Onde cortar matérias: Uma dissecção e análise de guia para a orientação espacial da Retina do rato de Marcos Ocular

O objetivo deste protocolo de dissecção é fornecer uma metodologia padronizada para o uso de pontos anatômicos oculares, como os músculos retos, fissura coróide e gradiente de S-opsina para a orientação topográfica da retina do camundongo. A principal vantagem dessas técnicas é que elas fornecem uma maneira confiável de identificar com precisão os pólos dorsal, ventral, nasal e temporal de uma retina isolada de camundongo. Comece identificando um ponto na córnea dorsal próximo à borda da córnea esclera e entre os cânticos nasal e temporal.

Toque na córnea com uma caneta de cautério aquecida por menos de um segundo para criar uma marca de queimadura para fins de orientação. Repita para o segundo olho. A presença da queimadura dorsal permite a identificação do músculo reto superior.

Para enucleação, use uma pinça curva para empurrar suavemente o olho para fora de sua órbita e segurar o globo por baixo. Em seguida, levante lentamente o globo de seu soquete enquanto o move suavemente da esquerda para a direita até que o globo seja liberado do soquete. Transfira o globo com os músculos retos anexados para uma placa de Petri contendo meio de dissecação.

Se estiver trabalhando com os dois olhos, certifique-se de acompanhar qual olho é o olho esquerdo e qual é o olho direito. No escopo da dissecção, localize visualmente a queimadura dorsal da córnea e identifique o músculo reto superior ao qual ela está associada. Usando uma tesoura de dissecção ou uma agulha de calibre 20, perfure a córnea na marca de queimadura.

Em seguida, faça um corte de alívio profundo no globo em direção ao nervo óptico para dividir o músculo superior. Uma retina isolada com este corte é vista aqui, e a retina reconstruída com este corte é mostrada aqui. Use dois conjuntos de pinças para começar a isolar a retina, rasgando suavemente o orifício feito com a punção até que parte da retina fique exposta.

Em seguida, separe a retina da esclera até que a esclera seja completamente removida. Remova a íris, o cristalino, o vítreo e quaisquer estruturas restantes até que a retina esteja completamente isolada. A presença de queimadura dorsal permite a identificação da fissura nasal e temporal da coroide.

Se estiver trabalhando com o olho direito, a fissura coróide nasal está localizada à direita da queimadura e a fissura coróide temporal está localizada à esquerda da queimadura. Isso é o inverso de trabalhar com o olho esquerdo. Para usar o ponto de referência da fissura coróide para identificar a orientação da retina, localize e identifique a fissura coróide na parte de trás do olho.

Oriente o globo de modo que a marca de queimadura dorsal fique localizada no pólo superior, como seria se o olho ainda estivesse no mouse. Em seguida, use uma tesoura de dissecção ou uma agulha de calibre 20 para fazer uma punção no globo, primeiro onde a queimadura dorsal está localizada. Em seguida, faça um corte de alívio raso em direção ao nervo óptico, onde a queimadura dorsal da córnea está localizada.

Em seguida, faça os dois cortes profundos de alívio a seguir em direção ao nervo óptico. Um alinhando as lâminas da tesoura de dissecção com a linha da fissura coróide temporal na parte de trás do olho e outro alinhando as lâminas da tesoura de dissecção com a linha da fissura coróide nasal na parte de trás do olho. Esses cortes são mostrados aqui em uma retina isolada e reconstruída.

Depois de fazer esses cortes, use dois conjuntos de pinças para arrancar suavemente os orifícios de punção até que parte da retina fique exposta. Usando uma tesoura de dissecação, faça quatro cortes de alívio na retina para que ela fique plana. Monte a retina, com o lado das células ganglionares para cima, na membrana de nitrocelulose, pressionando suavemente cada canto da retina na membrana com uma pinça.

Em seguida, use uma pinça para imergir a retina montada em um mililitro de paraformaldeído a 4% contido no primeiro poço de uma placa de 24 poços. Coloque a placa de 24 poços em um agitador orbital em temperatura ambiente e fixe a retina por exatamente 40 minutos. Após a fixação, transfira a retina para o segundo poço da placa, que é preenchido com um mililitro de PBS 0,1 molar e lave a retina por 15 minutos em temperatura ambiente.

Quando a lavagem estiver concluída, transfira a retina montada para o quinto poço contendo um mililitro de solução de bloqueio e incube durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, adicione o anticorpo primário anti-S-opsina de coelho à solução de bloqueio na concentração de um a 500 e incube por três dias a quatro graus Celsius. Após a incubação de três dias, lave o excesso de anticorpo primário da retina seis vezes, colocando-o sequencialmente em seis poços cheios de um mililitro de PBS por 10 minutos cada em temperatura ambiente.

Em seguida, coloque a retina lavada em um poço com solução de bloqueio fresca e adicione o anticorpo secundário anti-coelho Alexa 594 de burro. Incube a retina com o anticorpo secundário durante a noite a quatro graus Celsius. Após a incubação, lave a retina em PBS seis vezes, como antes.

Usando uma pinça, transfira a retina montada para uma placa de Petri contendo PBS. Solte a retina da membrana de nitrocelulose inserindo suavemente as pontas da pinça entre a retina e a membrana até que a retina não esteja mais presa. Mergulhe uma lâmina de microscópio de vidro no PBS e monte a retina na lâmina, flutuando-a na lâmina e cutucando-a suavemente com uma pinça até que a retina grude no vidro.

Cubra a retina na lâmina com meio de montagem e coloque uma lamínula de 1,5. Coloque a lâmina em uma bandeja deslizante e deixe-a descansar em temperatura ambiente por uma hora. Após uma hora, coloque a bandeja deslizante a quatro graus Celsius.

Depois que a lâmina for coberta por 24 horas, use esmalte para selar as laterais da lâmina para evitar a dessecação. Este é um exemplo de uma retina isolada do olho direito que foi imunocorada para marcar S-opsina e fotografada com um microscópio de epifluorescência. É importante notar que os cortes nesta retina são arbitrários, uma vez que a orientação topográfica pode ser identificada pelo gradiente de S-opsina.

A imagem adquirida da retina pode então ser reconstruída digitalmente com o software ReadiStruct. Os cortes originais são pseudo-coloridos de vermelho nesta imagem. Observe que o arquivo de saída deste programa não alinha corretamente a retina.

Depois que a retina passa pelo código de laboratório de tapete personalizado, a retina é girada para que a maior concentração de coloração de S-opsina seja colocada na parte inferior e identificada como retina ventral. Esta imagem mostra a retina de um olho esquerdo. O pólo temporal está localizado a 90 graus no sentido anti-horário do pólo ventral e o pólo nasal está localizado a 90 graus no sentido horário do pólo ventral.

Uma vez dominadas, essas técnicas de dissecação podem ser feitas rapidamente em apenas alguns minutos, se executadas corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como orientar com precisão e confiabilidade a retina do camundongo usando o músculo reto superior, a fissura coróide ou o gradiente de S-opsina como ponto de referência.