Name: Na Vivo Microdialysis método para coletar grandes proteínas Extracellular do cérebro líquido intersticial com corte de alto peso molecular Probes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 17 s
Description: Aprenda microdialise in vivo com sondas de alto peso molecular para coletar grandes proteínas do líquido intersticial cerebral em animais acordados e livres. Este método permite estudar sinalização neural e eliminação de resíduos.

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Este trabalho foi apoiado pela ' subsídio para a investigação científica em áreas inovadoras (cérebro proteína envelhecimento e demência Control)(15H01552) do MEXT e subsídio para jovens cientistas (B) (16K 20969). O autor agradece Dr. David M. Holtzman e Dr. John R. Cirrito para os conselhos técnicos durante o desenvolvimento deste método.

Todos os estudos em animais foram revistos e aprovados pelo Comitê de uso da pós-graduação da faculdade de medicina da Universidade de Tóquio e institucional Cuidado Animal.
1. pré-cirúrgico
<ol><li>Antes de iniciar a cirurgia, limpe tudo com etanol a 70% para manter condições estéreis. Recomenda-se apoio térmico usando uma almofada de aquecimento.</li>
	<li>Anestesia os ratos por injeção intraperitoneal de hidrato de cloral (400 mg/kg). Confirme anesthetization realizando uma pitada de dedo do pé. Recomenda-se o uso de meloxicam SR na indução e buprenorfina após a tentativa de recuperação pelo menos 24 h.</li>
	<li>Raspe o cabelo com uma tesoura cirúrgica. Conserte um mouse no mouse e adaptador de rato neonatal usando barras de orelha e uma pinça de nariz. Nota: É fundamental para garantir que essa cabeça de rato é protegida nesta fase e não se move side-by-side.</li>
	<li>Aplica o vet pomada nos olhos para evitar ressecamento enquanto sob anestesia.</li>
</ol>2. estereotáxica cirurgia para implantação de cânula guia
<ol><li>Defina o rato e o rato neonatal adaptador sobre o aparelho estereotáxica. Fazer uma incisão essas na pele sobre o crânio com um bisturi.　Limpe o sangue e o tecido conjuntivo no crânio usando um cotonete úmido.</li>
	<li>Determine a coordenada para a região do cérebro de interesse usando o atlas do cérebro. Antes de iniciar as medições, certifique-se que na linha média é em linha reta para que a broca pode ser movido A-P e permanecem, na sutura mediana, o tempo todo. Nota: Este artigo usa a coordenada (A / p:-3,10 mm, M/l:-2,50 mm, D/v:-1,20 mm, 12 graus) para direcionar o hipocampo posterior.</li>
	<li>Crânio de nível A-P<ol>
<li>Anexe uma broca em um manipulador de armação estereotáxica. Baixe a broca até que toca suavemente lambda e gravar seu coordenar ventral. Repita este procedimento para bregma. Nota: Quando o crânio é nivelado, a medida vertical do bregma é igual do lambda. Se não, ajuste de altura do grampo do nariz em conformidade. Depois que o crânio fica nivelado, grave a coordenada anterior/posterior, lateral do bregma.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nível crânio esquerda-direita<ol>
<li>Mova a broca de bregma para a coordenada (A / p:-3,10 mm, M/l: +2,0 mm), reduzir a perfuração no crânio e gravar a coordenada vertical. Em seguida, repita este procedimento para a coordenada (A / p:-3,10 mm, M/l:-2,00 mm). Nota: Se o crânio é nivelado, estas medições verticais de dois pontos equidistantes da linha média são iguais. Caso contrário, ajuste a altura das barras de orelha.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Faça um furo de rebarba cuidadosamente na coordenada alvo (A / p:-3,10 mm, M/l:-2,50 mm) para implantar uma cânula guia. Se o diâmetro de um orifício de trépano não é grande o suficiente para uma implantação de cânula guia, faça outro furo que se sobrepõe com o primeiro. Faça outro furo no osso parietal direito (lado contralateral) e inserir um parafuso ósseo, que ajuda a proteger o cimento dental em 1.10 (ver figura 1B).</li>
	<li>Cortar uma peça de fixação circular da parte traseira da tampa do tubo de centrífuga 1,5 mL por uma lâmina de barbear e fazer uma 'coroa '. Esta coroa é usada para evitar cimento dental propagação à pele. Coloque-o no crânio para que a trepanação feita na etapa 2.5 fique dentro do círculo (ver Figura 1).</li>
	<li>Criar uma assembleia estereotáxica, colocando uma cânula guia no braço mais curto de um adaptador estereotáxica e fixá-la usando uma porca. Defina o braço mais comprido do adaptador estereotáxica no grampo do eletrodo. Anexá-lo sobre a manipulação do aparato estereotáxica (ver figura 1A).</li>
	<li>Rode o conjunto de stereotax de D-V no braço manipulador por 12 graus (ver figura 1B). Mova a cânula guia para o orifício de trépano feito em 1.6. Inserir a cânula guia lentamente o cérebro por abaixá-la por 1,2 mm. Nota: O ângulo da sonda é específico para o hipocampo; outras regiões podem exigir outros ângulos ou nenhum ângulo em tudo. Consulte um atlas do cérebro para as coordenadas precisas. Secar a superfície do crânio, porque se não o cimento não furará e tampão de cimento pode tornar-se desalojado.</li>
	<li>Adicione o cimento dental dentro da coroa para cobrir totalmente as duas parte metálica da cânula do guia e do parafuso ósseo suficiente para fixá-los. Aplique o cimento dental adicional se houver uma parte do crânio exposta.</li>
	<li>Espere até cimento dental está completamente seco (~ 12 / 20 min). Remova o adaptador estereotáxica da braçadeira do eletrodo. Remova a porca e substituir o adaptador estereotáxica com uma sonda de manequim e aperte a porca.</li>
	<li>Solte o mouse do aparelho estereotáxica e o mouse sozinho em uma gaiola individual de casa. Nota: O mouse não deve ser deixado sem supervisão até que recuperou a consciência suficiente para manter a prostração esternal. Verificar o mouse diariamente até o dia do microdialysis. O rato recebe AINEs como carprofeno se parece estar com dor. À espera 2 semanas é necessária para estudos do sono para que o mouse habitua-se ao novo ambiente de10, mas outros tipos de estudos podem exigir períodos de recuperação mais curtos (por exemplo, 1-2 dias).</li>
</ol>3. Microdialysis Setup
<ol><li>Verificação da qualidade das sondas: Encha uma seringa descartável 1ml com água destilada e conectá-lo à tomada (porto mais curto) de uma sonda usando um tubo de byton. Cubra os orifícios de ventilação com os dedos e pressione o êmbolo da seringa com cuidado para infundir água à sonda. Verifique a água aparece de entrada da sonda e não há nenhum vazamento na superfície de uma membrana microdialysis.<ol>
<li>Ativação de sondas: submergir as membranas de uma sonda no álcool etílico (70-100%) por dois segundos. Em seguida, infundi água destilada na sonda novamente com uma seringa novamente.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparação do buffer de perfusão: a fim de evitar a adesão de moléculas-alvo para as tubulações, adicionar BSA por diluir a solução de BSA de 30% para 4% com CSF artificial (1,3 mM CaCl2, 1,2 mM de MgSO4, 3 mM KCl, 0,4 mM KH2PO4, 25mm NaHCO3 , 122 mM NaCl, pH = 7,35), que corresponde a concentração de eletrólito no CSF, imediatamente antes da utilização. Filtre o buffer de perfusão através de uma unidade de filtro de seringa com tamanho de poro 0.1 µm. Nota: BSA 4% melhora a recuperação para furar as proteínas mas pode limitar severamente a entrega de compostos, especialmente para compostos com BSA-Associação de alta. Esta é uma vantagem de usar a menor concentração de BSA (tais como 0,15%) em certas instâncias,3. Observe que BSA pode agregar muito facilmente quando agitado pela placa de vórtice ou agitação. Estes agregados podem entupir sondas ou poros da membrana. Tenha cuidado ao preparar uma solução de BSA para limitar esta agregação</li>
	<li>Preparar duas linhas separadas para entrada e saída (ver Figura 1) e conectar as duas linhas com uma agulha de conexão. Encher uma seringa descartável 3ml preenchida com buffer de perfusão e conectá-lo com o fim da entrada da tubulação usando uma agulha sem corte-extremidade. Encha o tubo inteiro com buffer de perfusão executando a bomba de seringa.</li>
	<li>Parar a bomba de seringa e substituir a agulha de conexão entre a linha de entrada e saída linha com uma sonda microdialysis registrados da etapa 3.3 (ver Figura 1). Antes esta substituição, coloque a porca a sonda.</li>
	<li>Monte o tubo do rolo na tubulação de saída sobre a bomba de roletes. Começa a bomba de seringa em 10 µ l/min e, em seguida, a bomba de roletes na taxa de fluxo um pouco mais lenta (9.5-9,8 µ l/min). Certifique-se de remover todas as bolhas de ar na tubulação de todo, que pode influenciar a recuperação quando eles entram a sonda.</li>
	<li>Anestesia o mouse da etapa 1.12 da mesma forma como na etapa 1.2. Coloque a coleira do mouse ao redor de seu pescoço. Remova a porca e a sonda fictícia e lentamente inserir uma sonda microdialysis de 3.4 através da cânula de guia e aperte a porca.</li>
	<li>Lugar o rato na gaiola conectado a um sistema de movimentação livre e baraço o mouse com o colar. Continuará operando tanto a bomba de seringa e a bomba de roletes com a taxa de fluxo indicado no passo 3.5 pelo menos 1 h. Nota: Para obter a coleção de ISF de animais acordados, este artigo usa um sistema de movimentação livre, onde a gaiola em si responde ao movimento do animal para impedir a torção de tubulações. Como alternativa, disponível a partir de várias empresas líquida gira pode ser usada também.</li>
	<li>Parar o cilindro de bomba primeiro e, em seguida, a bomba de seringa. Defina a taxa de fluxo desejada. Execute a seringa da bomba 20% mais rápido do que a bomba de roletes. Nota: por exemplo, se você executar em 1 µ l/min, operar a bomba de seringa de 1.2 µ l/min. taxa de fluxo ideal deve ser determinada empiricamente, para cada molécula.</li>
	<li>Coletando amostras ISF: colocar a extremidade livre do tubo de saída no coletor de fração refrigerados. Nota: Volume de amostra adequada varia de acordo com os ensaios utilizados para análise.</li>
	<li>Após a conclusão do experimento, retire a sonda. (Anestesiar o mouse conforme necessário.)  Lidar com recuperação de rato da mesma forma como na etapa 2.11. Analise o ISF coletado por métodos tais como HPLC ou ELISA.</li>
	<li>Para lavar o tubo inteiro após microdialysis, conectar a entrada e tubulações da tomada novamente, substituindo a sonda com a conexão da agulha e corrercom a água sanitária diluída na tubulação de todo e em seguida nivelá-lo com água. Secar e armazená-lo para uso repetido. Nota: Outros tipos de tubulações são aceitáveis, no entanto, BSA no buffer de perfusão pode obstruir as tubulações com diâmetro pequeno, assim, essas tubulações são consideradas como de uso único. As tubulações podem ser desgastadas ou obstruídos após várias utilizações, certifique-se que a taxa de fluxo é consistente toda vez antes de usar.</li>
</ol>

<ol><li>Lei, Y., Han, H., Yuan, F., Javeed, A., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+interstitial+system%3A+Anatomy%2C+modeling%2C+in+vivo+measurement%2C+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">The brain interstitial system: Anatomy, modeling, in vivo measurement, and applications.</a> Progress in Neurobiology. 157, 230-246 (2017).</li>
<li>Kushikata, T., Hirota, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+microdialysis+in+free-moving+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide microdialysis in free-moving animals.</a> Methods in Molecular Biology. 789, 261-269 (2011).</li>
<li>Cirrito, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+assessment+of+brain+interstitial+fluid+with+microdialysis+reveals+plaque-associated+changes+in+amyloid-beta+metabolism+and+half-life%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo assessment of brain interstitial fluid with microdialysis reveals plaque-associated changes in amyloid-beta metabolism and half-life.</a> The Journal of Neuroscience. 23 (26), 8844-8853 (2003).</li>
<li>Emmanouilidou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+%CE%B1-synuclein+secretion+in+mouse+and+human+brain+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Assessment of α-synuclein secretion in mouse and human brain parenchyma.</a> PLoS One. 6 (7), 1-9 (2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+microdialysis+reveals+age-dependent+decrease+of+brain+interstitial+fluid+tau+levels+in+P301S+human+tau+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo microdialysis reveals age-dependent decrease of brain interstitial fluid tau levels in P301S human tau transgenic mice.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (37), 13110-13117 (2011).</li>
<li>Ulrich, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+measurement+of+apolipoprotein+E+from+the+brain+interstitial+fluid+using+microdialysis%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">In vivo measurement of apolipoprotein E from the brain interstitial fluid using microdialysis.</a> Molecular Neurodegeneration. 8 (1), 13(2013).</li>
<li>Emmanouilidou, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABA+transmission+via+ATP-dependent+K%2B+channels+regulates+%CE%B1-synuclein+secretion+in+mouse+striatum%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">GABA transmission via ATP-dependent K+ channels regulates α-synuclein secretion in mouse striatum.</a> Brain. 139 (3), 871-890 (2016).</li>
<li>Takeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Seed-competent+high-molecular-weight+tau+species+accumulates+in+the+cerebrospinal+fluid+of+Alzheimer%27s+disease+mouse+model+and+human+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Seed-competent high-molecular-weight tau species accumulates in the cerebrospinal fluid of Alzheimer's disease mouse model and human patients.</a> Annals of Neurology. 80 (3), 355-367 (2016).</li>
<li>Yamada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+Microdialysis+of+brain+interstitial+fluid+for+the+determination+of+extracellular+tau+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">In vivo Microdialysis of brain interstitial fluid for the determination of extracellular tau levels.</a> Methods in Molecular Biology. 1523, 285-296 (2017).</li>
<li>Kang, J. -E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amyloid-%CE%B2+dynamics+are+regulated+by+orexin+and+the+sleep-wake+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Amyloid-β dynamics are regulated by orexin and the sleep-wake cycle.</a> Science. 326 (November), 1005-1008 (2009).</li>
<li>Cirrito, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+activity+regulates+interstitial+fluid+amyloid-beta+levels+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Synaptic activity regulates interstitial fluid amyloid-beta levels in vivo.</a> Neuron. 48 (6), 913-922 (2005).</li>
<li>Bero, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+the+regional+vulnerability+to+amyloid-%CE%B2+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates the regional vulnerability to amyloid-β deposition.</a> Nature Neuroscience. 14 (6), 750-756 (2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+activity+regulates+extracellular+tau+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Medicine%22%5BJournal%5D)">Neuronal activity regulates extracellular tau in vivo.</a> Journal of Experimental Medicine. 211 (3), 387-393 (2014).</li>
<li>Pooler, A. M., Phillips, E. C., Lau, D. H. W., Noble, W., Hanger, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+release+of+endogenous+tau+is+stimulated+by+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Physiological release of endogenous tau is stimulated by neuronal activity.</a> EMBO Reports. 14 (4), 389-394 (2013).</li>
<li>Castellano, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+apoE+isoforms+differentially+regulate+brain+amyloid-%CE%B2+peptide+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human apoE isoforms differentially regulate brain amyloid-β peptide clearance.</a> Science Translational Medicine. 3 (89), 89ra57(2011).</li>
<li>Yamada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+in+vivo+turnover+of+tau+in+a+mouse+model+of+tauopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurodegeneration%22%5BJournal%5D)">Analysis of in vivo turnover of tau in a mouse model of tauopathy.</a> Molecular Neurodegeneration. 10 (1), 55(2015).</li>
<li>Taylor, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+local+and+long-range+neuronal+network+dynamics+by+simultaneous+optogenetics%2C+reverse+microdialysis+and+silicon+probe+recordings+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Investigating local and long-range neuronal network dynamics by simultaneous optogenetics, reverse microdialysis and silicon probe recordings in vivo.</a> Journal of Neuroscience Methods. 235, 83-91 (2014).</li>
</ol>

O autor não tem nada para divulgar.

Microdialysis com alto peso molecular, cortar as membranas tem que ser operado por um modo de encaixe, assim, é fundamental que a taxa de fluxo é precisa e constante. A imprecisão nas taxas de fluxo pode ser a causa da geração de bolhas de ar e inconsistência da concentração da amostra. Se o fluxo é inconsistente, verifique todas as conexões para detecção de fugas. Se o problema persistir, pode ser necessário para re-iniciar com tubulações e novas sondas.
Microdilaysis sondas continuamente são...

ISF é composto por 15-20% do volume total do cérebro e oferece um microambiente crítica para a transdução de sinal, transporte de substrato e afastamento de resíduos1. Portanto, a capacidade de coletar ISF de animais vivos proporcionará maiores implicações para diversos processos biológicos, bem como o mecanismo da doença. Na vivo microdialysis é um dos poucos métodos que a amostra e quantificar extracelulares moléculas do ISF de acordado, movimentando-se livremente os animais e, assim, serve como uma ferramenta útil na neurociência pesquisa campo2,3. Neste método, microdialysis sondas com membrana semipermeável são inseridas no cérebro e perfundidas com perfusão na taxa de fluxo relativamente lento (0.1-5 µ l/min). Durante esta perfusão, moléculas extracelulares em ISF passivamente a sonda de acordo com o gradiente de concentração se espalham e recolher como um dialisato. Embora este artigo centra-se sobre o método a amostra ISF no cérebro, tanto o princípio e o método podem ser aplicados a outros órgãos por modificação apropriada se necessário.
Microdialysis primeiro foi empregado na década de 1960 e desde então ela tem sido extensivamente usada para coletar pequenas moléculas incluindo aminoácidos ou neurotransmissores no cérebro. No entanto, recente disponibilidade comercial do microdialysis sondas com alto peso molecular cortar membranas (100 kDa-3 MDa) estendeu sua aplicação às proteínas relativamente maiores no ISF, bem4,5,6 ,7. Os estudos usando estas sondas levou à constatação que proteínas como tau ou α-synuclein que há muito se julgava ser exclusivo citoplasmático também são fisiologicamente presente no ISF4,5,8.
Uma das dificuldades usando sondas microdialysis com grande corte de membranas (normalmente mais de 1.000 kDa) é que eles são mais suscetíveis à perda de líquidos ultrafiltração, devido à pressão interna acumulada nas sondas. Microdialysis sondas usadas aqui tem uma estrutura única para evitar esse problema. A pressão não irá ser construída devido a essa estrutura, assim microdialysis com estas sondas deve ser operado em um modo de "push-pull" usando uma bomba de seringa para perfundir as sondas (= impulso) e uma rolo/peristáltica para coletar a vinda do fluído da tomada da sonda (= puxar) 9 (embora precisa de push e pull de bombas, devido à pressão, cancelando os orifícios de ventilação, presente nas sondas, o sistema é tecnicamente apenas impulsionado pela bomba puxar). Este artigo começa com a cirurgia estereotáxica de uma implantação de cânula guia e descreve como criar linhas microdialysis para coletar ISF através das sondas microdialysis com 1.000 membranas de Cut-off de kDa.

<table><tbody><tr><td>O Univentor 820 Microsampler</td><td>Univentor</td><td>8303002</td><td>Coletor de frações refrigerado</td></tr><tr><td>Bomba de seringa</td><td>KD scientific</td><td>KDS-101</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de rolo</td><td>Microdiálise Eicom</td><td>ERP-10</td><td></td></tr><tr><td>Raturn Sistema autônomo</td><td>BASi</td><td>MD-1409</td><td>Sistema de movimento livre</td></tr><tr><td>Kit de gaiola de espécies duplas</td><td>BASi</td><td>CX-1600</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de microdiálise AtmosLM (comprimento do eixo 8 mm, comprimento da membrana 2 mm)</td><td>Microdiálise Eicom</td><td>PEP-8-02</td><td>O comprimento do eixo para uma sonda, uma guia, uma sonda dumy e um adaptador estereotáxico deve ser idêntico.</td></tr><tr><td>Guia de microdiálise (comprimento do eixo 8 mm)</td>Sonda fictícia de <td>microdiálise Eicom</td><td>PEG-8</td><td></td></tr><tr><td>(comprimento do eixo 8 mm)</td><td>Parafuso ósseo Eicom Microdiálise</td><td>PED-8</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BASi</td><td>MD-1310</td><td></td></tr><tr><td>Super bond C& B set</td><td>Sunmedical</td><td></td><td>Cimento dentário</td></tr><tr><td>Instrumento estereotáxico para pequenos animais com consola de visualização digital</td><td>Kopf</td><td>Modelo 940</td><td>Aparelho estereotáxico</td></tr><tr><td>Adaptador para rato e rato neonatal</td><td>Stoelting</td><td>51625</td><td></td></tr><tr><td>Barras auriculares padrão e pontas de borracha para estojo estereotáxico de rato</td><td></td><td>51648</td><td></td></tr><tr><td>Solução de albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A7284-50ML</td><td>30% BSA solução</td></tr><tr><td>FEP tubulação (70 cm)</td> <td>Eicom microdiálise</td><td>JF-10-70</td><td>Volume interno = 0,5 &micro; Tubo de Teflon L/cm</td></tr><tr><td>(50 cm)</td><td>Microdiálise Eicom</td><td>JT-10-50</td><td>Volume interno = 0,08 &micro; Tubo Byton de L/cm</td></tr><tr><td></td><td>Microdiálise Eicom</td><td>JB-30</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de facada luer intramédico 23G</td><td>BD</td><td>427565</td><td>Agulha de extremidade romba</td></tr><tr><td>Tubo de rolo</td><td>Microdiálise</td><td>Eicom RT-5S</td><td>Volume interno = 4 &micro; L</td></tr><tr><td>Porca de capa</td><td>Eicom microdiálise</td><td>AC-5</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de microcentrífuga de 0,25 mL com tampa</td><td>QSP</td><td>503-Q</td><td>Tubos para coletor de frações</td></tr><tr><td>Adaptador estereotáxico (comprimento do eixo 8 mm)</td><td>Microdiálise Eicom</td><td>PESG-8</td><td></td></tr><tr><td>Agulha de conexão</td><td>Microdiálise Eicom RTJ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Coleira para animais de rato</td><td>BASi</td><td>MD-1365</td><td></td></tr><tr><td>Kit de micromotor rotativo de alta velocidade</td><td>FOREDOM</td><td>K.1070</td><td>Broca</td></tr><tr><td>Picrotoxina</td><td>Sigma</td><td>P1675</td><td></td></tr><tr><td>Chave de fenda para parafusos</td><td></td><td></td><td></td>ósseos</tr><tr><td>Bisturi</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cotonete</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de algodão Tosquiadeira cirúrgica</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

na vivo microdialysis método para coletar grandes proteínas extracellular do cérebro líquido intersticial com corte de alto peso molecular probes

In Vivo Microdialysis Method to Collect Large Extracellular Proteins from Brain Interstitial Fluid with High-molecular Weight Cut-off Probes

Na vivo microdialysis é uma técnica poderosa para coletar ISF de animais acordados, livremente-comportando-se com base em um princípio de diálise. Enquanto microdialysis é um método estabelecido que mede relativamente pequenas moléculas incluindo aminoácidos ou neurotransmissores, ela tem sido usada recentemente para avaliar também a dinâmica de moléculas maiores em ISF usando sondas com alto peso molecular, cortar membranas. Ao usar tais sondas, microdialysis tem de ser executado em um modo de encaixe para evitar pressão acumulada dentro as sondas. Este artigo fornece protocolos passo a passo, incluindo cirurgia estereotáxica e como configurar microdialysis linhas para coletar as proteínas do ISF. Durante microdialysis, medicamentos podem ser administrados sistemicamente ou por infusão direta no ISF. Microdialysis reversa é uma técnica para infundir diretamente compostos no ISF. Inclusão de drogas no buffer de perfusão microdialysis permite que eles se espalham ISF através de sondas, recolhendo simultaneamente ISF. Medindo a proteína tau, por exemplo, o autor mostra como seus níveis são alterados mediante estimulante atividade neuronal por microdialysis reversa de Picrotoxina. Vantagens e limitações do microdialysis são descritas juntamente com o aplicativo estendido pela combinação de outros métodos na vivo .

Para estimular ou inibir a atividade neuronal em reverso microdialysis11,12,13, Picrotoxina, antagonista dos receptores GABAA ou tetrodotoxina, bloqueador de canal de at+ têm sido utilizados. Ficou demonstrado que a liberação de tau é estimulada pelo aumento da atividade neuronal13,14. Consistente com estas observaçõ...

Na vivo microdialysis permitiu a coleção de moléculas presentes no líquido intersticial do cérebro (ISF) de animais acordados, se comportando livremente. Para analisar moléculas relativamente grandes no ISF, o atual artigo enfoca especificamente o protocolo microdialysis usando sondas com alto peso molecular, cortar as membranas.

Na Vivo Microdialysis método para coletar grandes proteínas Extracellular do cérebro líquido intersticial com corte de alto peso molecular Probes

In vivo microdialysis is a powerful technique to collect ISF from awake, freely-behaving animals based on a dialysis principle. While microdialysis is an ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de pesquisa em neurociência sobre como o transporte de substrato de transdução de sinal e uma liberação de resíduos ocorrem nos espaços extracelulares cerebrais. A principal vantagem desta técnica é que permite a amostragem e quantificação de grandes moléculas extracelulares no Fluido Intersticial ou ISF de animais acordados livremente. Depois de confirmar a falta de resposta ao aperto do dedo do pé, remova o cabelo do crânio de um rato anestesiado e use as barras de ouvido e um grampo no nariz para fixar o animal em um adaptador.Aplique pomada nos olhos do animal e coloque o adaptador no aparelho estereotaxico. Use um bisturi para fazer uma incisão de pele sagiticamente sobre o crânio e anexar uma broca ao manipulador do quadro estereotaxista. Abaixe a broca até que toque suavemente na lambda e reinicie a coordenada DV da broca a zero.Em seguida, mova a broca para bregma para redefinição das coordenadas AP e ML para zero. Mova a broca de bregma para a coordenada vertical. Abaixe a broca para o crânio e coloque a coordenada DV para zero novamente.Depois de repetir o procedimento para uma terceira coordenada, faça um orifício de rebarba cuidadosamente na coordenada do alvo, seguido por um segundo orifício no lado contralateral do osso parietal. Insira um parafuso ósseo no segundo orifício e coloque a peça de bloqueio de uma tampa de tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro no crânio para que os orifícios de rebarba estejam dentro do círculo. Em seguida, coloque uma cânula guia no braço mais curto do adaptador estereotaxic e aperte a cânula com uma porca de tampa.Coloque o braço mais longo do adaptador estereotaxico no grampo de eletrodo e fixe o braço no manipulador do aparelho estereotaxico. Gire o conjunto estereotaxic DV no braço manipulador em 12 graus e mova a cânula guia para o orifício da rebarba. Em seguida, abaixe lentamente a cânula guia 1,2 milímetros no cérebro.Adicione cimento dental à coroa até que a parte metálica da cânula guia, o parafuso ósseo e qualquer crânio exposto estejam cobertos e protegidos e permitam que o cimento seque. Após 12 a 20 minutos, remova o adaptador estereotaxico do grampo de eletrodo, remova a tampa e substitua o adaptador estereotílico por uma sonda falsa. Em seguida, refasten a tampa, solte o mouse do aparelho estereotaxic, e abriga o mouse sozinho em uma gaiola individual.Antes de configurar a microdiálise, encha uma seringa descartável de um mililitro com água destilada e use um tubo de viton para conectar a seringa à saída de uma sonda de microdiálise. Cubra manualmente os orifícios de ventilação e pressione suavemente o êmbolo da seringa para infundir a sonda com água. Confirme se a água aparece na entrada da sonda e que há vazamento na superfície da membrana de microdiálise.Para ativar a sonda, submergir as membranas da sonda em 70-100% etanol por dois segundos, seguido por uma segunda infusão de água destilada. Conecte uma agulha de conexão a uma entrada e uma linha de saída e carregue uma seringa descartável de três mililitros com tampão de perfusão recém-preparado. Conecte uma seringa equipada com uma agulha de ponta cega à extremidade da entrada da tubulação e use uma bomba de seringa para encher todo o tubo com tampão de perfusão.Quando o tubo estiver cheio, substitua a agulha de conexão entre as linhas de entrada e saída com a sonda de microdiálise ativada e a porca da tampa e monte um tubo de rolo na tubulação de saída em uma bomba de rolo. Inicie a bomba de seringa a 10 microliters por minuto e a bomba do rolo em 9,5-9,8 microliters por minuto. Agora coloque a coleira ao redor do pescoço do animal anestoetizado de cânula implantada e remova a porca da tampa e a sonda falsa.Insira lentamente a sonda de microdiálise através da cânula guia e aperte a porca da tampa. Em seguida, coloque o mouse em uma gaiola conectada a um sistema de movimento livre e amarre o mouse com a coleira. Após pelo menos uma hora, pare sequencialmente a bomba de rolo e a bomba de seringa, reiniciando as bombas com a bomba de seringa definida para 20% mais rápida que a bomba de rolo e coloque a extremidade livre da tubulação de saída em um coletor de frações refrigerado para coletar o ISF cerebral.Quando o volume experimental apropriado tiver sido obtido, remova a sonda e manuseie a recuperação do mouse como apenas demonstrado. Consistente com observações anteriores, quando 50 picrotoxinas micromolar é administrada via microdiálise reversa como demonstrado em camundongos C57B6J acordados, observa-se um aumento nos níveis de tau endógeno intersticicial em comparação com os níveis medidos em animais tratados com controle de veículos. Além das administrações de medicamentos, a microdiálise pode ser combinada com outros métodos in vivo, como gravação de EEG ou optogenética, para responder a perguntas adicionais sobre como a atividade neuronal influencia a concentração de substrato no ISF.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

O acompanhamento dos níveis de neurotransmissores extracelular em regiões distintas do cérebro de animais que circulam livremente oferece insights sobre a relação entre a liberação do neurotransmissor e comportamento. Em microdiálise in vivo juntamente com detecção eletroquímica fornece anatômicas excelentes e resolução de química; e informações sobre como a neurotransmissão basal é alterada por manipulações farmacológicas ou fisiológicas.

Cirurgia estereotáxica sobrevivência em Roedores

Modulação da hippocampally dependente de memória espacial de trabalho por microinjeção intrahippocampal direta, acompanhado e seguido...

Microinjeção insulina hipocampal e<em&gt; Em vivo</em&gt; Microdiálise Durante um teste de memória espacial

O vídeo demonstra o processo de uso de uma sonda de microdiálise para coletar proteínas extracelulares do fluido intersticial (ISF) do cérebro de um camundongo. Uma sonda de microdiálise, equipada com uma membrana semipermeável de corte de alto peso molecular, é inserida no cérebro de um camundongo anestesiado por meio de uma cânula guia implantada. A sonda, conectada a bombas, permite que um tampão fisiológico perfunda o tecido cerebral e se misture com o ISF. As proteínas do FSI se difundem...

Microdiálise de fluido intersticial de um cérebro de camundongo para isolar proteínas extracelulares

Um protocolo de extração de proteínas comum utilizando tampão uréia / tiouréia / SDS para tecido cerebral humano e camundongos permite indentification de proteínas por 2D-DIGE e sua posterior caracterização por mini-immunoblotting 2DE. Este método permite a obtenção de resultados mais reprodutíveis e confiáveis ​​a partir de biópsias humanos e modelos experimentais.

Proteína Consenso Brain-derivada, protocolo de extração para o Estudo do cérebro humano e murino Proteome Usando ambas 2D DIGE e Mini 2DE Immunoblotting

Microdiálise é uma técnica comumente usada em pesquisas de neurociência. Portanto sondas comerciais estão em grande demand.In neste trabalho um conjunto de sonda é explicado em detalhes para construir um concêntrico, sonda de microdiálise confiável, feito sob medida para menos de 10 dólares.

Custom-made Microdiálise Probe projeto

Aqui, um método para isolamento de microvessels de cérebro de rato e para a preparação de amostras de membrana é descrito. Este protocolo tem a clara vantagem de produzir microvessel enriquecido amostras com proteína aceitável de rendimento de animais individuais. Amostras podem ser usadas para as análises de proteína robusto no endotélio microvascular cerebral.

Um método simples e reprodutível para preparar amostras de membrana de Microvessels de cérebro de rato recém isoladas

Aqui, descrevemos um método na vivo microdialysis analisar a liberação de aspartato e glutamato no hipocampo ventral de ratos epilépticos e não-epiléptica, em combinação com gravações de EEG. Concentrações extracelulares de aspartato e glutamato podem ser correlacionadas com as diferentes fases da doença.

Microdialysis de aminoácidos excitatórios durante as gravações de EEG em ratos movimentando-se livremente

O protocolo aqui fornece uma amostragem dinâmica detalhada em tempo real do fluido extracelular do hipocampo de ratos acordados usando um sistema de microdiálise.

Coleta Dinâmica em Tempo Real de Fluido Extracelular do Hipocampo de Ratos Conscientes Usando um Sistema de Microdiálise

In vivo, as comunicações intercelulares que sustentam muitas doenças do sistema nervoso central, como o glioblastoma (GBM), são notoriamente difíceis de medir e caracterizar. Aqui, descrevemos procedimentos de microperfusão cerebral de fluxo aberto (cOFM) que podem ser empregados para amostrar componentes de fluido intersticial em um modelo animal longitudinal da GBM.

Uso da microperfusão cerebral de fluxo aberto para a coleta longitudinal de fluido intersticial em um modelo animal de glioblastoma

Gravações extracelular da atividade neuronal utilizando sondas de silício no rato anestesiado serão descritas. Esta técnica permite obter informação através de múltiplas áreas do cérebro de mais de 100 neurônios simultaneamente. Ele fornece informações com resolução única célula neuronal sobre a dinâmica conjuntos em vários circuitos locais.

Gravação em grande escala Ensembles Neuronal com Sondas Silício na rato anestesiado

Aprenda microdialise in vivo com sondas de alto peso molecular para coletar grandes proteínas do líquido intersticial cerebral em animais acordados e livres. Este método permite estudar sinalização neural e eliminação de resíduos.

Na Vivo Microdialysis método para coletar grandes proteínas Extracellular do cérebro líquido intersticial com corte de alto peso molecular Probes (Vídeo) | JoVE Journal

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