Name: Orientada para o banco de dados-citometria de fluxo para avaliação da maturação de células mieloides de medula óssea (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-11-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 5 s
Description: Aprenda citometria de fluxo multiparamétrica para diagnóstico de síndromes mielodisplásicas usando células da medula óssea. Esta técnica reduz a subjetividade e permite quantificar diferenças nas populações celulares mieloides.

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Os anticorpos utilizados neste estudo foram fornecidos pela BD Biosciences. Os autores gostaria de agradecer ao seu colega, Dr. Pascale Flandrin-Gresta, desde o departamento de Biologia Molecular, laboratório de Hematologia, University Hospital de Saint-Etienne, França, que forneceu a perícia para interpretação dos dados NGS para o segundo Caso do MDS. Os autores são gratos a hematologia clínico para seu interesse e envolvimento neste estudo e para os pacientes e doadores saudáveis para o seu acordo em participar deste estudo. Os autores também gostaria de agradecer à Fundação "Les Amis de Rémi" apoio financeiro para publicação.

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<li>Matarraz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+the+Diagnosis+and+Classification+of+Monocytic-Lineage+Leukemias+by+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+B+%28Clinical+Cytometry%29%22%5BJournal%5D)">Introduction to the Diagnosis and Classification of Monocytic-Lineage Leukemias by Flow Cytometry.</a> Cytometry Part B (Clinical Cytometry). 92 (3), 218-227 (2015).</li>
<li>Westers, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunophenotypic+analysis+of+erythroid+dysplasia+in+myelodysplastic+syndromes.+A+report+from+the+IMDSFlow+working+group%29%5BTitle%5D)+AND+%22Haematologica%22%5BJournal%5D)">Immunophenotypic analysis of erythroid dysplasia in myelodysplastic syndromes. A report from the IMDSFlow working group).</a> Haematologica. 102, 308-319 (2017).</li>
<li>Shen, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+immunophenotypic+findings+in+chronic+myelomonocytic+leukemia+and+its+utility+in+monitoring+treatment+response%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Haematology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry immunophenotypic findings in chronic myelomonocytic leukemia and its utility in monitoring treatment response.</a> European Journal of Haematology. 95, 168-176 (2015).</li>
</ol>

Os autores declaram que eles têm não tem interesses financeiro concorrente. O departamento de citometria de fluxo, o laboratório de Hematologia do Hospital da Universidade de Saint-Etienne é um membro do consórcio EuroFlow.

A qualidade do aspirado BM poderia impactar os resultados finais. A hemodiluição do aspirado BM pode distorcer a distribuição de células em diferentes estágios de maturação devido à ausência dos progenitores ou precursores. Provavelmente, empregar um granel lise método pode ajudar na normalização da BM aspirados por hemodiluição em análises de fluxo cytometric. Além disso, os passos críticos para a avaliação da displasia mieloide BM por citometria de fluxo são o exemplo de processamento e coloração, aquisição de dados e ...

Na ausência de marcadores fenotípicos específicos para as alterações displásicas ocorrem em células mieloides durante a iniciação de MDS e progressão, foi proposta uma nova abordagem em anos recentes, com base na avaliação de vias de maturação (expressão alterada de antígenos mieloides durante a produção de células mieloides maduras) ou da distribuição anormal de diferentes tipos de células na medula óssea (BM) de células compartimentos1,2.
Este artigo apresenta um novo método para aplicação padronizada do MFC, a fim de detectar alterações displásicas em compartimentos de células mieloides BM relacionados a Síndromes Mielodisplásicas (MDS) ou outras doenças hematológicas mieloides. Este estudo também mostra a utilidade do uso de bancos de dados de maturação para análise de dados MFC.
Padronização do procedimento de preparação de amostra, aquisição de dados e análise usando os bancos de dados permitiria identificar as anormalidades fenotípicas mais relevantes relacionadas com alterações displásicas em células mieloides BM. Portanto, subconjuntos estatisticamente selecionados com base em formatos bem marcados e bem reconhecidos (diagramas de separador de população automática (APS), histogramas e lotes do ponto) são necessários para o desenvolvimento de uma estratégia de análise que pode ser usada na análise subsequente rondas. A descoberta de anormalidades fenotípicas robustas em MDS facilitariam o diagnóstico em casos com ou sem displasia morfológica mínima e sem aberrancies de citogenéticas. Identificação dos parâmetros discriminatórios para a redução dos painéis imunofenotípica pode simplificar o atual escores2, permitindo a sua aplicabilidade em laboratórios de patologia clínica.
Este método limita as interpretações subjetivas de citometria dados, como tem sido sinalizado no MDS diagnóstico3. Esta etapa é um pré-requisito para o desenvolvimento de ferramentas automatizadas para processamento e análise de fluxo de dados4.
MDS compreende um grupo heterogêneo de desordens de células-tronco hematopoéticas clonais (HSC), em que as mutações spliceossoma cooperarem com modificadores epigenéticas específicas para produzir o fenótipo do MDS. Agora sabe-se que, juntamente com as mutações do HSC, outros mecanismos estão envolvidos na fisiopatologia do MDS, tais como inflamação mediada por imune aberrante e interações entre linfócitos malignos e o microambiente do estroma do BM. No entanto, estes mecanismos permanecem mal compreendidos. A heterogeneidade ampla clínica e biológica da MDS faz o diagnóstico e seleção da terapia ideal um desafio. Na última década, vários estudos têm mostrado que MFC é muitas vezes mais sensível na detecção de displasia2 do que a morfologia, mas as restrições técnicas e econômicas dificultam essa técnica padronizar, com resultados muitas vezes dependendo do experiência do intérprete3. Além disso, não está claro como MFC pode pender a balança em direção a MDS com ou sem displasia morfológica mínima nos casos e na ausência de anomalias citogenéticas ou em casos-limite como hipocelular MDS, com uma contagem baixa de explosão, de outro não-clonal BM doenças como a insuficiência de medula óssea (i. e., anemia aplástica). Também continua a ser difícil diferenciar casos-limite da MDS com excesso de blastos da leucemia mieloide aguda (LMA). Por todas estas razões, as diretrizes clínicas não integrar a MFC testes para o diagnóstico final do MDS. Em 2011, a rede de câncer abrangente nacional dos EUA (NCCN) recomendado MFC para a estimativa da percentagem de células CD34 +, detecção de clones de hemoglobinúria paroxística noturna e presença de clones de células T citotóxicas em hipocelular MDS5. Estas duas situações este último também envolvem um objetivo terapêutico porque dados clínicos mostraram uma boa resposta desses pacientes a terapia imunossupressora6. As diretrizes NCCN 2017, citando as recomendações do grupo de trabalho internacional (GTI), listado immunophenotyping aberrante deteção pelo MFC entre os co critérios para o diagnóstico do MDS, mas sem fazer quaisquer especificações6. Além disso, a classificação WHO publicada recentemente estipula que as conclusões de MFC sozinhos não são suficientes para estabelecer um diagnóstico primário de MDS na ausência de dados conclusivos morfológica e/ou citogenética7. No entanto, MFC pode ser usado como um teste adicional mostrando o dysregulation do célula mieloide padrões de maturação e quantificar a "distância normal" para um paciente em um momento específico do curso da doença.
Este método é aplicável em laboratórios clínicos interessados na avaliação de displasia em células mieloides BM, usando MFC immunophenotyping, a fim de refinar o diagnóstico em MDS ou outros distúrbios mieloides com anormalidades displásicos.

<table><tbody><tr><td>BD FACSCanto II citômetro de fluxo</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>SN:</td> V33896301336 <td>3-laser, configuração 4-2-2, Filtros e espelhos detalhes: https://www.bdbiosciences.com/documents/BD_FACSCanto_II_FilterGuide.pdf</td></tr><tr><td>Awel C48-R Centrifuge</td><td>AWEL Industries, FR</td><td>SN: 910120016; Modelo No: 320002001</td><td>centrífugas de baixa velocidade; capacidade 60 tubos FACS</td></tr><tr><td>Pipetas de 10&micro; L e 200&micro; L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipetas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubos Falcon</td> tubo de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>polipropileno para FACS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human HLA-DR</td><td>BD Biosciences, CA, EUA</td><td>655874</td><td>clone L243 Mouse BALB/c IgG2a, &kappa; Fluorochrome Horizon V450 (Ex max 404 nm/ Em max 448 nm)</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human CD45</td><td>BD Biosciences, CA, EUA</td><td>560777</td><td>clone HI30 Mouse IgG1, &kappa; Fluorochrome Horizon V500 (Ex max 415 nm/ Em max 500 nm)</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human CD16</td><td>BD Biosciences, CA, EUA</td><td>656146</td><td>clone CLB/fcGran1 Mouse BALB/c IgG2a, &kappa; Fluorocromo FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human CD13</td><td>BD Biosciences, CA, EUA</td><td>347406</td><td>clone L138 Mouse BALB/c X C57BL/6 IgG1, &kappa; Fluorocromo PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>Camundongo Anti-Humano CD34</td><td>BD Biosciences, CA, EUA</td><td>347222</td><td>clone 8G12 Camundongo BALB/c IgG1, &kappa; Fluorocromo PerCP-Cy5.5 (Ex max 482 nm/ Em max 678 nm)</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human CD117</td><td>BD Biosciences, CA, EUA</td><td>339217</td><td>clone 104D2 Mouse BALB/c IgG1 Fluorochrome PE-Cy7 (Ex max 496 nm/ Em max 785 nm)</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human CD11b</td><td>BD Biosciences, CA, EUA</td><td>333143</td><td>clone D12 Mouse BALB/c IgG2a, &kappa; D12, Fluorocromo APC (Ex max 650 nm/ Em max 660nm</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human CD10</td><td>BD Biosciences, CA, EUA</td><td>646783</td><td>clone HI10A Mouse BALB/c IgG1, &kappa; Fluorocromo APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)</td></tr><tr><td>Camundongo Anti-Humano CD35</td><td>BD Biosciences, CA, EUA</td><td>555452</td><td>clone E11 Camundongo IgG1, &kappa; Fluorocromo FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human CD64</td><td>BD Biosciences, CA, EUA</td><td>644385</td><td>clone 10.1 Mouse BALB/c IgG1, &kappa; Fluorocromo PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>Camundongo Anti-Humano CD300e</td><td>Immunostep</td><td>IREM2A-T100</td><td>clone UP-H2 Camundongo BALB/c IgG1, k Fluorocromo APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>Camundongo Anti-Humano CD14</td><td>BD Biosciences, CA, EUA</td><td>641394</td><td>clone MoP9 Mouse BALB/c IgG2b, &kappa; Fluorocromo APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)</td></tr><tr><td>Camundongo Anti-Humano CD36</td><td>BD Biosciences, CA, EUA</td><td>656151</td><td>clone CLB-IVC7 Mouse IgG1, &kappa; Fluorocromo FITC (Ex max 494 nm/ Em max 520 nm)</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human CD105</td><td>BD Biosciences, CA, EUA</td><td>560839</td><td>clone 266 Mouse BALB/c IgG1, &kappa; Fluorocromo PE (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>Camundongo Anti-Humano CD33</td><td></td><td>345800</td><td>clone P67.6 Camundongo BALB/c IgG1, &kappa; Fluorocromo APC (Ex max 496 nm/ Em max 578 nm)</td></tr><tr><td>Mouse Anti-Human CD71</td><td>BD Biosciences, CA, EUA</td><td>655408</td><td>clone M-A712 Mouse BALB/c IgG2a, &kappa; Fluorocromo APC-H7 (Ex max 496 nm/ Em max 785nm)</td></tr><tr><td>Solução de lise 10x concentrado (IVD)</td><td>BD Biosciences, CA, EUA</td><td>349202</td><td></td></tr><tr><td>FACSFlow Sheath Fluid</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>FACSDiva CS& T IVD beads</td><td>BD Biosciences, CA, USA</td><td>656046</td><td></td></tr><tr><td>RAINBOW CALIBRATION PARTICLES, 8 PEAKS</td><td>Cytognos, Salamanca, Espanha</td><td>SPH-RCP-30-5A</td><td>lotes EAB01, EAC01, EAD05, EAE01, EAF01, EAG01, EAH01, EAI01, EAJ01, EAK01</td></tr><tr><td>Partículas de compensação Multicolor CompBeads(CE/IVD)</td><td>BD Biosciences, CA, EUA</td><td>ref. #51-90-9001229 + #51-90-9001291</td><td></td></tr><tr><td>Software Diva versões 6.1.2 e 6.1.3</td><td>BD Biosciences, CA, EUA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Comprimidos salinos tamponados com fosfato</td><td>R& D Systems, Minneapolis, EUA</td><td>5564</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino( BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, França</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sódio 99%</td><td>Sigma-Aldrich, França</td><td>199931</td><td></td></tr><tr><td>Software Infinicyt versão 1.8.0.e</td><td>Cytognos, Salamanca, Espanha</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

orientada para o banco de dados-citometria de fluxo para avaliação da maturação de células mieloides de medula óssea

Database-guided Flow-cytometry for Evaluation of Bone Marrow Myeloid Cell Maturation

Um grupo de trabalho iniciado dentro francês citometria de associação (AFC) foi desenvolvido a fim de harmonizar a aplicação da citometria de fluxo multiparâmetros (MFC) para o diagnóstico de doença mieloide na França. O protocolo aqui apresentado foi estabelecido e aplicado entre setembro de 2013 e de 2015 novembro seis laboratórios de diagnóstico francês (hospitais universitários de Saint-Etienne, Grenoble, Clermont-Ferrand, Nice e Lille e Institut Paoli-Calmettes em Marselha) e permitiu a padronização de aquisição de dados e preparação de amostra da medula óssea. Três bancos de dados de maturação foram desenvolvidos para neutrófilos, monocítica e linhagens eritroide com medula óssea de indivíduos "saudáveis" doador (indivíduos sem qualquer evidência de doenças hematopoiéticas). Um método robusto de análise para cada linhagem mieloide deve ser aplicável para o uso rotineiro de diagnóstico. Novos casos podem ser analisados da mesma maneira e comparados com os bancos de dados de sempre. Assim, quantitativas e qualitativas de anormalidades fenotípicas podem ser identificadas e aqueles acima 2SD comparado com dados de amostras normais da medula óssea devem ser consideradas indicativas de patologia. A principal limitação é a maior variabilidade entre os dados obtidos usando os anticorpos monoclonais obtidos com os métodos baseados em tecnologias de hibridoma e atualmente utilizados no diagnóstico clínico. Definição de critérios para validação técnica dos dados adquiridos pode ajudar a melhorar a utilidade do MFC para diagnósticos MDS. O estabelecimento destes critérios exige análise contra um banco de dados. A redução da subjetividade do investigador na análise de dados é uma importante vantagem deste método.

As 54 amostras de BM colhidas em anticoagulante EDTA-K foram incluídas no estudo. Analisaram-se os dados do MFC na ausência de qualquer informação sobre os pacientes. Estudo retrospectivo mostrou que as amostras de BM eram de 7 doadores saudáveis (5 machos e 2 fêmeas com idade mediana de 47,4 [35-48], 11 indivíduos sem evidência de doença hematopoiética (8 machos e 3 fêmeas com idade mediana de 57.9 [35-72]) e 36 casos com vários condições patológicas: 1 caso com anemia e nível de creati...

O diagnóstico do MDS é difícil na ausência de critérios morfológicos ou não-informativo citogenética. MFC poderia ajudar a refinar o processo de diagnóstico do MDS. Para se tornar útil para a prática clínica, a análise MFC deve ser baseada em parâmetros com sensibilidade e especificidade suficientes, e dados devem ser reprodutíveis entre diferentes operadores.

Orientada para o banco de dados-citometria de fluxo para avaliação da maturação de células mieloides de medula óssea

A working group initiated within the French Cytometry Association (AFC) was developed in order to harmonize the application of multiparameter flow ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no diagnóstico de doenças mielóides, como síndromes de mielodysplasia ou outras doenças hematológicas que evoluem com anormalidades de maturação nas linhagens celulares mielóides. A principal vantagem dessa técnica é que ela reduz a subjetividade do investigador nessa análise e interpretação. Este método pode fornecer insights sobre quais são os parâmetros mais discriminatórios para a mielodysplasia.Permite quantificar as diferenças das populações normais de células mielóides. Demonstrando o procedimento estará Tiphanie Picot, bolsista de pós-doutorado do nosso laboratório. Comece misturando 600 microlitadores da amostra celular primária com 10 mililitros de tampão de lavagem em um tubo cônico de 15 mililitros para duas centrífugas e 10 mililitros de tampão de lavagem fresco por lavagem.Após a segunda lavagem, suspenda novamente a pelota em 400 microlitres de tampão de lavagem fresco, e transfira 350 microliters da suspensão celular para um tubo facs de polipropileno de cinco mililitros, contendo todo o painel de anticorpos espinha dorsal. Depois de misturar completamente as células, pipeta volumes iguais da solução de anticorpo

database-guided-flow-cytometry-for-evaluation-bone-marrow-myeloid

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Medicina

O ensaio de células formadoras de colônia (CFC) é um ensaio in vitro em que células progenitoras hematopoéticas formar colônias em meio semi-sólido. Uma combinação de morfologia da colônia, morfologia celular e citometria de fluxo são utilizados para avaliar a capacidade dos progenitores a proliferar e se diferenciar ao longo dos diferentes linhagens hematopoiéticas.

Formadoras de Colônias celular Assay (CFC) para células hematopoiéticas humanas

Enquanto os macrófagos infiltrativos são continuamente recrutados para tecidos adultos a partir de precursores circulantes, os macrófagos residentes semeiam seu tecido durante o desenvolvimento, onde são mantidos sem mais entrada de progenitores. Os progenitores para macrófagos residentes foram identificados recentemente. Aqui, apresentamos métodos para o mapeamento do destino genético dos progenitores de macrófagos residentes.

Identificação de progenitores eritromoelóides e sua progênie no embrião de mouse por citometria de fluxo

Detecção de doença residual mínima ou mensurável (MRD) é um biomarcador prognóstico importante para avaliação do risco de refinação e predizer a recaída em leucemia mieloide aguda (LMA). Estas orientações abrangentes e recomendações com as melhores práticas para consistente e exata identificação e detecção de MRD, pode ajudar na tomada de decisões de tratamento eficazes AML.

Protocolo abrangente de amostra e da medula óssea do processo de medição de doença Residual mensurável e células leucêmicas em leucemia mieloide aguda

Nós esboçamos um protocolo para detectar a expressão simultânea de marcadores de células estaminais de leucemia em células de leucemia mieloide aguda primária por citometria de fluxo. Nós mostramos como quantificar três populações de progenitor e uma população de LSC putativa com crescente grau de maturação. Confirmamos a presença dessas populações no correspondentes paciente-derivada-xenografts.

Fluxo Cytometry para estimar leucemia células-tronco na leucemia mieloide aguda primária e no paciente-derivada-xenografts, diagnóstico e segue até

Descrevemos aqui uma simples análise da heterogeneidade do compartimento de células B imunes da murina nos tecidos peritônio, baço e medula óssea por citometria de fluxo. O protocolo pode ser adaptado e estendido a outros tecidos do mouse.

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Aqui, descrevemos um protocolo simples para o isolamento e coloração de células murinas da medula óssea para fenótipo de células-tronco hemopoéticas e progenitoras, juntamente com células-tronco endoteliais e mesenquimais de nicho de suporte. Um método para enriquecer células localizadas em áreas endosteal e medula óssea central também é incluído.

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O presente protocolo descreve um método econômico para purificar, expandir e caracterizar células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMSCs) altamente homogêneas de camundongos. Essa abordagem facilita a aquisição de grandes quantidades de BMSCs com alto potencial de proliferação e diferenciação, apoiando modelos de camundongos e avançando na pesquisa pré-clínica.

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Preparação de Mielóides derivadas de células supressoras (MDSC) de ingênuos e pâncreas Tumor-rolamento Ratos utilizando citometria de fluxo e separação de células automatizado magnético ativado (AutoMACS)

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