Orientada para o banco de dados-citometria de fluxo para avaliação da maturação de células mieloides de medula óssea
November 3rd, 2018
O diagnóstico do MDS é difícil na ausência de critérios morfológicos ou não-informativo citogenética. MFC poderia ajudar a refinar o processo de diagnóstico do MDS. Para se tornar útil para a prática clínica, a análise MFC deve ser baseada em parâmetros com sensibilidade e especificidade suficientes, e dados devem ser reprodutíveis entre diferentes operadores.
Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no diagnóstico de doenças mielóides, como síndromes de mielodysplasia ou outras doenças hematológicas que evoluem com anormalidades de maturação nas linhagens celulares mielóides. A principal vantagem dessa técnica é que ela reduz a subjetividade do investigador nessa análise e interpretação. Este método pode fornecer insights sobre quais são os parâmetros mais discriminatórios para a mielodysplasia.
Permite quantificar as diferenças das populações normais de células mielóides. Demonstrando o procedimento estará Tiphanie Picot, bolsista de pós-doutorado do nosso laboratório. Comece misturando 600 microlitadores da amostra celular primária com 10 mililitros de tampão de lavagem em um tubo cônico de 15 mililitros para duas centrífugas e 10 mililitros de tampão de lavagem fresco por lavagem.
Após a segunda lavagem, suspenda novamente a pelota em 400 microlitres de tampão de lavagem fresco, e transfira 350 microliters da suspensão celular para um tubo facs de polipropileno de cinco mililitros, contendo todo o painel de anticorpos espinha dorsal. Depois de misturar completamente as células, pipeta volumes iguais da solução de anticorpos celulares em três novos tubos de polipropileno, e trazer o volume final em cada tubo até 200 microliters com tampão de lavagem fresco, conforme necessário. Em seguida, adicione o volume apropriado de anticorpos contra os marcadores de interesse da superfície celular com a mistura, para uma incubação de 30 minutos à temperatura ambiente, protegido da luz.
No final da incubação, adicione dois mililitros de solução de lise com mistura, para uma incubação de 10 minutos à temperatura ambiente, protegidos da luz. Colete as células líficas por centrifugação, e descarte todos, exceto os últimos 50 microlitres de supernascer em cada tubo, sem perturbar a pelota. Suspenda as pelotas no supernascedor restante, com mistura suave, e adicione dois mililitros de tampão de lavagem fresco a cada amostra.
Após a segunda lavagem, descarte o supernascer, deixando aproximadamente 50 microliters volume residual em cada tubo, sem perturbar a pelota. Suspenda a pelota em 200 microliters de PBS com mistura, para análise imediata. Para ler as amostras em um citômetro de fluxo, primeiro abra um novo experimento no software do citômetro de fluxo e renomeie o experimento de acordo com o nome, tipo de amostra e data.
Crie um novo espécime para três tubos e especifique os anticorpos usados em cada tubo no layout do experimento. Abra as configurações do cítômetro e selecione as configurações do aplicativo para aplicar os valores obtidos na configuração mensal. Abra uma nova planilha global e crie os gráficos de pontos apropriados para gating das células singlet, bem como para as populações de granulócitos, monócitos, explosões e linfócitos.
Crie uma nova planilha global para os controles de compensação. Em seguida, adquira 500.000 eventos de cada tubo, a uma taxa média de aquisição, exportando os dados como arquivos fcs 3.0, após sua validação técnica. Antes de iniciar uma nova análise, baixe os arquivos de cyt contendo os dados normais da medula óssea, para linhagens vermelhas neutrófilas, monocíticas e nucleadas, e os arquivos de análise em formato inp.
Em seguida, salve os dados na sua área de trabalho. A fim de salvar a maturação do neutrófilo para a base de dados, primeiro abra o software Infinicyt e, em seguida, abra o arquivo cyt correspondente aos dados de maturação de neutrófilos. Desenhe a via de maturação no gráfico APS e salve o caminho de maturação do neutrófilo para o banco de dados.
Abra o arquivo fcs para a maturação da linhagem de neutrófilos que deve ser analisada. Carregue o arquivo inp de maturação de neutrófilo da guia perfis. A análise dessa linhagem é dividida em três etapas.
Comece com a seleção de cd34 positivo, explosões cometidas por neutrófilos. Para isso, utilize uma intersecção de sete portões, para permitir a seleção dos eventos CD34 positivos, CD117 positivo, HLADR baixo, CD10 negativo, CD13 positivo, CD11 b-negativo. Continue a análise com a seleção do CD117 positivo, precursores neutrófilos negativos CD34.
Continue a análise com a seleção de células neutrófilas mais maduras. Em seguida, mostre a análise de células de linhagem monocíticas. Desenhe a via de maturação no gráfico APS.
Verifique se a seta que indica a sensação de maturação é orientada desde células imaturas, monocíticas, CD14 negativo, IREM2 negativo, até os monócitos maduros, CD14 positivo, IREM2 positivo. Salve o caminho de maturação para a linhagem monocítica para o banco de dados. Abra o arquivo fcs para a maturação da linhagem monocítica que precisa ser analisada.
Faça upload do perfil para análise de linhagem monocítica. Para identificar as células de linhagem monocítica, utilize uma intersecção de quatro portões que permite a seleção de CD64 positivo alto, CD117 positivo, CD117 negativo, HLADR eventos positivos. Atribua esses eventos à guia monocítica na árvore da hierarquia populacional.
Abra o arquivo cyt NRC que deve ser salvo no banco de dados do NRC. Desenhe a via de maturação no gráfico APS e salve a via de maturação de células vermelhas nucleadas para o banco de dados. Abra o arquivo fcs que precisa ser analisado.
Faça upload dos perfis o modelo de análise para células vermelhas nucleadas. A análise dessa linhagem é dividida em duas etapas. Começando com a seleção do CD34 positivo, eritróide cometeu explosões.
Aqui, use uma intersecção de sete portões para permitir a seleção do CD34 positivo, CD117 positivo, HLADR baixo, CD105 positivo, CD33 negativo, CD36 positivo, CD71 eventos positivos. Atribua esses eventos à guia NRC na hierarquia populacional. Remova o CD34 positivo eritródo cometido explosões da visibilidade.
Para identificar células eritróides mais maduras, use uma intersecção de quatro portões que permitem a discriminação de CD45 negativo e CD45 positivo baixo, baixo de dispersão lateral, CD36 positivo alto e CD71 positivo alto. Em seguida, remova o lado alto CD36 espalhe plaquetas baixas das células vermelhas nucleadas e atribua essa população à guia NRC. Para avaliar a maturação mielóide no compartimento da medula óssea, abra o arquivo cit correspondente à linhagem de interesse do caso que deve ser avaliado.
Mantenha visíveis apenas os eventos atribuídos à aba do neutrófilo na hierarquia populacional. Desenhe a via de maturação no gráfico APS e carregue o banco de dados correspondente à maturação do neutrófilo na medula óssea normal e compare os dados. Se os dados forem pelo menos parcialmente compatíveis, o software criará um diagrama de diferenças de maturação normalizado e uma faixa de parâmetro, para visualizar as diferenças de maturação.
Para comparar a maturação dos monócitos no compartimento da medula óssea, para um novo caso com dados de medula óssea normal, inclusive no banco de dados de monócitos, abra o arquivo de cito correspondente à linhagem celular monocítica. Mantenha visível apenas os eventos atribuídos à guia monócitos na árvore de hierarquia populacional e desenhe o caminho de maturação no gráfico APS. Carregue o banco de dados correspondente à maturação dos monócitos em medulas ósseas normais e compare dados.
Para comparar a maturação das células vermelhas nucleadas no compartimento da medula óssea, para um novo caso, com dados das medulas ósseas normais, incluídos no banco de dados do NRC, abra o arquivo de cit correspondente à linhagem do NRC. Mantenha visível apenas os eventos atribuídos à guia NRC na hierarquia populacional. E desenhe o caminho de maturação no gráfico APS.
Carregue o banco de dados correspondente à maturação do NRC em medulas ósseas normais e compare dados. Em seguida, para visualizar a significância das diferenças entre o novo arquivo e os dados incluídos no banco de dados, clique em diferenças de maturação normalizadas e zoom. Lembre-se que os métodos que usam os algoritmos hierárquicos de classificação na análise de dados citométricos de fluxo são altamente subjetivos e inerentemente imprecisos, pois não contam para a sobreposição da população celular.
A avaliação de novos casos de citopenia, suspeita de ser MDS contra os bancos de dados de maturação normal mielóide, permite identificar antígenos de maturação anormalmente expressos de linhagens de neutrófilos, monócitos e NRC, mesmo em casos sem anormalidades citológicas ou citogênicas. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de adquirir os dados citométricos de fluxo, de forma padronizada, para realizar a configuração mensal do citrômetro, verificações diárias, para pipetizar rigorosamente o anticorpo antes do uso, e respeitar os tempos de coloração. Após esse procedimento, outro método, como a bússola, pode ser realizado para comparar o diferente grupo de casos, e responder a perguntas adicionais, como qual é a impressão tipic final para um determinado grupo de casos.
Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para os pesquisadores interessados em explorar padrões de maturação celular mieloide, em casos de hematopoiese clonal de potencial indeterminado para identificar as mudanças tipic finais de forma confiável relacionadas ao processo displásico. Observe que atualizar o banco de dados com maior número de dados de doadores saudáveis pode melhorar a robustez da análise.
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Visão geral
Este artigo discute o uso da citometria de fluxo multiparamétrica (CFM) para melhorar o processo de diagnóstico das síndromes mielodisplásicas (SMD). Destaca a importância da especificidade e sensibilidade na análise CFM para aplicações clínicas.
Componentes principais do estudo
Área da ciência
- Hematologia
- Doenças mieloides
- Técnicas de diagnóstico
Contexto
- O diagnóstico de SMD é desafiador sem critérios morfológicos.
- Citogenética não informativa complica o processo diagnóstico.
- A CFM pode potencialmente refinar o processo diagnóstico da SMD.
- A reprodutibilidade dos dados entre operadores é crucial.
Objetivo do estudo
- Avaliar a eficácia da CFM no diagnóstico de doenças mieloides.
- Identificar os parâmetros mais discriminatórios para mielodisplasia.
- Reduzir subjetividade na análise e interpretação.
Métodos utilizados
- Misturar amostras de células primárias com tampão de lavagem.
- Realizar centrifugações para preparação da amostra.
- Quantificar diferenças das populações normais de células mieloides.
- Demonstrar o procedimento por um pesquisador pós-doutorado.
Principais resultados
- A CFM fornece insights sobre diferenças nas populações de células mieloides.
- A técnica reduz a subjetividade do investigador.
- Permite a quantificação de parâmetros discriminatórios.
- A reprodutibilidade dos dados é enfatizada para utilidade clínica.
Conclusões
- A CFM pode melhorar a precisão diagnóstica para SMD.
- Especificidade e sensibilidade são vitais para aplicação clínica.
- Validação adicional é necessária para uso clínico generalizado.
Perguntas frequentes
Executive Industry Relevance
Standardized flow cytometry databases for myeloid maturation enable objective, quantitative assessment of hematologic dysplasia, reducing investigator subjectivity in diagnostic interpretation. This approach supports early detection of myelodysplastic syndromes by identifying phenotypic deviations from healthy donor baselines, enhancing diagnostic confidence in preclinical and translational hematology research. The method facilitates cross-laboratory reproducibility, a critical factor for biomarker validation and assay transfer in drug discovery pipelines targeting myeloid malignancies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of myeloid differentiation pathways through quantitative comparison of cell maturation profiles against established normal baselines.
- Operational Value: Reduces analytical variability in target validation studies by minimizing subjectivity in flow cytometric gating and interpretation.
- Predictive Value: Supports mechanistic de-risking by identifying early maturation defects in preclinical models of hematopoietic disorders.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a framework for assay standardization using lineage-specific maturation databases to ensure consistent phenotypic readouts across screening campaigns.
- Operational Value: Enables robust quantitative outputs for compound effect assessment on myeloid differentiation, supporting hit-to-lead progression.
- Assay Readiness: Facilitates preparation of validated biological systems for downstream applications by establishing normalized maturation trajectories.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical stages by allowing direct comparison of experimental models to healthy human myeloid maturation benchmarks.
- Biomarker Alignment: Supports identification of lineage-specific phenotypic abnormalities that may serve as translational biomarkers in myeloid disease models.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions based on maturation deviation thresholds (e.g., 2SD from normal) in preclinical efficacy studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery workflow by providing standardized phenotypic readouts that inform target validation, assay development, and preclinical model qualification for myeloid-targeted therapeutics.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of myeloid differentiation pathways through objective, database-referenced maturation analysis.
- Screening: Enables assay standardization and reproducibility by anchoring compound-induced phenotypic changes to established normal maturation baselines.
- Analytics: Generates quantitative maturation difference diagrams and parameter bands that allow statistical comparison of experimental conditions against healthy donor data.
- Translational Research: Connects in vitro or in vivo findings to human-relevant myeloid maturation standards, supporting preclinical-to-clinical translation.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable analytical framework for consistent myeloid maturation assessment across multiple projects and sites.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in myeloid differentiation assessments.
- Operational Value: Enhances reproducibility and scalability of flow cytometry assays through standardized database-driven analysis.
- Strategic Value: Improves portfolio decision-making by enabling objective, quantitative evaluation of myeloid dysplasia risk in preclinical models.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of compounds based on their effects on myeloid maturation trajectories.
Implementation Considerations
- Requires expertise in multiparameter flow cytometry and hematologic marker panels for myeloid lineage identification.
- Depends on access to validated antibody panels and standardized instrument setup protocols for reproducible data acquisition.
- Necessitates cross-team standardization of sample preparation, staining, and acquisition protocols to ensure database comparability.
- Involves adaptation considerations when applying the method to non-human model systems or alternative maturation markers.
- Limited by inter-laboratory variability in antibody performance, particularly those derived from hybridoma technologies, which may affect data harmonization.
