Um método invasivo para a ativação do giro denteado do Mouse pela estimulação de alta frequência

O objetivo geral deste experimento é observar o efeito da estimulação de alta frequência na atividade neuronal na neurogênese. Este método pode ajudar a responder a questões-chave em mecanismos celulares e moleculares alinhados de estimulação cerebral profunda de alta frequência, como a indução da atividade neuronal e a neurogênese no hipocampo. A vantagem dessa técnica é que ela demonstra o poderoso efeito da TBS de alta frequência na atividade dos neurônios e na neurogênese no cérebro adulto.

Embora esse método possa fornecer informações sobre os efeitos da TBS de alta frequência no giro dentado do camundongo, ele também pode ser aplicado a outros sistemas, como os gânglios da base e as regiões subtalâmicas, para os distúrbios cerebrais na clínica. Para iniciar este procedimento, coloque um mouse anestesiado no quadro estereotáxico. Alinhe as faixas auriculares com a cabeça e aperte-as suavemente para apoiar a cabeça centralizada.

Segure a pele anterior às orelhas e remova cerca de um centímetro quadrado sobre o crânio. Em seguida, remova o músculo e outros acessórios que cobrem o crânio com um cotonete para expor a superfície do crânio. Em seguida, aplique solução de peróxido de hidrogênio para secar o crânio para identificar as linhas de sutura sagital e lambda.

Em seguida, identifique o bregma e o lambda. O ponto bregma será usado como o ponto original para definir a posição do núcleo. Depois disso, nivele o crânio no plano horizontal usando esses dois pontos.

Certifique-se de que as alturas desses dois pontos sejam quase as mesmas no plano ventral dorsal. Além disso, certifique-se de que o crânio esteja nivelado no plano lateral medial. Em seguida, monte um eletrodo de micro fio de cobre caseiro de dois canais no suporte do eletrodo rotativo na estrutura cirúrgica estereotáxica.

Coloque o eletrodo diretamente acima do bregma e defina-o como local original. Em seguida, mova o eletrodo suavemente para a posição correta acima do crânio, sem tocá-lo. Use o display digital na estrutura cirúrgica estereotáxica para indicar as posições anterior posterior, medial lateral e dorsoventral.

Quando o local desejado for identificado para a inserção do eletrodo, marque a posição com um marcador preto. Em seguida, use os ajustes estereotáxicos dorsoventral para levantar o porta-eletrodo. Em seguida, esterilize a broca com 70% de etanol.

Use uma broca assistida por micromanipulador portátil, faça um furo de rebarba precisamente na posição marcada. Use um cotonete estéril para parar qualquer sangramento durante a operação. Continue perfurando até que a dura-máter esteja exposta.

Use uma agulha dobrada para remover quaisquer restos ósseos gerados durante a perfuração e faça um orifício na dura-máter sem danificar o tecido cerebral mole subjacente. Para confirmar que o orifício da rebarba está feito corretamente na posição desejada, abaixe o eletrodo para certificar-se de que ele seja inserido suavemente pelo orifício da rebarba, sem tocar em nenhum obstáculo. Se nenhuma resistência for detectada, insira lentamente o eletrodo na profundidade alvo a partir da superfície do crânio.

Em seguida, aplique cimento dental usando uma pequena espátula para manter o eletrodo no lugar. À medida que o cimento engrossa, molde-o ao redor do eletrodo inserido e de outros parafusos ósseos para formar uma tampa bonita e lisa. Em seguida, desengate o eletrodo do suporte do eletrodo.

Remova o mouse do quadro estereotáxico e coloque-o de volta em uma gaiola quente. Deixe o rato se mover livremente e deixe-o se recuperar por dois dias na gaiola. Para fornecer estimulação, conecte o eletrodo implantado a um estimulador programável por meio de eletrodos.

Configure a interface do software. Em seguida, defina os parâmetros HFS como seis séries de seis trens de seis pulsos a 400 Hertz e a intensidade de estimulação de 200 miliamperes. Forneça HFS pelo período de tempo desejado, conforme configurado.

Para o grupo de controle, implante eletrodos nos camundongos sem fornecer qualquer estimulação. Para a coloração CFAS, estimule os camundongos experimentais duas vezes por um dia. Para a rotulagem de BrdU, aplique estímulos apropriados tanto ao grupo de estimulação aguda quanto ao grupo de estimulação crônica.

Durante o curso da estimulação, certifique-se de que o mouse esteja acordado. Lembre-se de garantir que os cabos não estejam torcidos. Quando a estimulação estiver concluída, desconecte cuidadosamente o pino do eletrodo do porta-eletrodo no conector do sistema de gravação.

Para a coloração CFAS e notch one, cerca de três horas após o último HFDBS, anestesiar os camundongos injetando pentobarbital para obter um plano cirúrgico de anestesia. Para a marcação de BrdU, cerca de 12 horas após a última estimulação de HFDBS, dê seis injeções de BrdU ao controle e aos camundongos estimulados em intervalos de duas horas. 36 horas após a última injeção, anestesiar profundamente os camundongos com pentobarbital e profundi-lo transcardialmente com 50 mililitros de PBS frio seguido de 50 mililitros de paraformaldeído a 4% frio.

Remova a cabeça e faça uma incisão na pele para expor a habilidade. Usando uma pinça, lasque levemente o crânio e remova cuidadosamente todo o cérebro. Em seguida, após a fixação, o cérebro é de paraformaldeído a 4% por mais dois dias e transfira-o para uma solução de sacarose a 30% a quatro graus Celsius durante a noite.

Usando um criostato, corte o cérebro em seções coronais de 20 mícrons. Transfira e monte as seções na lâmina de vidro com um pincel e guarde-as a menos 20 graus Celsius. Em seguida, transfira as lâminas para PBS normal sem fixador.

Lave as seções com PBS três a quatro vezes por cinco minutos cada para remover o excesso de fixador. Para o grupo marcado com BrdU, incube as seções em dois molares HCL por 30 minutos a 37 graus Celsius e enxágue-as em um tampão de borato molar de 0,1. Após 10 minutos, lave as seções duas vezes em PBS por cinco minutos de cada vez.

Em seguida, incubar as secções em solução de bloqueio durante uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, incube as seções com anticorpo policlonal anti-CFAS, anticorpo anti-entalhe um ou anticorpo anti-BrdU em uma solução de bloqueio a quatro graus Celsius durante a noite. As seções foram três vezes em PBS por 10 minutos de cada vez, depois incubá-las com Alexa Fluor 568 conjugado anti-raivo, Alexa Fluor 488 conjugado anti-cabra ou Alexa Fluor 488 anti-rato conjugado anticorpo secundário por uma hora em temperatura ambiente.

As seções foram três vezes no PBS por 10 minutos de cada vez. Em seguida, cubra as seções cerebrais imunomarcadas usando um meio de montagem de reagente antidesbotamento contendo DAPI. Deixe as seções secarem ao ar e guarde-as protegidas da luz a quatro graus Celsius.

Aqui é mostrado um paradigma experimental para o tratamento com HFS na geração de neurônios proliferantes marcados com BrdU no DG. Os animais foram divididos em um grupo agudo e um crônico para receber diferentes padrões de estimulação. Posteriormente, os animais de ambos os grupos foram injetados com BrdU no sexto dia. No oitavo dia, os animais foram anestesiados e profusos para o preparo dos cortes de criostato.

Aqui estão as imagens da coloração imunofluorescente BrdU pós-HFDBS no DG. Uma análise quantitativa da produção neuronal indicou que a estimulação aguda no GD não poderia aumentar a neurogênese. Enquanto a estimulação crônica no GD aumentou significativamente a neurogênese. Em comparação com o grupo controle, o número de células marcadoras de BrdU aumentou significativamente no grupo crônico, tanto no hemisfério ipsilateral quanto no contralateral.

Estas são as imagens da coloração imunofluorescente BrdU pós-HFDBS na sub-região PP. Uma análise quantitativa da produção neuronal indicou que a estimulação aguda ou crônica no PP não poderia aumentar significativamente a neurogênese. O número de células marcadoras de BrdU foi relativamente estável com ou sem o tratamento com HFS.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de localizar o eletrodo corretamente e fornecer a estimulação com sucesso. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores da área de neurociência estimulação de alta frequência inscritos nos modelos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como fornecer estimulação de alta frequência ao núcleo cerebral profundo.