alimento para as amebas durante o período de crescimento inicial. Raia Escherichia coli b/r de um estoque congelado armazenado a-80 ° C em uma placa de ágar LB e incubar a 37 ° C durante a noite para obter colônias única.</li>
	<li>Inocular uma única colônia de e. coli b/r em 2 mL de meio LB e incubar durante uma noite em um tambor de cilindro ou um agitador a 37 ° C.</li>
	<li>Trazer o pernoite cultura de e. coli para a temperatura ambiente. Usando uma vara de madeira, inocule as amebas de um estoque congelado mantida a-80 ° C em 750 µ l de cultura durante a noite. Nota: Use d. discoideum estirpe AX3, que é capaz de crescimento axénica18. Esta etapa não requer crescimento axénica, mas as etapas subsequentes, terão sua exigência.</li>
	<li>Imediatamente adicione 700 µ l de amebas -Escherichia coli mistura em um prato de glicose levedura peptona (cigano). Difundir a cultura uniformemente sobre a superfície da placa, inclinando-se e para trás e de lado conforme necessário. Evite o uso de um difusor.</li>
	<li>Coloque a placa de cigano com agar para cima em uma caixa que mantém a umidade elevada. Use dois recipientes de plástico descartáveis (183 x 183 cm x 91 cm) empilhadas no topo de um ao outro. Encha o recipiente de fundo com cerca de 25 mL de água e coloque o recipiente superior com vários 0,5 cm de diâmetro furos através do revestimento do recipiente para permitir que a umidade mover o reservatório de água para o recipiente superior.</li>
	<li>Incube a placa de cigano e caixa a 22 ° C por 4-5 dias até ameba esporos são observados crescendo perto da superfície da placa (Figura 2). Use uma incubadora refrigerada para incubar as placas, ao invés de incubação à temperatura ambiente. Nota: Depois de esporos têm crescido, eles permanecem viáveis em placas durante várias semanas, quando armazenadas a 4 ° C. Armazene as placas com agar para cima. Após 3-4 dias de incubação, zonas de clareira dentro do gramado bacteriana podem ser observadas, que indicam o início de esporulação de ameba.<ol>
<li>Observe as amebas pequenas esporos acima da superfície da placa após 4-5 dias de incubação (Figura 2). Nota: Não crescem as amebas por mais de uma semana, como a qualidade dos esporos diminui além deste período de tempo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Colete esporos de amebas para se preparar para o crescimento axénica das amebas varrendo uma ponta da pipeta estéril mL 1 paralela à superfície da placa. Colete os esporos de metade de uma placa de Petri de 10 cm. Nota: Evite tocar a superfície da placa de ágar como este movimento irá recolher um grande número de Escherichia coli.</li>
	<li>Resuspenda as amebas na ponta da pipeta por imergindo a ponta em 1 mL de meio de PS e suavemente pipetagem para cima e para baixo.</li>
	<li>Transfira a mistura inoculada em um frasco de 250 mL contendo 25 mL do meio de PS, suplementado com a antibiótico antimicótico solução na concentração de x 0,25. Nota: Guarde a solução antibiótico antimicótico como 250 alíquotas µ l a-20 ° C. Evite ciclos repetidos de congelamentos e descongelamentos desta solução como isto pode diminuir sua eficácia.</li>
	<li>Crescem as amebas axenically a 22 ° C, em um agitador rotativo a 100 rpm. Para o ensaio de virulência na etapa 5, desenvolvem-se células para uma densidade óptica medida em 600 nm (OD600) de 0,2 a 0,5. Nota: Esta etapa exige 3-4 dias de crescimento desde o momento da inoculação (passo 2.7). Se as células têm crescido de uma densidade mais elevada, diluir a cultura no médio e PS uma OD600 de 0,05 ou inferior e crescer para uma OD600 de 0,2 a 0,5.</li>
</ol>3. o crescimento de p. aeruginosa
<ol><li>Escolher uma única colônia de p. aeruginosa de uma placa LB, inoculá-lo em um 2 mL PS:DB cultura e crescer durante a noite a 37 ° C, a saturação. Nota: Não adicione a solução de antibiótico antimicótico para a mídia PS:DB.</li>
	<li>Dilua a 1: 100 de cultura durante a noite ou 1:1,000 em um prato de Petri de 6 cm de diâmetro usando PS:DB. Se a virulência das células planctônicas unicamente está sendo analisada, crescem as culturas utilizando tubos de cultura convencional em vez disso. Agite a cultura em rotacao bancada fixado em 100 rpm a 37 ° C.</li>
	<li>Colheita de culturas em pontos de tempo específico para garantir a reprodutibilidade. A 30 min a 1 h antes de avaliar a virulência, prepare uma almofada de ágar, conforme descrito na seção 4. Nota: Virulência em p. aeruginosa é induzida por cerca de 8 h de crescimento em superfícies.</li>
	<li>Para isolar as células conectado à superfície, retire o prato de Petri o meio líquido, lavar imediatamente com 1 mL de tampão de DB para remover células planctônicas e proceder de imediato à etapa 5.1. Atenção: Não lave mais de 30 s como este irá perturbar e desanexar conectado à superfície de células e pode afetar a medição de virulência.</li>
	<li>Para isolar as células planctônicas, transferir 10 µ l da cultura da caixa de Petri para um prato de Petri limpo e proceder de imediato à etapa 5.1.</li>
</ol>4. microscopia - preparação do ágar Pad
<ol><li>Prepare-se almofadas de ágar cerca de 30 min a 1 h antes de amebas estão prontas para ser misturado com p. aeruginosa.</li>
	<li>50 mL de ágar de 1% (p/v) em tampão de DB em um balão de 250 mL de microondas. Mix cada 20 s até grupos de ágar desaparecer.</li>
	<li>Legal o ágar fundido, colocando-o num banho de água pré-aquecida a 55 ° C por 15 min.</li>
	<li>Adicione 15 µ l de solução-mãe calceína-AM a 15 mL de ágar fundido em um tubo cônico. Misture suavemente invertendo o tubo-4 - 5 vezes e dirijam-se para a próxima etapa. Nota: Execute esta etapa em um tubo de centrífuga de polipropileno 15 mL. Não utilize um recipiente de vidro grosso como isso fará com que o ágar solidificar demasiado rapidamente.</li>
	<li>Despeje a mistura de ágar derretido em cima de uma placa de vidro de 12 cm x 10 cm e permitir que o ágar solidificar durante 10 minutos à temperatura ambiente. Corte o bloco de ágar solidificado em seções menores de 1,5 x 1,5 cm, colocando a placa de vidro sobre uma grade impressa e corte ao longo da grade usando uma régua de metal.</li>
	<li>Manter o gel hidratado em uma caixa de úmido, até que esteja pronto para uso.</li>
</ol>5. microscopia - preparação da amostra bactérias-ameba para a imagem latente
<ol><li>Para ensaiar a virulência das células bacterianas conectado à superfície, adicione 10 µ l de células de ameba de passo 2.10 para bactérias conectado à superfície da etapa 3.4. Nota: Este passo descreve a mistura de amebas com bactérias.</li>
	<li>Para ensaiar a virulência das células planctônicas, misture 10 µ l de células de ameba da etapa 2.10 com 10 µ l de bactérias planctônicas da etapa 3.5. Nota: Não lave as células cultivadas axenically ameba (em um OD de600 de 0,2-0,5) antes de misturar com as bactérias. Não há crescimento de Escherichia coli será observado na cultura ameba devido ao uso da solução de antibiótico antimicótico.</li>
	<li>Imediatamente, coloque a almofada de ágar de calceína-AM de 1,5 x 1,5 cm da etapa 4.5 em cima a mistura de bactérias-ameba na superfície do prato de Petri. Nota: Coloque a almofada de ágar em cima a mistura usando um movimento rápido e suave. Não inferiores a almofada lentamente na mistura como este movimento tende a empurrar as células em direção a periferia e longe da parte de baixo da almofada. Esta etapa irá garantir que as bactérias e as amebas são uniformemente misturado, imobilizada e que os dois tipos de células estão confinados ao mesmo plano.</li>
	<li>Remova o excesso de líquido pipetando suavemente para fora de qualquer líquido restante em torno do bloco de ágar. Permitir que a placa de Petri secar por 20 min em temperatura ambiente.</li>
	<li>Cubra com o prato de Petri com uma tampa e incubar a mistura de ameba-bactérias imobilizadas em temperatura ambiente por um adicional 40 min. prosseguir para a etapa 6.1. Nota: É importante incubar todas as amostras para a mesma quantidade de tempo, como o plano de fundo da fluorescência aumenta ao longo do tempo. Recomenda-se um tempo de incubação de 1 h. Incubação por mais de 1h é menos reprodutível como células de amebas podem começam a estourar.</li>
</ol>6. microscopia - aquisição de imagem
<ol><li>Amebas de imagem usando um microscópio de fluorescência, capaz de adquirir imagens de fluorescência brightfield e verde. Para fluorescência verde, use filtros de proteína (GFP) fluorescência verde com 474/27 nm e 525/45 nm de excitação e emissão, respectivamente. Use um objectivo de (≥0.3 abertura numérica) X 10 para as amebas de imagem. Nota: O calceína-AM em agar causará amebas morrendo de fluorescência no canal de fluorescência verde. Amebas saudáveis, caso contrário não são fluorescentes.</li>
	<li>Ajuste os tempos de aquisição para o contraste de fase, canais GFP limitar fototoxicidade e otimizar a gama dinâmica das intensidades da imagem. Se necessário, substitua o contraste de fase de contraste (DIC) de interferência diferencial. Nota: Use exposições de 100-200 ms para contraste de fase e fluorescência de GFP, se possível. Manter as configurações de exposição e instrumento inalteradas ao longo de todo o experimento. Isto é crítico para o cálculo do índice de matar o hospedeiro.</li>
	<li>Adquira imagens pelo menos 100 células de ameba a fim de obter boas estatísticas para calcular o host índice de mortes.</li>
</ol>7. análise e índice de mortes de Host de imagem
<ol><li>Realizar análise de imagem usando o ImageJ.</li>
	<li>Abra o arquivo de imagem de contraste de fase em ImageJ clicando no arquivo | Abra e selecionar a imagem. Ajustar o limite clicando na imagem de | Análise | Limiar de. Ajuste o limite superior e inferior para selecionar somente o pico de intensidade(Figura 3).</li>
	<li>Converter a imagem para binário clicando processo | Binário | Tornar binário. Preencher os buracos, selecionando processo | Binário | Preencher os buracos. Nota: Usando a imagem na Figura 1 como a fonte, etapas 7.1-7.2 produzirá uma imagem na qual as amebas e bactérias conectado à superfície aparecem como regiões escuras (Figura 3B).</li>
	<li>Certifique-se de que as caixas da área e quer dizer valor cinza são verificadas em Analyze | Definir medidas. Medir o tamanho aproximado das amebas, selecionando a ferramenta oval na barra de ferramentas principal. Clique em analisar | Medida e observe a área de amebas representativas.</li>
	<li>Criar máscaras para as amebas clicando Analyze | Analisar as partículas. Na caixa tamanho, digite a área que irá incluir as amebas mas excluir as bactérias. Selecione máscaras na barra de menus dropdown para a opção de mostrar. Certifique-se de que a caixa Adicionar ao Gerenciador é verificada.</li>
	<li>Clique Okey e uma imagem mostrando apenas as amibas e um gerente de ROI diálogo aparecerá (Figura 3C).</li>
	<li>Abra a imagem de fluorescência usando arquivo | Abra e selecionando o arquivo apropriado. Selecione todas as regiões no ROI Manager mantendo pressionada a tecla Shift e clicar em cada região na lista (Figura 3-D).</li>
	<li>Clique no botão de medida no ROI Manager. Isto irá abrir uma janela de resultados, exibindo o valor de intensidade média de cada ameba.</li>
	<li>Copiar os valores de fluorescência para cada ameba em um programa de planilha e calcular o host matando o índice, tendo a média de todos os valores de fluorescência.</li>
</ol>

<ol><li>Rasko, D. A., Sperandio, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-virulence+strategies+to+combat+bacteria-mediated+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Anti-virulence strategies to combat bacteria-mediated disease.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 9 (2), 117-128 (2010).</li>
<li>Coburn, B., Grassl, G. A., Finlay, B. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salmonella%2C+the+host+and+disease%3A+a+brief+review%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Salmonella, the host and disease: a brief review.</a> Immunology and Cell Biology. 85 (2), 112-118 (2007).</li>
<li>Alibaud, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+virulence+genes+identified+in+a+Dictyostelium+host+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa virulence genes identified in a Dictyostelium host model.</a> Cellular Microbiology. 10 (3), 729-740 (2008).</li>
<li>Pukatzki, S., Kessin, R. H., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+human+pathogen+Pseudomonas+aeruginosa+utilizes+conserved+virulence+pathways+to+infect+the+social+amoeba+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The human pathogen Pseudomonas aeruginosa utilizes conserved virulence pathways to infect the social amoeba Dictyostelium discoideum.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 99 (5), 3159-3164 (2002).</li>
<li>Cosson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+Virulence+Analyzed+in+a+Dictyostelium+discoideum+Host+System%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa Virulence Analyzed in a Dictyostelium discoideum Host System.</a> Journal of Bacteriology. 184 (11), 3027-3033 (2002).</li>
<li>Pukatzki, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+conserved+bacterial+protein+secretion+system+in+Vibrio+cholerae+using+the+Dictyostelium+host+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of a conserved bacterial protein secretion system in Vibrio cholerae using the Dictyostelium host model system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 103 (5), 1528-1533 (2006).</li>
<li>Steinert, M., Heuner, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15679834">Dictyostelium as host model for pathogenesis.</a> Cellular Microbiology. 7 (3), 307-314 (2005).</li>
<li>Hagele, S., Kohler, R., Merkert, H., Schleicher, M., Hacker, J., Steinert, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dictyostelium+discoideum%3A+a+new+host+model+system+for+intracellular+pathogens+of+the+genus+Legionella%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Dictyostelium discoideum: a new host model system for intracellular pathogens of the genus Legionella.</a> Cellular Microbiology. 2 (2), 165-171 (2000).</li>
<li>Matz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+uses+type+III+secretion+system+to+kill+biofilm-associated+amoebae%5BTitle%5D)+AND+%22ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa uses type III secretion system to kill biofilm-associated amoebae.</a> ISME Journal. 2 (8), 843-852 (2008).</li>
<li>Hauser, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+type+III+secretion+system+of+Pseudomonas+aeruginosa%3A+infection+by+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The type III secretion system of Pseudomonas aeruginosa: infection by injection.</a> Nature Reviews Microbiology. 7 (9), 654-665 (2009).</li>
<li>Moore, P. L., MacCoubrey, I. C., Haugland, R. P. A rapid pH insensitive, two color fluorescence viability (cytotoxicity) assay. Journal of Cell Biology. 111, Abstract 304 58(1990).</li>
<li>Kaneshiro, E. S., Wyder, M. A., Wu, Y. -P., Cushion, M. T. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0167701293800104">Reliability of calcein acetoxy methyl ester and ethidium homodimer or propidium iodide for viability assessment of microbes.</a> Journal of Microbiological Methods. 17 (1), 1-16 (1993).</li>
<li>Siryaporn, A., Kuchma, S. L., O'Toole, G. A., Gitai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+attachment+induces+Pseudomonas+aeruginosa+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Surface attachment induces Pseudomonas aeruginosa virulence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 111 (47), 16860-16865 (2014).</li>
<li>Decherchi, P., Cochard, P., Gauthier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+staining+assessment+of+Schwann+cell+viability+within+whole+peripheral+nerves+using+calcein-AM+and+ethidium+homodimer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Dual staining assessment of Schwann cell viability within whole peripheral nerves using calcein-AM and ethidium homodimer.</a> Journal of Neuroscience Methods. 71 (2), 205-213 (1997).</li>
<li>Braut-Boucher, F., Pichon, J., Rat, P., Adolphe, M., Aubery, M., Font, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-isotopic%2C+highly+sensitive%2C+fluorimetric%2C+cell-cell+adhesion+microplate+assay+using+calcein+AM-labeled+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">A non-isotopic, highly sensitive, fluorimetric, cell-cell adhesion microplate assay using calcein AM-labeled lymphocytes.</a> Journal of Immunological Methods. 178 (1), 41-51 (1995).</li>
<li>Grieshaber, P., Lagrèze, W. A., Noack, C., Boehringer, D., Biermann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+of+fluorogold-prelabeled+retinal+ganglion+cells+with+calcein-AM%3A+A+new+method+for+assessing+cell+vitality%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Staining of fluorogold-prelabeled retinal ganglion cells with calcein-AM: A new method for assessing cell vitality.</a> Journal of Neuroscience Methods. 192 (2), 233-239 (2010).</li>
<li>Witkin, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inherited+Differences+in+Sensitivity+to+Radiation+in+Escherichia+Coli%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Inherited Differences in Sensitivity to Radiation in Escherichia Coli.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 32 (3), 59-68 (1946).</li>
<li>Loomis, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensitivity+of+Dictyostelium+discoideum+to+nucleic+acid+analogues%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Sensitivity of Dictyostelium discoideum to nucleic acid analogues.</a> Experimental Cell Research. 64 (2), 484-486 (1971).</li>
<li>Rahme, L. G., Stevens, E. J., Wolfort, S. F., Shao, J., Tompkins, R. G., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+virulence+factors+for+bacterial+pathogenicity+in+plants+and+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Common virulence factors for bacterial pathogenicity in plants and animals.</a> Science. 268 (5219), 1899-1902 (1995).</li>
<li>O'Loughlin, C. T., Miller, L. C., Siryaporn, A., Drescher, K., Semmelhack, M. F., Bassler, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quorum-sensing+inhibitor+blocks+Pseudomonas+aeruginosa+virulence+and+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (44), 17981-17986 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Este protocolo descreve um método rápido e quantitativo para ensaio de virulência em p. aeruginosa. Este protocolo pode ser testado com outras bactérias. No entanto, é importante ter em mente que o meio de crescimento deve ser compatível com as condições de crescimento de ameba. Em particular, otimizamos o protocolo usando PS:DB como meio de crescimento bacteriano. Se forem utilizados outros meios de comunicação, pode ser necessário realizar um controle de somente mídia de crescimento em que não há nenhuma célul...

Infecção bacteriana é uma das principais causas de mortalidade em humanos e animais,1,2. A capacidade de medir a virulência de bactérias em culturas ou biofilmes é importante em contextos de cuidados de saúde e pesquisa. Aqui, descrevemos um método relativamente simples, rápido e versátil para quantificar a virulência bacteriana. O organismo eucariótico Dictyostelium discoideum (ameba) é usado como o organismo hospedeiro do modelo. D. discoideum tem sido usado como um host para identificar fatores de virulência em Pseudomonas aeruginosa (p. aeruginosa)3,4,5 e outras bactérias6,7 ,8 e é suscetível a em grande parte os mesmos fatores de virulência que matam células de mamíferos incluindo tipo III secreção9,10. Ensaios de virulência anterior usando d. discoideum envolveram exposição prolongada de bactérias com células de d. discoideum ao longo de horas3,4,5. O protocolo, aqui, apresenta um método rápido de determinar a virulência usando essa ameba. Este protocolo (Figura 1) descreve como: (1) crescem as amebas axenically (na ausência de bactérias), (2) crescer bactérias para o ensaio, (3) preparar as bactérias e células hospedeiras para microscopia, (4) realizar microscopia de epifluorescência e (5) analisar ameba fluorescência.
Amebas são inicialmente listradas fora dos estoques congelados e crescidas em um gramado de Escherichia coli (e. coli), onde as amebas produzem esporos. Estes esporos são escolheu e inoculados em um meio enriquecido para o crescimento axénica. As amebas são mantidas através de crescimento axénica em condições ricas em nutrientes até que estejam prontos para serem misturados com as bactérias para a avaliação de virulência bacteriana. A sobrevivência ou a morte das amebas é quantificada pela medição da fluorescência de calceína-acetoximetil (calceína-AM), que é clivada por esterases intracelulares e, desse modo, ativado por fluorescência11,12. Ao vivo amebas apresentam pouca ou nenhuma fluorescência Considerando que salientou e células morrendo brilham intensamente. Este resultado é devido a uma pequena ou nenhuma incorporação de calceína-AM em amibas saudáveis e incorporação e clivagem do substrato em amibas estressado13. Esse comportamento é notavelmente diferente da fluorescência de calceína-AM em células de mamíferos11,14,15,16.
Bactérias que serão avaliadas para virulência são cultivadas separadamente. Aqui, descrevemos como medir a virulência do patógeno oportunista p. aeruginosa e detalhe como quantificar a virulência de planctônica (natação) e as subpopulações conectado à superfície. Este protocolo pode ser adaptado para testar a virulência de outras bactérias. Na seção de resultados de representante, mostramos que virulência é ativada nas células conectado à superfície e baixa em células planctônicas, que foi relatado anteriormente13. Virulência-ativado conectado à superfície de p. aeruginosa mata amebas enquanto não-virulenta células planctônicas são consumidas pelas amebas. Se a virulência das bactérias planctônicas unicamente está sendo analisada, as bactérias podem ser cultivadas em tubos de cultura comum, ao invés de usar placas de Petri, conforme descrito no protocolo.
O crescimento das amebas e p. aeruginosa culturas deve ser coordenado, tal que p. aeruginosa culturas alcançar a fase de crescimento pretendido enquanto as amebas estão crescendo no estado estacionário em condições ricas em nutrientes. Esta condição geralmente requer culturas amebas para ser diluído pelo menos 1 dia antes de quando eles são misturados com bactérias. Amebas e bactérias são imobilizadas usando almofadas de ágar, são incubadas co por 1h e fotografaram usando uma resolução baixa (10 X, abertura numérica 0.3) filtra proteínas fluorescência objetiva, verde (GFP) e uma câmera de imagens. Análise pode ser realizada usando disponível gratuitamente software ImageJ ou personalizado software de análise de imagem. Nossa análise foi realizada usando nosso próprio software escrito usando um pacote de análise científica13. O software deve criar uma máscara usando a imagem de contraste de fase e extrair valores de fluorescência das áreas mascaradas na imagem de fluorescência. Valores de fluorescência são calculados pelo menos 100 células, resultando em um índice de mortes de anfitrião numérica.

<table><tbody><tr><td><forte>Reagentes</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ágar Bacto, desidratado</td><td>BD Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico-Antimicótico (100X)</td><td>Life Technologies</td><td>15240062</td><td>Alíquota < 1 mL e armazenar a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Éster de calceína-acetoximetílico (calceína-AM)</td><td>Life Technologies</td><td>C34852</td><td>Calceína Acetoximetil (AM)</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio, anidro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Chemical</td><td>D16500</td><td>Dextrose</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fólico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8758</td><td></td></tr><tr><td>LB-Miller</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Oxóide</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>Peptona especial</td><td>Oxóide</td><td>LP0072</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de potássio</td><td>Fisher Chemical</td><td>P250</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0662</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico heptahidratado</td><td>Fisher Chemical</td><td>S373</td><td></td></tr><tr><td>Vitamina B12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V2876</td><td></td></tr><tr><td>Cepas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dictyostelium discoideum</td><td>Siryaporn lab</td><td>Cepa AX318</td><td></td></tr><tr><td>Escherichia coli</td><td>Laboratório Siryaporn</td><td>Cepa B/r17</td><td></td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa</td><td>Laboratório Siryaporn</td><td>Cepa PA14</td><td>PA1419</td></tr><tr><td>Pseudomonas aeruginosa &Delta; lasR</td><td>Siryaporn lab</td><td>AFS20.1</td><td>Cepa derivada de PA1420</td></tr><tr><td>Suprimentos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro; Filtro M&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>SCGPT01RE</td><td>Para esterilização por filtro</td></tr><tr><td>Tubo cônico, 15 mL</td><td>Corning</td><td>352097</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de armazenamento de vidro</td><td>Pyrex</td><td>13951L</td><td>250 mL, 500 mL, 1000 mL</td></tr><tr><td>Placa de Petri, 6 cm de diâmetro</td><td>Corning</td><td>351007</td><td>60 x 15 mm placas de poliestireno</td></tr><tr><td>Placa de Petri, 10 cm de diâmetro</td><td>Fisher</td><td>FB0875712</td><td>placas de poliestireno de 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>Recipientes de plástico com tampa</td><td>Ziploc</td><td>2.57E+09</td><td>Recipientes quadrados de 3 xícaras</td></tr><tr><td>Placas de vidro</td><td>Bio-Rad</td><td>1653308</td><td>Para preparar almofadas de ágar. Outras placas de vidro podem ser usadas com dimensões semelhantes.</td></tr><tr><td>Varetas de madeira</td><td>Fisher</td><td>23-400-102&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td><forte>Equipamento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Ti-E microscópio&nbsp;</td><td>Configuração</td><td>do microscópio Nikon MEA53100</td><td></td></tr><tr><td>10X Plan Fluor Ph1 objetiva&nbsp; 0.3 NA</td><td>Configuração</td><td>do microscópio Nikon MRH20101</td><td></td></tr><tr><td>Fonte de excitação de fluorescência</td><td>Motor de luz</td><td>Lumencor</td> Sola <td>Configuração do microscópio</td></tr><tr><td>Conjunto de filtros de fluorescência</td><td>Semrock</td><td>LED-DA/FI/TX-3X3M-A-000&nbsp;</td><td>Configuração do microscópio</td></tr><tr><td>Orca Flash 4.0 V2 Camera</td><td>Hamamatsu</td><td>77054098</td><td>Configuração do microscópio</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>v. 1.49</td><td>Software para análise de imagens</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td>R2013</td><td>Software para análise de imagens</td></tr><tr><td>Incubadora de agitadores orbitais</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td>Para crescimento de bactérias a 37 &graus; C</td></tr><tr><td>Agitador de plataforma</td><td>Fisher</td><td>13-687-700</td><td>Para crescimento de amebas a 22 &deg; C</td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 10</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora refrigerada de bancada</td><td>Fisher</td><td>97990E</td><td>Para crescimento de amebas a 22 &deg; C</td></tr><tr><td>Banho-maria Isotemp</td><td>Fisher</td><td>15-462-21Q</td><td>Para meios de resfriamento até 55 &graus; O</td></tr></tbody></table>

um ensaio rápido de virulência bacteriana baseada em imagem usando ameba

A Rapid Image-based Bacterial Virulence Assay Using Amoeba

Ensaios de virulência bacteriana tradicionais envolvem exposição prolongada de bactérias ao longo de várias horas para células hospedeiras. Durante este tempo, as bactérias podem sofrer alterações na fisiologia devido a exposição ao ambiente de crescimento de host e a presença de células hospedeiras. Desenvolvemos um ensaio para avaliar rapidamente o estado de virulência de bactérias que podem minimizar a extensão a que as bactérias crescem na presença de células hospedeiras. As bactérias e as amebas são misturadas e imobilizadas em um avião de imagem usando um bloco de ágar. O procedimento usa imagens de fluorescência de célula única com calceína-acetoximetil éster (calceína-AM) como um indicador da saúde de célula do hospedeiro. A fluorescência das células do hospedeiro é analisada após 1 h de exposição das células do hospedeiro para bactérias usando microscopia de epifluorescência. Software de análise de imagem é usado para calcular um índice de mortes do anfitrião. Este método tem sido usado para medir a virulência dentro planctônicos e conectado à superfície Pseudomonas aeruginosa sub-populações durante o estágio inicial de formação de biofilme e pode ser adaptado para outras bactérias e outras fases de crescimento do biofilme. Este protocolo fornece um método rápido e robusto de virulência de medição e evita muitas das complexidades associadas ao crescimento e manutenção de linhas de células de mamíferos. Fenótipos de virulência medidos aqui usando amebas também foram validados usando macrófagos de rato. Em particular, este ensaio foi usado para estabelecer essa virulência de upregulates acessório superfície em p. aeruginosa.

Nós crescemos selvagem-tipo p. aeruginosa esforçar PA1419 ou um Δúltima estirpe20 no mesmo fundo PA14 em pratos de Petri 6 cm de diâmetro e analisada a virulência das células planctônicas e conectado à superfície. Culturas foram inoculadas de single-colônias em culturas PS:DB, crescidas durante a noite em tubos de cultura em um tambor de cilindro, a 37 ° C, a saturação, diluído 1: 100 em PS:DB, cultivado para 8 h em pratos ...

Aqui, apresentamos um protocolo para medir a virulência das bactérias planctônicas ou conectado à superfície usando d. discoideum (ameba) como um host. Virulência é medida durante um período de 1h e anfitrião matando é quantificada usando análise de imagem e de microscopia de fluorescência. Vamos demonstrar a este protocolo utilizando a bactéria p. aeruginosa.

Um ensaio rápido de virulência bacteriana baseada em imagem usando ameba

Traditional bacterial virulence assays involve prolonged exposure of bacteria over the course of several hours to host cells. During this time, bacteria ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da patogênese bacteriana, como quando os efetores de virulência que matam o hospedeiro são expressos em células bacterianas e quais são os estados de virulência das células implantônicas anexadas à superfície? A principal vantagem dessa técnica é que ela é rápida, quantitativa e as células hospedeiras são relativamente fáceis de manusear. Tivemos a ideia para este método pela primeira vez quando notamos que a subpopulação implantônica de Pseudomonas anexada à superfície tem diferentes fenótipos de matança de hospedeiros.Para começar a cultivar E.coli cepa BR durante a noite, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, leve a cultura de E.coli à temperatura ambiente. Usando uma vara de madeira, inocule a ameba em 750 l da cultura.Adicione imediatamente 700 l da mistura de ameba E.coli a uma placa GYP. Incline a placa para espalhar a cultura uniformemente na superfície da placa. Em seguida, coloque o prato em uma caixa que mantenha alta umidade.Incube a placa dentro da caixa a 22 C por quatro a cinco dias. Após o término do período de incubação, use uma ponta de pipeta estéril para coletar esporos de ameba da meta

a-rapid-image-based-bacterial-virulence-assay-using-amoeba

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioengenharia

Fonte: Morales-Soto, N. et. al., Preparação, Imagem e Quantificação de Ensaios de Motilidade de Superfície Bacteriana. J. Vis. Exp. (2015)Este vídeo demonstra um ensaio de enxame usando bactérias que expressam proteína fluorescente verde para observar a motilidade da superfície em ágar macio. A imagem de lapso de tempo captura a expansão coordenada e a formação de gavinhas, destacando a motilidade da superfície bacteriana.

Ensaio de enxame para visualização da motilidade da superfície bacteriana

Fonte: Chen, Y., et al. Avaliando a Virulência e Patogênese da Infecção por Aeromonas em um Modelo de Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2018).Este vídeo demonstra o Ensaio de Toxicidade Líquida de C. elegans com Aeromonas, um método usado para avaliar a virulência bacteriana medindo a sobrevivência de vermes em um ambiente líquido com poucos nutrientes. O ensaio revela patogenicidade específica da cepa com base na extensão do dano induzido por toxinas e na mortalidade em C. elegans.

Avaliação da Virulência Bacteriana Usando o Ensaio de Toxicidade Líquida C. elegans

Fonte: Perinbam, K., e Siryaporn, A. Um ensaio rápido de virulência bacteriana baseado em imagem usando ameba. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra um método rápido baseado em imagens para avaliar a virulência bacteriana, incubando amebas com bactérias presas à superfície ou planctônicas, aplicando uma pastilha de agarose de calceína-acetoximetil (calceína-AM) e imagens de fluorescência para detectar danos à célula hospedeira.

Um ensaio rápido baseado em imagem para triagem de virulência bacteriana induzida por superfícies

Source: Dubois, V., et al. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the procedure of co-culturing amoebae with mutant bacterial strains to evaluate their intracellular survival and identify virulence markers through differences in colony counts.

Detecting Bacterial Virulence Using Amoeba as a Host System

Este vídeo demonstra um ensaio para quantificar o crescimento intracelular de parasitas em macrófagos derivados da medula óssea (BMMs). As células de macrófagos estão infectadas com os estágios invasivos móveis e imóveis de Leishmania, promastigotas metacíclicos e amastigotas, respectivamente. Os parasitas invadem os macrófagos, internalizando-se em um vacúolo parasitóforo e se multiplicando em seu interior. O crescimento do parasita intracelular é quantificado usando um microscópio após a...

Um ensaio in vitro para quantificar o crescimento intracelular do parasita em macrófagos

Descreve-se um ensaio qualitativo para monitorar competição bacteriana mediada...

Um Ensaio visual para o Monitor T6SS mediada Competição bacteriana

Descreve-se um método para controlar a ruptura endomembranar provocada pelas bactérias...

Medidas de ruptura vacuolar única célula causadas por patógenos intracelulares

Esta técnica proporciona um método para colher, normalizar e quantificar o crescimento intracelular das bactérias, que são pré-cultivadas em células hospedeiras naturais protozoários antes da infecção de células de mamíferos. Este método pode ser modificado para acomodar uma grande variedade de células hospedeiras para a fase de escorvamento, bem como tipos de células-alvo.

Tratáveis ​​mamíferos Infecções celulares com Protozoário-condicionadas Bactérias

Cocultura amebas é um sistema de cultura de células usando as amebas aderente para crescer selectivamente patogénios intracelulares capazes de resistir as células fagocíticas, tais como amebas e macrófagos. Representa, portanto, uma ferramenta-chave para descobrir novos agentes infecciosos. Enriquecimento amebas permite a descoberta de novas espécies de amebas e das suas bactérias intracelulares específicos.

Descoberta de Novos intracelulares Patógenos por amebas Coculture e Abordagens de amebas de enriquecimento

Descrevemos aqui os últimos avanços no isolamento viral para a caracterização de novos genótipos de Faustovirus, uma nova linhagem de vírus gigantes relacionada ao asfarvirus. Este protocolo pode ser aplicado ao isolamento de alto rendimento de vírus, especialmente vírus gigantes que infectam ameba.

Uma estratégia rápida para o isolamento de novos Faustoviruses de amostras ambientais Usando<em&gt; vermiformis Vermamoeba</em

Este procedimento descreve como visualizar, rastrear e quantificar Acanthamoeba spp. motilidade.

Quantificação de Acanthamoeba spp. Motilidade

Aprenda a medir a virulência bacteriana rapidamente usando D. discoideum como hospedeiro e microscopia de fluorescência. Este método quantitativo permite analisar efeitos de morte celular em apenas uma hora.

Um ensaio rápido de virulência bacteriana baseada em imagem usando ameba

Explorar mais vídeos