Name: Cultura e transfecção de células primárias de Zebrafish (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Aprenda a cultivar e transfectar células primárias de zebrafish para estudos de dinâmica intercelular em neurociência e biologia celular. Este método permite imagem celular em tempo real com alta resolução.

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Agradecemos a T. Fritsch, A. lobo-Asseburg, I. Linde e S.-M. Tokarski para excelentes cuidados com animais e suporte técnico. Agradecemos a todos os membros do laboratório Köster discussões intensas e útil. Reconhecemos com gratidão financiamento pela Deutsche Forschungsgemeinschaft (KO 1949/5-1) e o Estado Federal da Baixa Saxónia, Niedersächsisches Vorab (VWZN2889).

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<li>Gupta, T., Mullins, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+organs+from+the+adult+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Dissection of organs from the adult zebrafish.</a> Journal of Visualized Experiments. 37, E1717(2010).</li>
<li>Chalfie, M., Tu, Y., Euskirchen, G., Ward, W. W., Prasher, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Green+fluorescent+protein+as+a+marker+for+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Green fluorescent protein as a marker for gene expression.</a> Science. 263, 802-805 (1994).</li>
<li>Stornaiuolo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KDEL+and+KKXX+retrieval+signals+appended+to+the+same+reporter+protein+determine+different+trafficking+between+endoplasmic+reticulum%2C+intermediate+compartment%2C+and+Golgi+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">KDEL and KKXX retrieval signals appended to the same reporter protein determine different trafficking between endoplasmic reticulum, intermediate compartment, and Golgi complex.</a> Molecular Biology of the Cell. 14, 889-902 (2003).</li>
<li>Lithgow, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+proteins+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Letters%22%5BJournal%5D)">Targeting of proteins to mitochondria.</a> FEBS Letters. 476, 22-26 (2000).</li>
<li>Nagai, T., Ibata, K., Park, E. S., Kubota, M., Mikoshiba, K., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variant+of+yellow+fluorescent+protein+with+fast+and+efficient+maturation+for+cell-biological+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications.</a> Nature Biotechnology. 20, 87-90 (2002).</li>
<li>Sassen, W. A., Lehne, F., Russo, G., Wargenau, S., Dübel, S., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+zebrafish+primary+cell+culture+for+transfection+and+live+cellular+and+subcellular+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Embryonic zebrafish primary cell culture for transfection and live cellular and subcellular imaging.</a> Developmental Biology. 430, 18-31 (2017).</li>
<li>Horesh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doublecortin%2C+a+stabilizer+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Doublecortin, a stabilizer of microtubules.</a> Human Molecular Genetics. 8, 1599-1610 (1999).</li>
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<li>Distel, M., Hocking, J. C., Volkmann, K., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+centrosome+neither+persistently+leads+migration+nor+determines+the+site+of+axonogenesis+in+migrating+neurons+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The centrosome neither persistently leads migration nor determines the site of axonogenesis in migrating neurons in vivo.</a> Journal of Cell Biology. 191, 875-890 (2010).</li>
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<li>Shaner, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bright+monomeric+green+fluorescent+protein+derived+from+Branchiostoma+lanceolatum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A bright monomeric green fluorescent protein derived from Branchiostoma lanceolatum.</a> Nature Methods. 10, 407-409 (2013).</li>
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<li>Godinho, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+amacrine+cell+neurites+to+appropriate+synaptic+laminae+in+the+developing+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina.</a> Development. 132, 5069-5079 (2005).</li>
<li>Jusuf, P. R., Harris, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ptf1a+is+expressed+transiently+in+all+types+of+amacrine+cells+in+the+embryonic+zebrafish+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Development%22%5BJournal%5D)">Ptf1a is expressed transiently in all types of amacrine cells in the embryonic zebrafish retina.</a> Neural Development. 4, 34(2009).</li>
<li>Kani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proneural+gene-linked+neurogenesis+in+zebrafish+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Proneural gene-linked neurogenesis in zebrafish cerebellum.</a> Developmental Biology. 343, 1-17 (2010).</li>
<li>Distel, M., Wullimann, M. F., Köster, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Gal4+genetics+for+permanent+gene+expression+mapping+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Procedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Optimized Gal4 genetics for permanent gene expression mapping in zebrafish.</a> Procedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 13365-13370 (2009).</li>
<li>Choorapoikayil, S., Overvoorde, J., den Hertog, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deriving+cell+lines+from+zebrafish+embryos+and+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Deriving cell lines from zebrafish embryos and tumors.</a> Zebrafish. 10, 316-332 (2013).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, apresentamos dois protocolos diferentes de cultura primária de células de 2 embriões de zebrafish dpf ou cérebro adulto zebrafish.
A preparação das culturas de célula primária de 2 dpf zebrafish é relativamente fácil de executar para qualquer pessoa com experiência em técnicas de cultura de célula básica. No entanto, para obter resultados reprodutíveis e boas, um número suficiente de embriões como material de partida é crucial (100 é o mínimo). Durante o levantamento dos embriões, todas ...

O peixe-zebra (Danio rerio, d. rerio) é um modelo popular vertebrado para inúmeros campos de pesquisa básica e biomédico1. Zebrafish embriões se desenvolvem rapidamente ex utero, são transparentes e ajuste sob um microscópio, proporcionando excelentes pré-requisitos para estudar o desenvolvimento de vertebrados em um organismo vivo. Devido a rastreabilidade genética de zebrafish2, foram criadas muitas linhas de repórter transgénicos estável com expressão de tipo específico de célula de vários marcadores fluorescentes permitindo a observação de populações de células específicas. A comunidade de zebrafish oferece uma ampla variedade de chamados linhas Gal4-motorista que carregam um transgene expressando o Kal4TA4 sintético (ou o equivalente de KalTA3-GalFF) gene com o domínio de Gal4-DNA-ligando de levedura fundido a ativação transcricional viral domínios sob o controle dos realçadores de tipo específico de célula. Estas linhas de motorista se cruzam linhas de efetor que carregam transgenes consistindo de uma definido upstream ativando sequência (UAS) fundida a um gene repórter. A proteína Kal4TA4 vincula-se ao elemento UAS, ativando assim a expressão seletiva-tipo de célula do gene repórter3,4. Esta abordagem permite estudos combinatórios altamente diversificados de quase todos os elementos disponíveis enhancer e repórter em animais transgénicos-duplo.
No entanto, imagens ao vivo em profundidade com foco em células individuais ou seus conteúdos subcellular é limitada em um embrião inteiro e constante mudança. Para abordar questões biológicas de célula específica com maior resolução, o uso de culturas de células, muitas vezes é preferível. Existem algumas linhas de célula de zebrafish, mas eles são considerados como altamente selecionado5,6,7 e sua propagação geralmente é demorada. Além disso, todas as linhas de celular disponíveis são fibroblastos derivados, limitando os experimentos utilizando cultura de células de um tipo de células. Portanto, estabelecemos um protocolo eficiente e fácil de usar para preparar as células primárias diretamente do zebrafish embriões e cérebro adulto zebrafish, juntamente com abordagens para aumentar a longevidade da cultura e ampliar a diversidade de cultivo tipos de células. Além disso, apresentamos um procedimento para transfect embrionário as células primárias com construções de expressão para marcadores fluorescentes organela. Assim, estruturas subcelulares e morfologias celulares podem ser analisadas com alta resolução espacial e temporal em tipos de células distintas que retêm suas principais características.

<table><tbody><tr><td>Linhas de peixe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AB (tipo selvagem)</td><td></td><td></td><td>estabelecido por Streisinger e colegas, disponível no Zebrafish International Resource Center (ZIRC)</td></tr><tr><td>Tg(ptf1a:eGFP)jh1</td><td></td><td></td><td>linha transgênica estável na qual o intensificador do gene ptf1a conduz a expressão da proteína fluorescente EGFP (Parsons et al., 2007)</td></tr><tr>Linha transgênica estável <td>Tg(XITubb:DsRed)zf148</td><td></td><td></td><td>na qual o promotor Xenopus neural-specific beta tubulina impulsiona a expressão da proteína fluorescente DsRed&nbsp; (Peri e N&uuml; sslein-Volhard, 2008)</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Equipamento</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>modelo 5804 R</td></tr><tr><td>Sistema de imagem ChemiDoc MP</td><td>BioRad</td><td></td><td>modelo XRS+, usado para adquirir imagens em preto e branco de placas de Petri contendo 1 embriões microscópio</td></tr><tr><td>confocal de varredura a laser</td><td>Leica microsystems</td><td></td><td>modelo SP8, equipado com 28 &deg; C e um microscópio epifluorescente objetivo de 63X</td></tr><tr><td></td><td>Leica microsystems</td><td></td><td>modelo DM5500B, equipado com 28 &deg; Caixa de temperatura C e um pulsador de gene 40X</td></tr><tr><td>Xcell com extensor de capacitância Dispositivo</td> de <td>eletroporação</td><td>BioRad</td><td>1652661</td></tr><tr><td>agitador horizontal</td><td>Incubadora GFL</td><td></td><td>modelo 3011</td></tr><tr><td>para cultura de células (28 &deg; C)</td><td>Incubadora modelo</td> <td>Memmert</td><td></td> I</tr><tr><td>incubadora para embriões (28 &deg; C)</td> <td>Microscópio óptico Heraeus</td><td></td><td>tipo B6120</td></tr> Modelo <tr><td></td><td>Zeiss</td><td></td><td>TELAVAL 31</td></tr><tr><td>micro pipetas</td><td></td> Bancada de trabalho estéril Gilson <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Bio Base</td><td></td><td>com fluxo laminar e pinças de luz UV</td></tr><tr><td></td><td>Dumont</td><td></td><td>Style 5,</td></tr><tr><td>rotador de tubo vertical</td> Inox <td>Labinco B.V.</td><td></td><td>modelo LD-79</td></tr><tr><td>Nome<</td><td>strong>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Software de laboratório</td><td>BioRad</td><td></td><td>para o sistema de imagem ChemiDoc MP da BioRad</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Saúde</td><td></td><td>usada para contagem de embriões de 1 dpf aplicando a ferramenta Contagem de partículas às respectivas imagens em preto e branco; Rasband, W.S., ImageJ, Institutos Nacionais de Saúde dos EUA, Bethesda, Maryland, EUA, https://imagej.nih.gov/ij/. (1997-2016).</td></tr><tr><td>LAS X</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>para microscópios confocais e epifluorescentes da Leica Microsystems</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pCS-DCX-tdTomato</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 1599</td><td>baseado no backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-eGFP</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 7</td><td>baseado no backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-H2B-mseCFP</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 2379</td><td>baseado no backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-mClover</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 3865</td><td>baseado no backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-MitoTag-YFP</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 2199</td><td>baseado no backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-ss-RFP-KDEL</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 4330</td><td>baseado no backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pCS-VAMP1-mCitrine</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 2291</td><td>baseado no backbone pCS2+ (Rupp et al., 1994)</td></tr><tr><td>pSK-UAS:mCherry</td><td>K&ouml; ster Lab</td><td># 1062</td><td>com base no backbone pBluescript de Stratagene</td></tr><tr><td>Os números de plasmídeos referem-se às entradas do banco de dados do K&ouml; Laboratório Ster. Os plasmídeos estão disponíveis mediante solicitação.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Utensílios de plástico e vidro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Filtro de Célula Falcon (40 &micro; m)</td> <td>FALCON</td><td>REF 352340</td><td>distribuído pela BD Bioscience, usado como " rede de aterrissagem" para mergulhar embriões desgemados em etanol e transferi-los rapidamente para o meio de cultura de células frescas</td></tr><tr>Tubos <td>de reação de</td><td>1,5 mL</td><td>Sarstedt</td> 72690550 <td></td></tr><tr><td>placa de 24 poços</td><td>Sarstedt</td><td>83.3922</td><td></td></tr><tr><td>tubo falcônico de 50 mL</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.004</td><td></td></tr><tr><td>placa de 96 poços</td><td>Sarstedt</td><td>83.3924.005</td><td></td></tr><tr><td>EasyStrainer (40 &micro; m)</td> <td>Greiner Bio-One</td><td>542 040</td><td>com ranhuras de ventilação; usado para filtrar células após a cubeta de eletroporação de dissociação mediada por colagenase</td></tr><tr><td>(0,4 cm)</td><td>Kisker</td><td>4905022</td><td></td></tr><tr><td>lamínulas de vidro</td><td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td><td>1051201</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio</td><td>Thermo Fisher Scientific (Menzel Gl&auml; ser)</td><td>631-0845</td><td></td></tr><tr><td>Câmara Neubauer</td><td>Henneberg-Sander GmbH</td><td>9020-01</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas Pasteur (plástico; 3 mL)</td><td>A. Hartenstein</td><td>PP05</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri (plástico; diâmetro 10 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>821473</td><td>para embriões de peixe-zebra ponteiras</td></tr><tr>de<td>pipeta</td><td>Sarstedt</td><td>Blue (1000 &micro; l): 70762; Amarelo (200 &micro; l): 70760002; Branco (10 &micro; L): 701116</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultura de células estéreis (plástico; diâmetro 3 cm)</td><td>TPP Techno Plastic Products AG</td><td>93040</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultura de células estéreis (plástico; diâmetro 6 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>72690550</td><td></td></tr><tr><td>placas de Petri estéreis (plástico; diâmetro 10 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>83.3902</td><td>para dissecção cerebral</td></tr><tr><td><forte>Nome</forte></td><td><forte>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Chemicals and Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr>sodium <tr><td>chloride</td><td>Roth</td><td>0601.1</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldeído em 1x PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>16005</td><td></td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindol (DAPI)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>nitrato de cálcio tetrahidratado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1396</td><td></td></tr><tr><td>etanol p.a. 100%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>46139</td><td></td></tr><tr><td>cabra &alpha;-mouse IgG (específico para Fc) FITC conjugado</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31547</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Roth</td><td>9105.4</td><td></td></tr><tr><td>graxa de alto vácuo</td><td>DOW CORNING</td><td>3826-50</td><td>graxa de silicone usada para pratos de fundo de vidro self-made</td></tr><tr><td>sulfato de magnésio heptahidratado</td><td>Merck</td><td>105886</td><td></td></tr><tr><td>azul de metileno</td><td>Serva</td><td>29198.01</td><td></td></tr><tr><td>Anti-tubulina monoclonal, anticorpo acetilado</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td></td></tr><tr><td>Aqua-Poly/Mount (meio de montagem)</td><td>Polyscience</td><td>18606</td><td></td></tr><tr><td>poli-L-lisina</td><td>Biochrom</td><td>L 7240</td><td></td></tr><tr><td>cloreto de potássio</td><td>Merck</td><td>104938</td><td></td></tr><tr><td>leite desnatado</td><td>Roth</td><td>68514-61-4</td><td></td></tr><tr><td>Texas Red-X Faloidina</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T7471</td><td></td></tr><tr><td>Tricaína</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td>Sinônimo: Etil 3-aminobenzoato metanossulfonato</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>BioRad</td><td>1610407</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Gibco da Life Technologies</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Nome<</td><td>strong>Empresa</td><td>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>collagenase (Tipo 2)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17101015</td><td>dissolver o pó em meio de cultura celular (8 mg/ml) e filtrar a solução estéril, armazenar alíquotas a -20 & C</td></tr><tr><td>pronase (de Streptomyces griseus)</td> <td>Roche</td><td>11459643001</td><td>distribuído pela Sigma-Aldrich, dissolver em 30% de Danieau (10 mg / mL) e armazenar alíquotas a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Meio e soluções para cultura de células</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1x PBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline)</td><td>Gibco da Life Technologies</td><td>14190-169</td><td>distribuído pela Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Meio independente de CO2</td><td>Gibco da Life Technologies</td><td>18045054</td><td>distribuído pela Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Soro bovino filtrado (FBS)</td><td>PAN-Biotech</td><td></td><td>glutamina individual em lote</td></tr><tr><td>100x</td><td>Gibco da Life Technologies</td><td>25030081</td><td>distribuído pela Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Meio L-15 Gibco da Leibovitz</td><td>da Life Tecnologias</td><td>11415049</td><td>distribuídas pela Thermo Fisher Scientific</td></tr><tr><td>PenStrep (10.000 U/mL)</td><td>Gibco pela Life Technologies</td><td>15140148</td><td>distribuídas pela Thermo Fisher Scientific</td></tr></tbody></table>

cultura e transfecção de células primárias de zebrafish

Culture and Transfection of Zebrafish Primary Cells

Zebrafish embriões são transparentes e desenvolvem rapidamente fora da mãe, permitindo assim excelente na vivo por imagens do processos biológicos dinâmicos em um vertebrado intacto e em desenvolvimento. No entanto, a imagem detalhada das morfologias de tipos distintos de células e estruturas subcelulares é limitada em montagens de toda. Portanto, nós estabelecemos um protocolo eficiente e fácil de usar para as células primárias ao vivo de cultura de embriões de peixe-zebra e tecido adulto.
Em breve, 2 dpf zebrafish embriões são dechorionated, deyolked, esterilizados e dissociado de células únicas com colagenase. Após uma etapa de filtração, as células primárias são banhadas em pratos de vidro inferior e cultivadas por vários dias. Culturas frescas, diferenciada de termo tanto quanto tempo os, podem ser usadas para estudos de imagiologia confocal de alta resolução. A cultura contém diferentes tipos de células, com miócitos estriados e neurônios sendo proeminente no revestimento de poli-L-lisina. Para especificamente rótulo subcellular estruturas por proteínas marcador fluorescente, também estabelecemos um protocolo de eletroporação que permite o transfeccao de Plasmideo DNA em diferentes tipos de células, incluindo neurônios. Assim, na presença do operador definido de estímulos, comportamento complexo celular e dinâmica intracelular de células primárias zebrafish pode ser avaliada com alta resolução espacial e temporal. Além disso, usando o cérebro adulto zebrafish, demonstramos que a técnica de dissociação descrita, bem como as condições básicas de cultivo, também trabalham para tecido adulto zebrafish.

A Figura 1 mostra uma imagem de luz transmitida de uma cultura típica derivada de embriões de tipo selvagem com miócitos estriados e aglomerados de células neurônio-como sendo o mais abundante. Para identificar determinados tipos de células mais facilmente, uma linha de transgênica com expressão de tipo específico de célula de uma proteína fluorescente pode ser usado (Figura 1 H).
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Apresentamos um protocolo eficiente e fácil de usar para a preparação de culturas de células primárias de zebrafish embriões para transfeccao e imagens de células vivas, bem como um protocolo para preparar as células primárias do cérebro adulto zebrafish.

Cultura e transfecção de células primárias de Zebrafish

Zebrafish embryos are transparent and develop rapidly outside the mother, thus allowing for excellent in vivo imaging of dynamic biological processes in ...

Este método fornece à comunidade de peixe-zebra uma ferramenta para a análise da dinâmica intercelular com uma resolução inatingível in vivo. E também permite compensar a falta de linhagens celulares de peixe-zebra. A principal vantagem dessa técnica é que você isola e transfecta essas células primárias diretamente do tecido original, para que não seja necessário manter linhagens celulares.Para iniciar o protocolo, prepare os embriões de peixe-zebra dois dias após a fertilização, ou dpf. No primeiro dia, montou vários cruzamentos da linhagem de peixe-zebra de escolha. No segundo dia, acasalar com o peixe e coletar os ovos diretamente após a desova em uma placa de Petri de plástico de 10 centímetros.Remova os ovos mortos e contaminados com uma pipeta Pasteur de plástico. Lave os ovos uma vez com Danieau 30% com 0,0001% de peso por volume de azul de metileno. Em seguida, substitua o meio por Danieau fresco 30% sem azul de metileno e incube os ovos durante a noite a 28 graus Celsius.No terceiro dia, remova os embriões mortos e contaminados e troque o meio por Danieau 30%Em seguida, incube os embriões durante a noite a 28 graus Celsius. No quarto dia, remova os córions removendo o meio

culture-and-transfection-of-zebrafish-primary-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

O vídeo demonstra um método para cultivar células ganglionares primárias da retina a partir de embriões de peixe-zebra. Os embriões em estágio inicial são submetidos à dissecção para isolar os olhos, que são posteriormente dissociados mecanicamente em uma suspensão de células ganglionares da retina. Esta suspensão celular é cultivada em lamínulas revestidas com proteínas adesivas para facilitar o desenvolvimento do axônio.

Geração de culturas primárias de células ganglionares da retina a partir de embriões de peixe-zebra

Aqui é proporcionado um método reprodutível para estudar a neurogénese adulto utilizando um ensaio neuroesfera derivado de todo o cérebro ou a partir de qualquer telencefálicos tectal ou regiões do cerebelo do cérebro adulto peixe-zebra. Além disso, descreve-se o procedimento para manipular a expressão de genes em neuroesferas de peixe-zebra.

Isolamento e Cultura de neuroesferas Zebrafish Adulto derivado do cérebro

Este protocolo descreve um método para isolar células únicas de embriões de peixe-zebra, enriquecendo para células de interesse, capturando células de peixe-zebra em sistemas multiplex de célula única baseados em microfluídica e avaliando a expressão gênica de células únicas.

Isolamento e caracterização de células individuais de embriões Zebrafish

regeneração de retina de peixe-zebra foi principalmente estudada usando retinas fixos. No entanto, os processos dinâmicos, como a migração nuclear interkinetic ocorrer durante a resposta regenerativa e exigem processamento de imagem de células vivas para investigar os mecanismos subjacentes. Aqui, descrevemos as condições de cultura e de imagem para monitorar Migração Nuclear Interkinetic (INM) em tempo real através de microscopia multiphoton.

Cultura do Adulto Transgênicos Zebrafish Retinal explantes for Imaging Em células vivas, por Multiphoton Microscopia

Aqui, descrevemos modelos peixe-zebra xenotransplante usando dois locais de injecção diferentes, ou seja, espaço perivitelínico e duto de Cuvier, para investigar o comportamento invasivo e avaliar a intravasation e extravasamento potencial das células de câncer de mama humanos, respectivamente.

Comportamento invasiva de células de cancro da mama humano em Embryonic Zebrafish

Aqui, mostramos o processo de criação de uma linha de zebrafish do repórter de tensão elétrica celular para visualizar o desenvolvimento embrionário, movimento, e células de tumor de peixe em vivo.

Visualização da atividade elétrica celular no Zebrafish embriões adiantados e tumores

Manipulações embriológicas como extirpação e transplante de células são ferramentas importantes para estudar o desenvolvimento precoce. Este protocolo descreve um dispositivo de transplante simples e eficaz para realizar essas manipulações em embriões de zebrafish.

Um dispositivo de transplante simples e eficaz para embriões de zebrafish

Este trabalho descreve um protocolo para o sistema modular de transgênese Tol2, um método de clonagem baseado em gateway para criar e injetar construções transgênicas em embriões de peixe-zebra.

O Sistema Zebrafish Tol2: Uma Abordagem de Transgênese Modular e Flexível Baseada em Gateway

Aqui, apresentamos um protocolo de cultura 3D eficaz, fácil e rápido para a formação de esferoides de duas linhagens celulares de zebrafish (Danio rerio): ZEM2S (embrião) e ZFL (hepatócito normal).

Método de Cultura 3D de Esferoides de Linhagens Celulares de Zebrafish Embrionárias e Hepáticas

Aqui apresentamos um protocolo para transplantar células com alta resolução espacial e temporal em embriões e larvas de peixe-zebra em qualquer estágio entre pelo menos 1 e 7 dias após a fertilização.

Transplante de células de alta resolução em peixe-zebra embrionário e larval

Aprenda a cultivar e transfectar células primárias de zebrafish para estudos de dinâmica intercelular em neurociência e biologia celular. Este método permite imagem celular em tempo real com alta resolução.

Cultura e transfecção de células primárias de Zebrafish

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