Name: Onde cortar matérias: Uma dissecção e análise de guia para a orientação espacial da Retina do rato de Marcos Ocular (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Aprenda a dissecar e orientar a retina do rato usando marcos anatômicos oculares, como o músculo reto superior, fissura coroide e gradiente de S-opsina. Este método padronizado melhora a precisão em estudos de neurociência e oftalmologia.

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Gostaríamos de agradecer o dia de Brittany e Jessica Onyak para sua assistência técnica e Dr. Liu por amavelmente nos deixar usar seu microscópio de epifluorescente. Agradecimentos de apoio: NIH R15EY026255-01 e a Fundação de Kirchgessner de Karl.

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<li>Sabbah, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+retinal+code+for+motion+along+the+gravitational+and+body+axes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A retinal code for motion along the gravitational and body axes.</a> Nature. 546 (7659), 492-497 (2017).</li>
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<li>Ortin-Martinez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+and+distribution+of+mouse+retinal+cone+photoreceptors%3A+differences+between+an+albino+%28Swiss%29+and+a+pigmented+%28C57%2FBL6%29+strain%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Number and distribution of mouse retinal cone photoreceptors: differences between an albino (Swiss) and a pigmented (C57/BL6) strain.</a> PLoS One. 9 (7), 102392(2014).</li>
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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Não houve nenhum protocolo abrangente, padronizado para a determinação e a orientação da retina do rato isolado no espaço anatômico de rotulagem. O protocolo detalhada aqui tenta preencher esse vazio com a padronização e detalhando como usar pontos anatômicos profundos como referência pontos para confiantemente identificar a orientação da retina. Tem sido demonstrado que os marcos anatômicos profundos no presente protocolo fornecem um método mais preciso e confiável para orientar a retina do rato do que Marcos superficiais tais como queimaduras da córnea22. Assim, estudos que têm confiado em queimaduras da córnea para orientação da retina podem ter tido erros maiores na orientação de estudos que têm contado com marcos históricos, como os músculos retos e fissura coroide. Esta discrepância destaca a necessidade e a importância do presente protocolo padronizado com relação a interpretar os resultados e fazer comparações entre os estudos que dependem da orientação da retina precisa. Em geral, um protocolo padronizado irá fornecer um método comum para pesquisadores de visão a seguir, eliminando assim a presença de uma variável de confundimento em aquisição de dados que pode ocorrer com o uso de métodos não-padronizados para a identificação de retina orientação.
Os métodos apresentados aqui são facilmente reproduzíveis e aplicável a muitos tipos de protocolos experimentais. Na verdade, uma das maiores vantagens desse protocolo é sua adaptabilidade. Porque a fissura coroide, expressão de s-opsin e Marcos de músculo reto todos foram encontrados para identificar confiantemente orientação da retina22 o Marco que melhor se adapte os parâmetros experimentais pode ser escolhido para otimizar a aquisição de dados (tabela de 1). Além disso, métodos de dissecação podem ser combinados por forma a esclarecer a orientação da retina. Por exemplo, fissura coroide cortes podem ser combinados com s-opsin imuno-histoquímica para orientar todos os quatro polos da retina: hemisférios nasais e temporais podem ser identificados pelas cortes fissura coroide, e s-opsin imuno-histoquímica pode identificar hemisférios dorsais e ventrais. Ainda, a capacidade de adaptação do presente protocolo pode ser restringida pela natureza dos experimentos de Fisiologia com tempo-sensível. Porque o tempo que demora para identificar um ponto de referência, fazer uma queimadura da córnea e executar um alívio corte pode resultar em morte do tecido significativa em ex vivo experimentos, alguns desses métodos de dissecação podem ser menos do que ideal. Felizmente, uma vez que um Dissecador tornou-se familiarizado com a fissura coroide ou método de dissecação do músculo reto superior, identificando os marcos profundos e tornando a aliviar cortes rapidamente tornar-se parte da rotina de dissecação e não adicionar significativamente para o comprimento de dissecação. Embora reconheçamos que as etapas detalhadas aqui podem adicionar em vez de experiências extremamente sensíveis ao tempo, nós sugerimos o uso do gradiente s-opsina para orientação da retina post hoc quando a viabilidade do tecido não é mais uma questão (Figura 3 ). Coloração da retina para s-opsina é uma maneira eficaz para orientar a retina, como ele pode identificar todos os quatro polos: s-opsin manchando a retina se divide em polos dorsais e ventrais e permite a identificação da nasal e temporal polos dependendo se a retina é um direito ou esquerdo do olho (Figura 3). Portanto, acreditamos que este protocolo oferece um conjunto confiável e reproduzível de métodos para orientação da retina preciso que podem cumprir quaisquer parâmetros experimentais.
Como com qualquer modificada dissecação da retina, a validade do método dissecação é limitada pela precisão do Dissecador e a qualidade do tecido que foi isolado. Se qualquer tecido é perdido durante a dissecção ou uma retina também é desconfigurado para reconstrução precisa, Retistruct e o programa MATLAB não será capazes de forma confiável reconstruir ou orientar a retina. Portanto, é importante praticar o método de dissecação antes de usá-lo para a coleta de dados de experiências. Enquanto os tipos de dissecações explicaram aqui não são difíceis, eles devem ser praticados para garantir a repetibilidade de identificar a orientação da retina com um marco especial. Além disso, é essencial que a prática do Dissecador visualmente, identificando os pontos anatômicos antes de iniciar a coleta de dados para garantir que o Marco correto está sendo usada. Uma maneira de verificar a exatidão de um particular Dissecador é tornar qualquer fissura coroide cortes ou músculo reto superior cortes e em seguida, comparar a localização dos cortes ao gradiente s-opsina, já que é um marcador fixo e, portanto, não é dependente da exactidão dos dissectio s. potenciais dissectors também podem comparar suas retinas reconstruídos para os exemplos de retina reconstruído com Marco preciso cortes são mostrados na Figura 1 e a Figura 2. Essencialmente, um Dissecador potencial deve executar as etapas descritas neste protocolo para um tipo particular de dissecação, quer seja o músculo reto superior ou a coroide fissura método e comparar os resultados com o gradiente s-opsina para estabelecer a validade de um Dissecador particular. Porque se não tiver certo sobre a localização do landmark o Dissecador, pode resultar em uma orientação imprecisa da retina que irá, por padrão, afetam interpretação e coleta de dados.

Um aspecto importante e às vezes negligenciado da neurociência da retina é a orientação correta e a análise da retina toda montagem isolada, seja a orientação de uma retina em uma câmara de gravação de eletrofisiologia ou sobre lâmina histológica. Isto é particularmente importante para os estudos envolvendo a retina do rato, que é atualmente o modelo mais amplamente utilizado para investigações do sistema visual de mamíferos. Descobertas recentes revelam que a retina do rato não é espacialmente uniforme mas tem gradientes de densidade e tamanho dos tipos de células da retina funcionalmente distintos, tais como células ganglionares de melanopsina, transientes células ganglionares de OFF-alfa e opsins cone1,2 ,3,4,5. Por conseguinte, o método utilizado para determinar a orientação da retina pode afetar os resultados experimentais envolvendo a célula tipo ou opsina distribuições2,3,6, direção ajuste de direção-seletivo gânglio células7,8,9e padrões topográficos de degeneração da retina10,11,12,13,14 . Na verdade, não relatório orientação como da retina é relatada pode causar discrepâncias na literatura e confusão ao tentar comparar os dados entre os estudos. Portanto, é vital que os investigadores relatam o método para identificar a orientação da retina para que os resultados de tais estudos podem ser interpretados com precisão.
Orientação da retina é geralmente identificada, marcando a córnea dorsal, ventral, nasal ou temporal antes da Enucleação ocular1,3,12,15,16,17 ,18,19 ou por corte ou coloração marcos anatômicos profundos olhos tais como os músculos extra-oculares6,7, a coroide fissura20,21, ou o s-opsin gradiente2,3. Os músculos retos podem ser usados para identificar o dorsal, ventral, nasais e a retina temporal, fazendo um corte profundo alívio que corta a ligação de qualquer um o reto superior, reto inferior, reto medial, o músculo reto lateral, respectivamente. No entanto, para a maioria dos experimentos, usar um músculo reto é suficiente para orientar a retina22. A fissura coroide, que é um remanescente do desenvolvimento do olho, pode ser vista como uma ténue linha horizontal na parte de trás do olho. Cada extremidade desta linha termina na nasal ou polo temporal do globo,23. Finalmente, expressão de s-opsin assimetricamente é distribuído para a retina ventral em camundongos, e anticorpos opsin-s podem ser usados para revelar a retina ventral em imuno-histoquímica experiências1.
Trabalho recente de Stabio, et al 22 demonstraram que Marcos oculares superficiais, tais como queimaduras da córnea são um método menos confiável para orientar a retina no espaço anatômico, provavelmente devido a erro humano e variabilidade em fazer a queimadura da córnea quando usando o temporal e medial canthi como pontos de referência. Em contraste, Marcos profundos, tais como o músculo reto superior, fissura coroide e gradiente s-opsina, foram mostrados para ser mais confiáveis e precisos para orientar a retina22Marcos. No entanto, a identificação destes pontos anatômicos requer etapas de dissecação exclusivos que não são descritas em detalhes na literatura. Assim, o objetivo do presente protocolo é fornecer um tutorial completo sobre como usar o músculo reto superior, fissura coroide e gradiente s-opsina para identificar com precisão a orientação espacial da retina do rato. Além disso, incluímos uma comparação da eficácia dos dois anticorpos s-opsina, bem como um protocolo para s-opsin immunohistochemistry.
Um desafio adicional para estudos baseando-se na orientação precisa da retina é os grandes cortes de alívio necessários para achatar as retinas wholemount em uma câmara de gravação, prato ou slide. Isto pode apresentar desafios para a análise do que é naturalmente uma estrutura tridimensional, quando ela é imaginada como uma estrutura bidimensional plana. Um programa chamado Retistruct24 pode ser usado para retornar uma retina plana wholemount a sua estrutura tridimensional antes dos dados coletados a partir dele são analisados. Assim, uma seção do presente protocolo é dedicada a destacar as etapas que são necessárias para usar o software Retistruct para reconstruir as retinas de rato de immunostained s-opsina. Também incluímos uma seção de protocolo para usar nosso script personalizado do MATLAB, que foi desenvolvido para rato com precisão girar e orientar as retinas manchadas com s-opsina.

<table><tbody><tr><td>0.1 M Tamponado com Fosfato Salino</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>P5244</td><td></td></tr><tr><td>Axioplan2 Microscópio Epifluorescente</td><td>Zeiss</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Esmalte Transparente</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Corning LSE Agitador Orbital de Baixa Velocidade</td><td>Placas</td><td>CLS6780FP de</td><td></td></tr><tr><td>24 poços tratadas com Costar TC</td><td>Sigma-Aldrich Microscópio de</td><td></td> Dissecção CLS3524 <td></td></tr><tr><td></td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Asno anti-cabra Alexa 594</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A11058</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-Coelho Alexa 594</td><td>Life Technologies&nbsp;</td><td>A21207</td><td></td></tr><tr><td>Soro Normal de Burro</td><td>Millipore</td><td>566460</td><td>Use a 5,2% (52 &mu; L com 86 &mu; L de 20% Triton X-100 e 863 &mu; L de 0.1M PBS para 1 mL de solução de bloqueio)</td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio Superfrost Plus da marca Fisher</td><td>Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Anti-s-opsina de cabra</td><td>Santa Cruz Biotechnologies&nbsp;</td><td>sc-14363</td><td>Não disponível comercialmente a partir de 2017</td></tr><tr><td>Graefe Curved Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11052-10</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ ou FIJI</td><td>National Institute of Health</td><td>N / A</td><td>Software disponível gratuitamente</td></tr><tr><td>Cauterizador de ponta fina oftálmica Cautery</td> de baixa temperatura <td>Bovie Medical Corporation</td><td>AA00</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N / A</td><td>Pelo menos a versão Óculos de Cobertura Micro 2007b ou posterior</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>VWR International</td><td>48393-241</td><td></td></tr><tr><td>Micro Bandejas Deslizantes</td><td>VWR International</td><td>82020-913</td><td></td></tr><tr><td>Moira Ultra Fine Forceps</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>11370-40</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulose</td><td>Millipore</td><td>HAWP04700</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído</td><td>Microscopia Eletrônica</td> Ciências <td>15714-S</td><td>Use a 4% (25 &mu; L e 875 &mu; L de 0,1 M PBS para 1 mL de fixador)</td></tr><tr><td>Agulha PrecisionGlide 20G (0,90 mm x 25 mm)&nbsp;</td><td>BD PrecisionGlide</td><td>305175</td><td></td></tr><tr><td>Placa de Petri de Vidro Pyrex</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS3160152</td><td></td></tr><tr><td>R</td><td>The R Project for Statistical Computing</td><td>N/A</td><td>Software disponível gratuitamente; versão 3.4.3 ou posterior</td></tr><tr><td>Rabbit anti-s-opsina</td><td>Millipore</td><td>ABN1660</td><td></td></tr><tr><td>Retiga R3 Microscópio Câmera</td><td>Qimaging</td><td>01-RET-R3-R-CLR-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Retistruct</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Software disponível gratuitamente&nbsp; compatível com Windows 7 ou Windows 10</td></tr><tr><td>Mídia de Montagem de Slides Shandon Aqua-Mount</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-390-5</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Use 1.7% (86 &mu; L de 20% Triton-X com 52 &mu; L de soro normal de burro e 863 &mu; L de 0,1 M PBS para 1 mL de solução de bloqueio)</td></tr><tr><td>Tesoura de Dissecção de Mola Vannas&nbsp;</td><td>Ferramentas de Ciência Fina</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>5MP USB Microscópio Câmera Digital</td><td>AmScope</td><td>MU500</td><td>Para ser usado com o Microscópio de Dissecção Olympus</td></tr></tbody></table>

onde cortar matérias: uma dissecção e análise de guia para a orientação espacial da retina do rato de marcos ocular

Where You Cut Matters: A Dissection and Analysis Guide for the Spatial Orientation of the Mouse Retina from Ocular Landmarks

Com precisão e confiabilidade identificar a orientação espacial da retina do rato isolado é importante para muitos estudos em neurociência visual, incluindo a análise da densidade e tamanho gradientes de tipos de células da retina, a direção de afinação de direção-seletivo células ganglionares e o exame dos padrões topográficos degeneração em algumas doenças da retina. No entanto, existem muitos métodos diferentes de dissecação ocular relatados na literatura que são usados para identificar e rotular a orientação da retina na retina do rato. Enquanto o método de orientação utilizado em tais estudos é muitas vezes esquecido, não relata como retinal orientação é determinada pode causar discrepâncias na literatura e confusão ao tentar comparar os dados entre os estudos. Marcos oculares superficiais, tais como queimaduras da córnea são comumente usados, mas recentemente foram mostrados para ser menos confiáveis do que os marcos mais profundos, como os músculos reto, fissura coroide ou gradiente s-opsina. Aqui, nós fornecemos um guia completo para o uso do fundo oculares Marcos de precisão de dissecar e documentar a orientação espacial de uma retina de rato isolado. Temos também comparou a eficácia de dois anticorpos s-opsin e incluiu um protocolo para s-opsin immunohistochemistry. Porque a orientação da retina de acordo com o gradiente s-opsin requer reconstrução da retina com o software Retistruct e rotação com código personalizado, apresentamos os passos importantes necessários para usar os dois destes programas. No geral, o objetivo do presente protocolo é entregar um conjunto confiável e reproduzível de métodos para exata orientação da retina que é adaptável aos protocolos mais experimentais. Um objectivo fundamental deste trabalho é a padronização de métodos de orientação da retina para futuros estudos.

Um único corte de alívio que corta o músculo reto superior com precisão e confiantemente identifica a retina dorsal (Figura 1). A fissura coroide com precisão e confiabilidade identifica a retina nasal e temporal com cortes profundos de alívio ao longo da fissura coroide temporal e nasal (Figura 2). Neste exemplo, um corte de alívio também fez na retina dorsal a fim de identificar o eixo dorsal/ventral da retina (Figura 2D, seta vertical). As etapas destes processos são mostradas com fins de replicação por futuros dissectors. Uma combinação de imuno-histoquímica s-opsina (Figura 3A e 3D), reconstrução com software Retistruct (3B, 3E) e rotação exata com um código personalizado do MATLAB (3 C, 3F) permitem a identificação das metades ventrais e dorsais da retina, bem como os polos nasais e temporais se sabe se a retina é de um olho esquerdo ou direito (Figura 3). Nós também comparamos dois anticorpos primários de s-opsin comumente usados para a eficácia da rotulagem cones s-opsina (Figura 4A-D): ambos o bode anticorpo primário anti-s-opsin e o anticorpo primário de coelho anti-s-opsin efetivamente etiqueta s-opsin conoides (Figura 4E) o mouse mesmo.
Aliviar cortes foram identificados na retina de s-opsin immunostained reconstruída e suas localizações foram comparadas à orientação determinada pelo gradiente s-opsina. Usando nosso personalizado MATLAB código as retinas (ver Materiais suplementares), com precisão foram girados para que a maior concentração de s-opsin coloração está localizada ventralmente, colocando, assim, verdadeira dorsal em 90 ° (para reto superior), verdadeiro nasal em 0 ° (para nasal fissura coroide) e verdadeiro temporal em 180 ° (para temporal fissura coroide). O valor de cada indivíduo aliviar corte ângulo foi determinado usando a ferramenta de ângulo no ImageJ após as retinas foram giradas de acordo com o gradiente s-opsina. Um ângulo médio foi calculado para cada alívio cortar o tipo e o valor médio de cada tipo de corte alívio foi então plotado em um terreno polar (Figura 6). Em média, cortes de músculo reto superior identificaram o polo dorsal 96.3 ± 4,3 ° (n = 11) (Figura 6). A fissura coroide nasal identificado o polo nasal a 6,7 ± 5,8 ° e temporal fissura coroide identificado o polo temporal 172.0 ± 4,4 ° (n = 9; A Figura 6).
<img alt="Análise microscópica da estrutura ocular; efeito de queimadura dorsal; diagramas de neuroanatomia; dados de pesquisa." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1: usando o músculo reto superior para identificar com precisão a retina de um olho direito dorsal. (A) um exemplo de uma queimadura da córnea dorsal, perto da fronteira da córnea-scleral feita com uma caneta de ponta de cauterização (seta branca). O músculo reto superior é também visível neste modo de exibição (seta branca). (B) um exemplo de um todo montado retina com um alívio de corte feito na retina dorsal por atravessa o músculo reto superior. Seta retrata o profundo alívio corte feito na retina dorsal por atravessa o músculo reto superior. A retina está manchada com o anticorpo primário cabra anti-s-opsina (ver Tabela de materiais) e anticorpo secundário burro anti-cabra 594 Alexa (ver Tabela de materiais; excitação: 590 nm; emissão: 620 nm) (ciano). Retina foi fotografada com um microscópio de epifluorescente com um filtro vermelho Texas (595 nm). (C), A retina reconstruída em Retistruct e girado com um código personalizado do MATLAB (ver Material suplementar) com o reto superior muscular aliviando corte visível (seta branca). D: dorsal, v: ventral, t: temporal, n: nasal. Barras de escala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Análise do desenvolvimento ocular; queimadura dorsal e fissura coroide; imagem microscópica; diagrama anatômico." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2: usando a fissura coroide para identificar com precisão os polos nasais e temporais da retina de um olho direito. (A) um exemplo de uma queimadura da córnea dorsal, perto da fronteira da córnea-scleral feita com uma caneta de ponta de cauterização. (B) a coroide fissura visível na parte de trás do olho sobre a esclera (seta branca). A queimadura da córnea dorsal é também visível neste ponto de vista, localizado a cerca de 90° a partir da fissura coroide temporal. (C) a coroide fissura visível na parte de trás do olho sobre a esclera, viajando do nervo óptico à fronteira córneo-escleral. (D), A retina manchada de cabra anti-s-opsina (ver Tabela de materiais) e anticorpo secundário burro anti-cabra 594 Alexa (ver Tabela de materiais; excitação: 590 nm; emissão: 620 nm) (ciano), com cortes de fissura coroide (horizontal as setas) e o alívio dorsal corte (seta vertical). Retina foi fotografada com um microscópio de epifluorescente com um filtro vermelho Texas (595 nm). (E) uma retina reconstruída em Retistruct e girado com um código personalizado do MATLAB (ver material suplementar) com o corte de alívio dorsal e os cortes nasal e temporal fissura coroide visíveis (setas brancas). D: dorsal, v: ventral, t: temporal, n: nasal. Barras de escala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama de mapeamento de retina; análise da retina direita e esquerda; visualização não girada e girada." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3: usando o gradiente s-opsina para identificar todos os quatro polos da retina. (A), um exemplo de uma retina dissecado de um olho direito que foi immunostained para rotular s-opsin e fotografada com um microscópio de epifluorescente com um filtro vermelho Texas (595 nm). Os cortes neste retina são arbitrários, desde que a orientação topográfica é determinada pelo gradiente s-opsina. (B) os resultados da reconstrução da retina em A com Retistruct. Observe que o gradiente s-opsin não está corretamente alinhado porque a retina não foi executada através do código personalizado do MATLAB (ver Materiais suplementares). (C) os resultados da retina na com o código personalizado de giro. A retina foi girada para que a maior concentração de s-opsin coloração está localizada na parte inferior e identificada como a ventral da retina. Porque a retina é de um olho direito, o polo temporal está localizado 90° no sentido anti-horário do polo dorsal e o polo nasal é localizado 90° no sentido horário do polo dorsal. (D) um exemplo de uma retina dissecado de um olho esquerdo que foi immunostained para rotular s-opsin e fotografada com um filtro vermelho Texas (595 nm). Os cortes neste retina são arbitrários, desde que a orientação topográfica é determinada pelo gradiente s-opsina. (E) os resultados da reconstrução digitalmente a retina em D com Retistruct. Observe que o gradiente s-opsin não está corretamente alinhado porque a retina não foi girada pelo código personalizado. (F) os resultados de rotativas da retina em D com código personalizado. A retina foi girada para que a maior concentração de s-opsin coloração está localizada na parte inferior e identificada como a ventral da retina. Porque a retina é de um olho esquerdo, o polo nasal é localizado 90° no sentido anti-horário do polo dorsal e o polo temporal está localizado 90° no sentido horário do polo dorsal. D: dorsal, v: ventral, t: temporal, n: nasal. Barras de escala = 1 mm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="imagens microscópicas de imunocoloração anti-S-opsina de coelho de cabra; cortes transversais de histologia; Gráfico de dados" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figura 4: comparação de dois anticorpos primários s-opsin na rotulagem cones s-opsin. (A), A retina manchado com o anticorpo primário de cabra anti-s-opsina (ver Tabela de materiais). (B) outra retina do rato mesmo corados com anticorpo primário de coelho anti-s-opsina (ver Tabela de materiais). (C) A região representativa (0,1 x 0,1 mm2) de uma retina manchado com o anticorpo primário de cabra anti-s-opsina. Imagem tirada em um microscópio de epifluorescente ampliação de 40 X. (D) A região representativa (0,1 x 0,1 mm2) de uma retina manchada de coelho anti-s-opsina (ver Tabela de materiais), uma alternativa de anticorpo primário. Imagem foi tirada em um microscópio de epifluorescente ampliação de 40 X. (E) ambos os anticorpos rotular o mesmo número de segmentos de s-cone exterior porque não há nenhuma diferença significativa no número de immunopositive s-cones que estão manchadas de cabra anti-s-opsin e anti-s-opsin do coelho em qualquer um do retinal testado excentricidades (n = 2; ANOVA com teste post hoc de Bonferroni; p &gt; 0,05). Barras de escala = 1 mm (A-B); 25 µm (C-D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Análise de equilíbrio estático, diagrama de interface do software com dados de imagem, mostrando estrutura e resultados." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig5.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figura 5: um guia visual para usar o software Retistruct para reconstruir as retinas immunostained com s-opsin. (A), A retina, inaugurado em Retistruct com o contorno visível e um "rasgo" adicionado. Pontos do "Rasgo" são indicados com setas brancas sobrepostas. Todos os cortes neste retina são arbitrários, como nenhum Marco particular foi usado para marcar a orientação da retina durante a dissecção. Botões importantes são descritas em vermelho. (B), A retina com todas as "lágrimas" adicionado e a retina dorsal identificada com "D" na periferia da retina. Observe que o botão de "Retina reconstruir" agora é visível. Botões importantes são descritas em vermelho. (C) o processo de reconstrução de uma retina. A trama do polar da retina reconstruída aparecerá à direita, mostrando que a aliviar cortes em ciano (setas azuis sobrepostos para esclarecer locais de corte). (D) o resultado final da execução uma retina através de Retistruct. A retina wholemount original permanece no lado esquerdo e reconstruída retina aparece no lado direito. Os cortes de alívio são visíveis em ciano (setas brancas sobrepostas para esclarecer locais de corte). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Gráfico radial mostrando as direções dos músculos oculares; reto superior, fissuras coróides (nasais, temporais)." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57861/57861fig6.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 6"> Figura 6: A fissura de músculo e coroide reto superior pode ser usada para orientar com precisão a retina do rato. Uma trama polar dos ângulos obtidos a partir de qualquer músculo reto superior aliviando cortes ou fissura coroide cortes em retinas que foram reconstruídas com Retistruct. Aliviar cortes foram identificados na retina de s-opsin immunostained reconstruída e suas localizações foram comparadas com a localização do gradiente s-opsina. Usando o código personalizado do MATLAB para girar com precisão as retinas para que a maior concentração de s-opsin coloração é localizado ventralmente, verdadeiro dorsal (90° para reto superior), true nasal (0° para fissura coroide nasal) e temporal (180° para coroide temporal é verdade fissura) foram determinados para cada retina. O valor de cada individual aliviar o ângulo de corte foi determinado no ImageJ e um ângulo médio foi calculado para aliviar cada tipo de corte. Cortes de músculo reto superior identificaram o polo dorsal 96.3 ± 4,3 ° (n = 11). A fissura coroide nasal identificado o polo nasal a 6,7 ± 5,8 ° e temporal fissura coroide identificado o polo temporal 172.0 ± 4,5 ° (n = 9). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57861/57861fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Marco profundo</td>
			<td>Localização de queimadura da córnea</td>
			<td>Polo de Retina identificado</td>
			<td>Aplicação experimental</td>
		</tr>
<tr>
<td>Reto superior</td>
			<td>Dorsal</td>
			<td>Dorsal</td>
			<td>Ao vivo ou fixo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fissura coroide nasal</td>
			<td>Dorsal</td>
			<td>Nasal</td>
			<td>Ao vivo ou fixo</td>
		</tr>
<tr>
<td>Temporal fissura coroide</td>
			<td>Dorsal</td>
			<td>Temporal</td>
			<td>Ao vivo ou fixo</td>
		</tr>
<tr>
<td>S-opsin gradiente</td>
			<td>Nenhum</td>
			<td>Dorsal, Ventral, Nasal, Temporal</td>
			<td>Fixo</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Marcos profundos, o polo da retina identificam-se, e se eles podem ser usados para aplicação de tecido vivo ou fixo.

Este protocolo fornece um guia completo de dissecção e análise para o uso de fundo oculares Marcos s-opsin immunohistochemistry, Retistruct e código personalizado com precisão e confiabilidade orientar a retina de rato isolado no espaço anatômico.

Onde cortar matérias: Uma dissecção e análise de guia para a orientação espacial da Retina do rato de Marcos Ocular

Accurately and reliably identifying spatial orientation of the isolated mouse retina is important for many studies in visual neuroscience, including the ...

O objetivo deste protocolo de dissecção é fornecer uma metodologia padronizada para o uso de pontos anatômicos oculares, como os músculos retos, fissura coróide e gradiente de S-opsina para a orientação topográfica da retina do camundongo. A principal vantagem dessas técnicas é que elas fornecem uma maneira confiável de identificar com precisão os pólos dorsal, ventral, nasal e temporal de uma retina isolada de camundongo. Comece identificando um ponto na córnea dorsal próximo à borda da córnea esclera e entre os cânticos nasal e temporal.Toque na córnea com uma caneta de cautério aquecida por menos de um segundo para criar uma marca de queimadura para fins de orientação. Repita para o segundo olho. A presença da queimadura dorsal permite a identificação do músculo reto superior.Para enucleação, use uma pinça curva para empurrar suavemente o olho para fora de sua órbita e segurar o globo por baixo. Em seguida, levante lentamente o globo de seu soquete enquanto o move suavemente da esquerda para a direita até que o globo seja liberado do soquete. Transfira o globo com os músculos retos anexados para uma placa de Petri contendo meio de dissecação.Se estiver trabalhando com os dois olhos, certifique-se de acompanhar qual olho é o olho esquerdo e qual é o olho direito. No escopo da dissecção, localize visualmente a queimadura dorsal da córnea e identifique o músculo reto superior ao qual ela está associada. Usando uma tesoura de dissecção ou uma agulha de calibre 20, perfure a córnea na marca de queimadura.Em seguida, faça um corte de alívio profundo no globo em direção ao nervo óptico para dividir o músculo superior. Uma retina isolada com este corte é vista aqui, e a retina reconstruída com este corte é mostrada aqui. Use dois conjuntos de pinças para começar a isolar a retina, rasgando suavemente o orifício feito com a punção até que parte da retina fique exposta.Em seguida, separe a retina da esclera até que a esclera seja completamente removida. Remova a íris, o cristalino, o vítreo e quaisquer estruturas restantes até que a retina esteja completamente isolada. A presença de queimadura dorsal permite a identificação da fissura nasal e temporal da coroide.Se estiver trabalhando com o olho direito, a fissura coróide nasal está localizada à direita da queimadura e a fissura coróide temporal está localizada à esquerda da queimadura. Isso é o inverso de trabalhar com o olho esquerdo. Para usar o ponto de referência da fissura coróide para identificar a orientação da retina, localize e identifique a fissura coróide na parte de trás do olho.Oriente o globo de modo que a marca de queimadura dorsal fique localizada no pólo superior, como seria se o olho ainda estivesse no mouse. Em seguida, use uma tesoura de dissecção ou uma agulha de calibre 20 para fazer uma punção no globo, primeiro onde a queimadura dorsal está localizada. Em seguida, faça um corte de alívio raso em direção ao nervo óptico, onde a queimadura dorsal da córnea está localizada.Em seguida, faça os dois cortes profundos de alívio a seguir em direção ao nervo óptico. Um alinhando as lâminas da tesoura de dissecção com a linha da fissura coróide temporal na parte de trás do olho e outro alinhando as lâminas da tesoura de dissecção com a linha da fissura coróide nasal na parte de trás do olho. Esses cortes são mostrados aqui em uma retina isolada e reconstruída.Depois de fazer esses cortes, use dois conjuntos de pinças para arrancar suavemente os orifícios de punção até que parte da retina fique exposta. Usando uma tesoura de dissecação, faça quatro cortes de alívio na retina para que ela fique plana. Monte a retina, com o lado das células ganglionares para cima, na membrana de nitrocelulose, pressionando suavemente cada canto da retina na membrana com uma pinça.Em seguida, use uma pinça para imergir a retina montada em um mililitro de paraformaldeído a 4% contido no primeiro poço de uma placa de 24 poços. Coloque a placa de 24 poços em um agitador orbital em temperatura ambiente e fixe a retina por exatamente 40 minutos. Após a fixação, transfira a retina para o segundo poço da placa, que é preenchido com um mililitro de PBS 0,1 molar e lave a retina por 15 minutos em temperatura ambiente.Quando a lavagem estiver concluída, transfira a retina montada para o quinto poço contendo um mililitro de solução de bloqueio e incube durante a noite a quatro graus Celsius. No dia seguinte, adicione o anticorpo primário anti-S-opsina de coelho à solução de bloqueio na concentração de um a 500 e incube por três dias a quatro graus Celsius. Após a incubação de três dias, lave o excesso de anticorpo primário da retina seis vezes, colocando-o sequencialmente em seis poços cheios de um mililitro de PBS por 10 minutos cada em temperatura ambiente.Em seguida, coloque a retina lavada em um poço com solução de bloqueio fresca e adicione o anticorpo secundário anti-coelho Alexa 594 de burro. Incube a retina com o anticorpo secundário durante a noite a quatro graus Celsius. Após a incubação, lave a retina em PBS seis vezes, como antes.Usando uma pinça, transfira a retina montada para uma placa de Petri contendo PBS. Solte a retina da membrana de nitrocelulose inserindo suavemente as pontas da pinça entre a retina e a membrana até que a retina não esteja mais presa. Mergulhe uma lâmina de microscópio de vidro no PBS e monte a retina na lâmina, flutuando-a na lâmina e cutucando-a suavemente com uma pinça até que a retina grude no vidro.Cubra a retina na lâmina com meio de montagem e coloque uma lamínula de 1,5. Coloque a lâmina em uma bandeja deslizante e deixe-a descansar em temperatura ambiente por uma hora. Após uma hora, coloque a bandeja deslizante a quatro graus Celsius.Depois que a lâmina for coberta por 24 horas, use esmalte para selar as laterais da lâmina para evitar a dessecação. Este é um exemplo de uma retina isolada do olho direito que foi imunocorada para marcar S-opsina e fotografada com um microscópio de epifluorescência. É importante notar que os cortes nesta retina são arbitrários, uma vez que a orientação topográfica pode ser identificada pelo gradiente de S-opsina.A imagem adquirida da retina pode então ser reconstruída digitalmente com o software ReadiStruct. Os cortes originais são pseudo-coloridos de vermelho nesta imagem. Observe que o arquivo de saída deste programa não alinha corretamente a retina.Depois que a retina passa pelo código de laboratório de tapete personalizado, a retina é girada para que a maior concentração de coloração de S-opsina seja colocada na parte inferior e identificada como retina ventral. Esta imagem mostra a retina de um olho esquerdo. O pólo temporal está localizado a 90 graus no sentido anti-horário do pólo ventral e o pólo nasal está localizado a 90 graus no sentido horário do pólo ventral.Uma vez dominadas, essas técnicas de dissecação podem ser feitas rapidamente em apenas alguns minutos, se executadas corretamente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como orientar com precisão e confiabilidade a retina do camundongo usando o músculo reto superior, a fissura coróide ou o gradiente de S-opsina como ponto de referência.

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JoVE Journal

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