Name: In Vitro Criação de abelhas solitárias: uma ferramenta para avaliar os fatores de risco Larval (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
Description: Aprenda a criar larvas de abelhas solitárias in vitro para avaliar os efeitos de fungicidas e microrganismos simbiontes na saúde dos polinizadores. Este método auxilia pesquisadores em ecologia e entomologia.

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Os autores agradecer Kimball Clark e Tim Krogh para fornecer Osmia aninhamento juncos, Meredith Nesbitt e Molly Bidwell para assistência em laboratório, os Drs Cameron Currie, Christelle Guédot, Terry Griswold, Michael Branstetter e três revisores anônimos para seus comentários úteis que melhorou o manuscrito. Este trabalho foi financiado por fundos de USDA-Agricultural Research Service, que se apropriou (atual Research Information System #3655-21220-001), Wisconsin, Ministério da agricultura, do comércio e defesa do consumidor (#197199), National Science Foundation (sob N º de Grant Deb-1442148), o centro de pesquisa de bioenergia do DOE grandes lagos (DOE escritório de ciência BER DE-FC02-07ER64494).

1. prepare soluções propiconazol para experimentos de exposição de fungicida
<ol><li>Prepare 0,1 x solução fungicida dissolvendo volumes adequados de propiconazol adquiridos comercialmente 14,3% em água estéril no dia do experimento. Certifique-se de que a única solução recentemente preparada de fungicida é usada para todos os tratamentos.</li>
	<li>Adicione 23 µ l de 0,1 x solução fungicida por grama de provisão de pólen para obter a concentração máxima de propiconazol anteriormente relatado de pólen de abelha-coletados24 (0,361 PPM ou µ g de ingrediente ativo g-1 de pólen).</li>
</ol>2. colher ovos e disposições de pólen Host de Osmia juncos
<ol><li>Usando um bisturi esterilizado, disse recém ligado aninhando canas de Osmia, dividi-la em duas partes ao longo do comprimento da cana para expor as câmaras individuais. Nota: Cada ninho pode conter entre 8 a 14 câmaras e um ovo dentro de uma câmara.</li>
	<li>Inspecione os juncos visualmente para identificar as câmaras contendo ovos masculinos com base em diretrizes previamente publicados77. Uso uma agulha esterilizada dobrada para remover cada disposição de pólen juntamente com o ovo associado o nidificação reed e coloque em um ambiente limpo pesar o barco.</li>
	<li>Suavemente separa a prestação usando um pincel limpo bem o ovo e gravar o peso fresco de uma prestação pólen e utilizando uma balança de laboratório padrão do ovo. Calcule o peso médio das disposições pólen masculino.</li>
	<li>Execute as etapas subsequentes com prazo mínimo para reduzir as chances de danos para o ovo da exposição à temperatura excessiva e desidratação.</li>
</ol>3. prepare a disposições de pólen de plantas de Host
<ol><li>Inspecione visualmente o pólen planta hospedeira maternalmente coletados escavado das câmaras de nidificação para não garantir que nenhum parasitas presentes78. A fim de reduzir qualquer potencial viés materna, combinar as disposições de pólen em uma massa única em uma placa de Petri estéril e misture bem, usando uma agulha esterilizada.</li>
	<li>Divida a massa combinada em novas disposições de pólen, garantindo que o peso de cada prestação reconstituído é aproximadamente igual ao peso médio de uma disposição masculina naturalmente alocada (média ± SE, 0,35 ± 0,01 g, N = 42). Nota: Porque Osmia sp. aloca menores disposições de pólen para a prole masculina, isso resulta em menor peso corporal das larvas masculinas comparadas de fêmeas77. Para evitar qualquer tal preconceito resultantes de diferenças específicas do sexo, apenas use ovos masculinos nos experimentos.</li>
</ol>4. prepare a planta hospedeira não provisão de pólen
<ol><li>Pulverizamos adquiridos comercialmente mel abelha coleta pólen a um pó fino, usando um padrão de laboratório com moinho de esfera.</li>
	<li>Com base no teor de umidade disposições de pólen coletado maternalmente anfitrião (~ 20%), hidrate o pó de pólen usando volumes adequados de solução de açúcar de 40% esterilizado79 e misture cuidadosamente para formar uma consistência de massa.</li>
	<li>Divida em massas de pólen individuais, cada um pesando aproximadamente o mesmo que o peso médio de uma disposição masculino naturalmente alocado. Nota: De humidade do pólen de anfitrião maternalmente coletados disposições podem ser padronizadas em antes comparando o peso fresco e seco, de disposições de pólen de 30 câmaras masculino selecionado aleatoriamente80. Para obter o peso seco, disposições de pólen devem ser liofilizadas em um Liofilizador (1,5 Pa para 72 h).</li>
</ol>5. preparar placas de cultura de células do Multiwell
<ol><li>Poços individuais de linha da placa de cultura de 48-bem estéril com copos de estanho autoclavados (5 × 9 cm). Usando a pinça estéril, toque suavemente para fora da borda superior da cápsula para que ele pode acomodar a provisão de pólen.</li>
	<li>Coloque uma massa única de host ou o host não prestação de pólen dentro do copo lata usando ferramentas estéril com base no grupo de tratamento. Nota: Para evitar contaminação cruzada, use chapas separadas por grupos tratamento e controle.</li>
</ol>6. Adicione fungicidas
<ol><li>Faça uma depressão centralmente posicionada dentro da massa de pólen usando uma vara de madeira estéril. Use um stick para cada prestação de pólen.</li>
	<li>Adicione volumes adequados de solução fungicida (para tratamento), ou água esterilizada (para controles) para a depressão. Beliscar a abertura da depressão usando Pinças esterilizadas para minimizar o contato entre o fungicida de superfície / estéril água e o ovo.</li>
	<li>Certifique-se de que a afinação fatorial do design experimental alinha com isso retratado na representação esquemática (Figura 4).</li>
</ol><img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig4.jpg"> Figura 4. Representação esquemática da instalação experimental. O experimento representa um totalmente cruzada 2 × 2 fatorial configurações. Fator 1 representa a exposição do fungicida e consiste em 2 níveis: (i) nenhum fungicida (N = 10) e (ii) fungicida (N = 10). Fator 2 representa a fonte de pólen e consiste em 2 níveis: pólen (i) Host (N = 8) e (ii) não-acolhimento de pólen (N = 8). <a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
7. traseira e observar larvas
<ol><li>Coloque um ovo masculino selecionado aleatoriamente na superfície superior da prestação pólen utilizando um pincel limpo bem. Uma vez que os ovos foram colocados em todas as disposições, substitua a tampa da placa de cultura de célula, fixando-a com fita nas esquinas de rotulagem.</li>
	<li>Coloque as placas bem em uma bandeja limpa e cubra com um pano escuro para obstruir o contato com luz direta. Lugar um poço 6 placa contendo 30 mL de água estéril dentro da bandeja para evitar a dessecação. Bandejas de incubação deixe intacta dentro de uma incubadora à temperatura ambiente.</li>
	<li>Observe bem placas diariamente sob um microscópio dissecação sem retirar a tampa das placas bem. Certifique-se de que as larvas estão vivas, verificando para o movimento. Se nenhum movimento for detectado, descarte a caneca contendo as larvas mortas e a restante oferta de pólen. Permitir que todas as larvas sobreviventes desenvolver imperturbado dentro as placas bem até que eles atinjam o estágio de prepupal.</li>
	<li>Remova a larva do copo de estanho quando atinge o estágio prepupal41. Usar uma escova para limpar os defecar no casulo de seda. Cuidadosamente corte através do casulo de seda usando um microscópio de dissecação e extrair o prepupa com pinça de borracha.</li>
	<li>Manipule o prepupa suavemente para garantir que as ferramentas não perfurar o corpo mole. Registro do peso fresco do prepupa (prepupal biomassa) e o tempo do desenvolvimento do ovo à fase prepupal (tempo do desenvolvimento larval). Nota: Qualquer larva morta deve ser descartado imediatamente para evitar o crescimento microbiano indesejável sobre o cadáver e disposição de restos de pólen. Isso reduz o risco de infecção para as restantes larvas saudáveis.</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Criação de abelhas do lado de fora seus juncos de nidificação naturais, sob condições de laboratório, permite o teste de múltiplas hipóteses relativas à aptidão larval. Na medida em que fatores não identificados continuam a causar mortalidade das abelhas, os estudos de avaliação de risco usando em vitro experiências podem ajudar a identificar ameaças potenciais e informar as práticas de gestão para este grupo de ricos em espécies de polinizadores selvagens 12 ,<sup class="xref...

Dado o seu papel como o grupo dominante de insetos polinizadores1, a perda global em populações de abelhas é uma ameaça para a segurança alimentar e o ecossistema estabilidade2,3,4,5,6 ,7. As tendências em declínio em ambas as populações de abelhas gerenciado e selvagens têm sido atribuídas a vários factores de risco compartilhados, incluindo fragmentação de habitat, emergentes, parasitas e agentes patogénicos, perda de diversidade genética e a introdução de espécies invasoras3 ,,4,7,8,9,10,11,12. Em particular, o aumento dramático no uso de pesticidas, (por exemplo, neonicotinoides) tem sido diretamente associado a efeitos prejudiciais entre abelhas13,14,15. Vários estudos têm mostrado que o sinergismo entre neonicotinoides e fungicidas de (EBI) inibindo a biossíntese de ergosterol pode levar a alta mortalidade entre múltiplos abelha espécie16,17,18 , 19 , 20 , 21 , 22. não obstante, fungicidas, consideradas por muito tempo para ser 'abelha-safe', continuam a ser pulverizado nas culturas no-flor sem muito controlo23. As abelhas operárias foram documentadas para rotineiramente trazer cargas de pólen contaminadas com resíduos de fungicida24,25,26. O consumo de tal fungicida-ladenpollen pode causar alta mortalidade larval abelhas27,28,29,30e um conjunto de efeitos sub-letais entre abelhas adultas16 , 31 , 32 , 33 , 34. um estudo recente sugere que fungicidas podem causar perdas de abelha, alterando a comunidade microbiana na colmeia-armazenado o pólen, rompendo assim, a crítica simbiose entre abelhas e pólen transmitidas por micróbios35.
Embora as abelhas solitárias são vitais para a polinização de diversas plantas silvestres e agrícolas36,37,38, este grupo diverso de polinizadores tem recebido muito menos atenção em estudos de monitoramento de pesticidas. O ninho de uma fêmea solitária adulta contém câmaras ninhadas seladas de 5-10, cada abastecida com uma massa finita de maternalmente coleta de pólen e néctar e um único ovo39. Após a eclosão, as larvas dependem da prestação de pólen alocado e a microbiota associada transmitidas por pólen para obter uma nutrição adequada40,41. Porque eles não possuem os benefícios de um estilo de vida social, as abelhas solitárias podem ser mais vulneráveis à exposição de pesticidas42. Por exemplo, enquanto os défices em abelhas sociais seguindo um spray podem ser compensados para estendem a alguns trabalhadores e novos emergentes, ninhada, a morte de uma única fêmea solitária adulta termina todas as atividade reprodutiva43. Tais diferenças de susceptibilidade destacam a necessidade de incorporar táxons de abelha diversificada em estudos ecotoxicológicos para garantir proteção adequada para as abelhas selvagens e gerenciadas parecidas. No entanto, além de um punhado de estudos, investigações sobre os efeitos da exposição de fungicida tem focado principalmente nas abelhas sociais18,23,32,44,45 ,46,,47,,48,49.
Abelhas solitárias, pertencentes ao gênero Osmia (Figura 1) têm sido utilizadas no mundo inteiro como polinizadores eficientes de vários frutos importantes e porca culturas39,50,,51,53, 53. como com outros polinizadores gerenciado grupos24,54,55,56,57,58, abelhas adultas Osmia são rotineiramente expostos aos fungicidas pulverizadas sobre as culturas em-flor44. Fêmeas adultas forrageamento em culturas recentemente pulverizadas podem coletar e estocar seus aposentos ninhados com fungicida-carregado de pólen, que posteriormente forma a dieta exclusiva para as larvas em desenvolvimento. Consumir as disposições de pólen contaminados posteriormente pode expor as larvas de fungicida resíduos42. O risco de exposição pode ser maior entre espécies de oligolectic que forragem somente em alguns anfitrião estreitamente relacionadas plantas59,60,61. Certos megachilid de abelhas, por exemplo, parecem preferencialmente forragem para o pólen de Asteraceae de baixa qualidade, como um meio de reduzir o parasitismo62. No entanto, a extensão a que fungicidas impacto larval adequação entre abelhas solitárias oligolectic não foi empiricamente quantificada. O objetivo deste estudo é desenvolver um protocolo para testar as principais e efeitos interativos da fonte de exposição e pólen de fungicida na aptidão do in vitro criadas abelhas solitárias. Para investigar, ovos de ribifloris o. sensu lato (s.l.) podem ser obtidos comercialmente (tabela de materiais). Esta população é ideal por causa de sua importância como um polinizadores nativos e sua forte predileção para o néctar rico Mahonia aquifolium (uva de Oregon) encontrado dentro da região53,63,64 (Figura 2).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig1.jpg"> Figura 1. Uma foto de alta resolução de um adulto Osmia ribifloris. Foto de crédito Dr. Jim Cane, pesquisa entomologista, USDA-ARS <a href="/files/ftp_upload/57876/Figure_1.pdf" target="_blank">, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig2.jpg"> Figura 2. Aninhamento de palhetas de Osmia ribifloris (s.l.) com uma fêmea de nidificação em primeiro plano,. de Phragmite Partições de câmara e buchas terminais para as palhetas são construídas a partir de folhas mastigadas. Foto crédito Sr. Kimball Clark, NativeBees.com <a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig2large.jpg" target="_blank">, por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
O primeiro objectivo deste estudo é avaliar o efeito de consumir pólen tratada com fungicida na aptidão larval (medido em termos de tempo de desenvolvimento e biomassa de prepupal). Enquanto a exposição para o propiconazol fungicida comumente aplicada tem sido associada ao aumento da mortalidade entre abelhas adultas através de várias espécies de 23,24,32,44,45, 54,55,56,57,58,65,,66,67, seu impacto sobre as abelhas larvas é menor conhecido. O segundo objectivo deste estudo é avaliar os efeitos de consumir pólen não-host na aptidão larval. Estudos anteriores indicam que as larvas de abelhas oligolectic não conseguem desenvolver quando forçado a consumir pólen host não68. Tais resultados podem ser atribuídos às variações na fisiologia de abelha69, pólen bioquímica70e o benéfico microbiome associado com pólen natural disposições71. O terceiro objectivo deste estudo é avaliar os efeitos interativos de tratamento fungicida e pólen dietético na aptidão larval.
Numerosos traços biológicos, incluindo o tamanho do corpo materno, provisionamento de taxa, estratégia de forrageamento e pólen quantidade72,73,,74,75 são conhecidos por afetar a aptidão larval entre abelhas solitárias. Esses fatores podem introduzir variabilidade significativa entre juncos, que constitui um desafio no desenvolvimento de projetos experimentais defensáveis quando avaliação saúde larval. Além disso, dado que desenvolvimento larval ocorre dentro de juncos aninhamento selados, os efeitos de tal variabilidade na progenitura são difíceis de Visualizar e quantificados sem o uso de técnicas não-letais (Figura 3). Para superar este desafio, todas as hipóteses dentro deste estudo são testados usando larvas criadas fora suas linguetas de aninhamento. O delineamento experimental representa um totalmente cruzados 2 × 2 fatorial set-ups, com cada fator, consistindo em 2 níveis; Fator 1: Exposição fungicida (fungicida; Nenhum fungicida); Fator 2: Fonte de pólen (Host pólen, pólen de Non-host). As abelhas são disparadas do ovo à fase prepupal placas de cultura de célula do multiwell estéril sob condições controladas de laboratório. Cada um bem individualmente é abastecido com uma quantidade padronizada de um único ovo e disposições de pólen. Após a eclosão, a larva alimenta-se o pólen alocado dentro do poço, conclui desenvolvimento larval e inicia a pupa. Após estudos têm mostrado que inexplicáveis de mortalidade é menor entre abelhas levantadas dentro deste ambiente de criação artificial do que o encontrado no selvagem49,,76. O uso do in vitro-abelhas criadas tem diversas vantagens sobre os estudos de campo baseada: 1) minimiza os efeitos de confundimento de variabilidade natural e descontrolados fatores associados tipicamente com os estudos de campo baseada; 2) permite que vários níveis de manipulação para cada factor de interesse a serem testadas simultaneamente em grupos de tratamento; 3) o número de repetições pode ser predeterminado, e fatores experimentais para cada replicar podem ser manipulados individualmente; 4) variáveis resposta larval podem ser facilmente visualizadas e gravadas independentemente sem perturbadoras larvas adjacentes; 5) o protocolo pode ser modificado para acomodar mais complexos desenhos experimentais envolvendo múltiplos fatores e variáveis de resposta.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57876/57876fig3.jpg"> Figura 3. Conteúdo dentro de uma palheta de nidificação natural de Osmia ribifloris (s.l.). Perto da (A) um reed dissecado mostrando câmaras individuais, disposições de pólen e as partições e (B) recém colhidas disposições de pólen e os ovos associados (indicados com um círculo preto). <a href="/files/ftp_upload/57876/57876fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>ovos de O. ribifloris sensu lato (s.l.)</td><td></td><td></td><td>Kaysville, Condado de Davis, Utah, EUA</td></tr><tr><td>Palhetas Osmia</td><td>Nativebees.com</td><td>NA</td><td>Palhetas recém-tampadas</td></tr><tr><td>Conjunto de dissecação</td><td>VWR</td><td>89259-964</td><td>Esterilizar antes de usar</td></tr><tr><td>Alicate de ponta comprida</td><td>Husky</td><td>1006</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultura de 6 poços</td><td>VWR</td><td>10062-892</td><td>Estéril selado</td></tr><tr><td>Placas de cultura de 48 poços</td><td>VWR</td><td>10062-898</td><td>Placas de Petri seladas estéreis</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>25373100</td> Barcos de pesagem quadrados <td>selados estéreis</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>10770-448</td><td></td></tr><tr><td>Escova de pêlo de camelo</td><td>Bioquip</td><td>1153A</td><td></td></tr><tr><td>Cápsulas de estanho</td><td>EA Consumíveis</td><td>D1021</td><td>Esterilizar antes de usar</td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>VWR</td><td>470302-808</td><td></td></tr><tr><td>Propiconazol 14,3</td><td>Quali-Ppro</td><td>60207-90-1</td><td>Propiconazol 14,3%</td></tr><tr><td>Pólen de abelha</td><td>energizado</td><td>897098001244</td><td>Pólen cru natural não tratado</td></tr><tr><td>Microbalança</td><td>VWR</td><td>10204-990</td><td></td></tr><tr><td>Pulverisette</td><td>LAB SYNERGY INC.</td><td></td><td></td>30334913</tr><tr><td>Varetas de madeira</td><td>VWR</td><td>470146908</td><td>Esterilizar antes de usar</td></tr><tr><td>Fita de vedação</td><td>VWR</td><td>89097-912</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>VWR</td><td>89403-384</td><td></td></tr><tr><td>Tabuleiro de plantação</td><td>VWR</td><td>470150-632</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>BDH1158-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrifugação</td><td>VWR</td><td>21008936</td><td></td></tr><tr><td>Microsseringa</td><td>Cole-Palmer</td><td>UX-07940-07</td><td></td></tr><tr><td>Pinça de borracha</td><td>Amazon</td><td>B0135HWPN4</td><td></td></tr><tr><td>Agulhas de seringa</td><td>VWR</td><td>89219-334</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizador</td><td>Labcono</td><td>LFZ-1L</td><td></td></tr><tr><td>Software estatístico</td><td>SPSS</td><td>Versão 21.0</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro criação de abelhas solitárias: uma ferramenta para avaliar os fatores de risco larval

In Vitro Rearing of Solitary Bees: A Tool for Assessing Larval Risk Factors

Embora as abelhas solitárias fornecem serviços de polinização crucial para culturas selvagens e gerenciados, este grupo de ricos em espécies foi negligenciado em grande parte em estudos de regulamento de pesticidas. O risco de exposição a resíduos do fungicida é provável que seja especialmente elevado se o spray ocorre em ou perto de plantas hospedeiras, enquanto as abelhas estão coletando pólen para provisionar seus ninhos. Para espécies de Osmia que consomem pólen de um seleto grupo de plantas (oligolecty), a incapacidade de usar o pólen de plantas não-hospedeiras pode aumentar seu fator de risco para toxicidade relacionadas com fungicida. Este manuscrito descreve protocolos usados com sucesso criar abelhas oligolectic mason Osmia ribifloris sensu lato, do ovo à fase prepupal em placas de cultura de células em condições laboratoriais padronizados. O em vitro-abelhas criadas posteriormente são usadas para investigar os efeitos da fonte de exposição e pólen de fungicida na aptidão de abelha. Baseado em um experimento fatorial 2 x 2 totalmente atravessado, o experimento examina os efeitos principais e interativos da fonte de exposição e pólen de fungicida na aptidão larval, quantificada por biomassa prepupal, tempo de desenvolvimento larval e sobrevivência. Uma grande vantagem desta técnica é que usando em vitro-abelhas criadas reduz a variabilidade natural de fundo e permite a manipulação simultânea de vários parâmetros experimentais. O protocolo descrito apresenta uma ferramenta versátil para hipóteses testes envolvendo o conjunto de fatores que afetam a saúde das abelhas. Para os esforços de conservação a ser cumprido com sucesso significativo e duradouro, tais insights sobre a complexa interação de fatores fisiológicos e ambientais que levam a abelha declínios provarão para ser crítico.

Aptidão larval foi quantificada utilizando três métricas (i) larval tempo do desenvolvimento, (ii) prepupal biomassa e sobrevivência (iii) por cento. Uma ANOVA de duas vias foi realizada utilizando exposição fungicida (dois níveis: nenhum fungicida, fungicida) e fonte de pólen (dois níveis: Host pólen, pólen de Non-host) como variáveis independentes e tempo de desenvolvimento larval como variável dependente. O principal efeito para exposição de fungicida (F1,28 = 1,24,...

Sprays de fungicida em plantas de floração podem expor abelhas solitárias para altas concentrações de resíduos do fungicida transmitidas pelo pólen. Usando experimentos baseados em laboratório, envolvendo-se em vitro-larvas de abelha criados, este estudo investiga os efeitos interativos de consumir pólen tratada com fungicida derivado de host e host não plantas.

In Vitro Criação de abelhas solitárias: uma ferramenta para avaliar os fatores de risco Larval

Although solitary bees provide crucial pollination services for wild and managed crops, this species-rich group has been largely overlooked in pesticide ...

As espécies de abelhas solitárias representam o grupo mais diversificado de abelhas do planeta, mas pode ser muito difícil criar as larvas com sucesso em condições altamente controladas. Criamos um método para cultivo in vitro de espécies de abelhas solitárias, permitindo-nos isolar e medir os fatores de risco associados aos seus simbiontes microbianos. Entre certas espécies de abelhas solitárias que nidificam no caule, é fundamental que as técnicas de cultivo atendam às larvas jovens, bem como aos seus simbiontes microbianos nascidos no pólen.Aqui, iluminamos os efeitos principais e interativos de múltiplos estressores, permitindo-nos discernir se os estressores estão agindo em grande parte sozinhos ou em conjunto. Demonstrando o procedimento estarão Molly Bidwell e Prarthana Dharampal, ambos do meu laboratório. Usando um bisturi esterilizado, disseque juncos de nidificação Osmia recém-conectados.Divida as palhetas em duas partes no sentido do comprimento para expor as câmaras individuais. Os ninhos normalmente contêm de oito a 14 câmaras com um ovo por câmara. Identificar os ovos machos utilizando o método padrão.Apenas ovos machos são usados neste experimento devido ao viés sexual no tamanho da provisão de pólen. As provisões masculinas são tipicamente menores do que as provisões femininas. Em seguida, com um instrumento esterilizado, remova cada provisão de pólen junto com o ovo associado e coloque-os em um barco de pesagem limpo.No barco de pesagem, separe cuidadosamente o ovo da provisão. Em seguida, pese o pólen e o ovo separadamente. Trabalhe rapidamente com os ovos de Osmia para minimizar o tempo fora do pólen.Para preparações de fornecimento de pólen hospedeiro, primeiro inspecione visualmente o pólen da planta hospedeira coletado maternalmente escavado das câmaras de nidificação em busca de parasitas. Em seguida, para reduzir qualquer viés materno potencial, combine as provisões de pólen em uma única massa e misture-as usando uma agulha esterilizada. Em seguida, divida o pólen hospedeiro em novas provisões de massa padrão.Para preparar provisões de pólen de plantas não hospedeiras, pulverize o pólen coletado por abelhas compradas comercialmente em um pó fino usando um moinho de ossos de laboratório padrão. Em seguida, com base no teor de umidade das provisões de pólen do hospedeiro, hidrate o pólen em pó usando solução esterilizada de açúcar a 40%. Misture até obter uma consistência de massa.Em seguida, faça provisões de pólen não hospedeiro com o mesmo peso que as provisões coletadas maternalmente. Para a placa de tratamento, alinhe os poços individuais de uma placa de cultura de 48 poços com copos de estanho autoclavados. Prepare placas separadas para os grupos de tratamento e controle.Em seguida, usando uma pinça estéril, alargue suavemente a borda superior dos copos para que eles possam acomodar o suprimento de pólen. Em seguida, carregue provisões de pólen único nos copos de lata. Agora, dentro de cada massa de pólen, faça uma depressão colocada centralmente usando uma vara de madeira estéril.Use um novo bastão para cada suprimento de pólen. Na depressão, adicione os volumes apropriados de solução de tratamento, como fungicida e água estéril para controles. Após cada adição, feche a depressão com uma pinça estéril limpa.Para começar, carregue bem cada placa de tratamento com um ovo macho selecionado aleatoriamente. Coloque-o em cima da provisão de pólen usando um pincel fino e limpo. Depois de colocados os ovos, prenda a tampa no prato com fita adesiva nos cantos.Em seguida, coloque cada placa preparada em uma incubadora mantida em temperatura ambiente. Inclua uma placa de seis poços carregada com água estéril para evitar a dessecação. Deixe as placas intactas dentro da incubadora.Verifique a placa diariamente sob um microscópio de dissecação sem remover a tampa. Se as larvas estiverem vivas, elas estarão se movendo. Se nenhum movimento for detectado, descarte o copo de estanho contendo as larvas mortas e o restante suprimento de pólen.Quando uma larva atingir o estágio de pré-pupa, remova-a do copo de lata e use uma escova para limpar o excremento do casulo de seda. Em seguida, usando um microscópio de dissecação, corte cuidadosamente o casulo de seda e extraia a pré-pupa usando uma pinça leve. Manuseie a pré-pupa com cuidado para evitar qualquer dano ao seu corpo.Agora registre a massa da pré-pupa e o tempo de desenvolvimento do ovo até o estágio de pré-pupa. A aptidão larval foi quantificada usando o tempo de desenvolvimento larval e a biomassa pré-pupal. Houve uma correlação negativa significativa entre o tempo de desenvolvimento larval e a biomassa pré-pupal entre os grupos tratados e não tratados com fungicida.Embora tenha havido uma correlação negativa significativa para larvas criadas em pólen não hospedeiro, tal relação não foi observada para larvas criadas em pólen hospedeiro. A fonte de pólen teve um efeito principal significativo na aptidão das abelhas. Quando criadas em pólen não hospedeiro, o tempo de desenvolvimento das larvas aumentou significativamente, enquanto a biomassa pré-pupal diminuiu significativamente entre os grupos tratados com fungicidas e não tratados em comparação com as larvas criadas com pólen do hospedeiro.A exposição a fungicidas não teve efeito principal significativo na aptidão. Não houve diferença estatisticamente significativa no tempo de desenvolvimento e na biomassa pré-pupal para os tratamentos criados com pólen hospedeiro e não hospedeiro entre os grupos tratados e não tratados com fungicida. Não houve efeito interativo significativo da exposição a fungicidas e da fonte de pólen sobre o tempo de desenvolvimento larval e a biomassa pré-pupal.Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como criar larvas de abelhas solitárias com sucesso em condições in vitro. Uma vez dominada, essa técnica pode ser usada para criar abelhas em condições in vitro, desde o ovo até o estágio de pupa, causando mortalidade mínima por estresse no manuseio. Ao usar este procedimento, é importante lembrar de usar ovos ou larvas muito jovens.Isso garante que as larvas sejam criadas quase inteiramente na manipulação pretendida de tratamentos dietéticos. Este protocolo pode ser estendido a várias outras espécies de abelhas solitárias e vespas e pode ser facilmente modificado para testar os efeitos principais e interativos de múltiplos fatores de risco que afetam a saúde dos polinizadores. Ao fornecer um meio de cultivo in vitro para larvas de abelhas solitárias, essa técnica pode ajudar a identificar fatores de risco anteriormente desconhecidos entre populações de abelhas vulneráveis.Por exemplo, alguns de seus experimentos baseados neste protocolo podem ajudar a determinar o papel do microbioma polínico em conferir vários graus de resistência a estressores xenobióticos. Como uma técnica acessível e barata, este protocolo representa uma ferramenta versátil para teste de hipóteses que pode ser facilmente modificada pelos investigadores para atender aos seus próprios objetivos de pesquisa.

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JoVE Journal

Environment

Ambiente

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O objetivo desta apresentação é demonstrar in vivo e in vitro técnicas para a criação de nematóides entomopatogênicos. Métodos in vivo consideram a criação destes nematóides com um inseto hospedeiro, enquanto que os métodos in vitro utilizam rico ágar.

In vivo e in vitro criação de Nematóides entomopatogênicos (Steinernematidae e Heterorhabditidae)

Apresentamos aqui   um método para alimentar pesticida alimentos contaminados se tanto a um indivíduo abelha do mel e uma colónia colmeia. O procedimento avalia o efeito pesticida em abelhas de mel individuais por alimentação in vivo de dieta da larva de base e também na condição natural da colónia colmeia.

Avaliando o efeito de substâncias químicas ambientais em Honey Bee Desenvolvimento do indivíduo para Colony Nível

Neste protocolo, métodos para a realização de cruzamentos de consanguinidade e para avaliar o sucesso dessas cruzes, são descritos para a formiga Vollenhovia emeryi. Estes protocolos são importantes para as experiências que visa compreender a base genética dos sistemas de determinação do sexo em Hymenoptera.

Indução e avaliação de cruzes de endogamia utilizando o Ant, Vollenhovia Emeryi

Aqui, apresentamos protocolos para 1) a propagação em cativeiro laboratorial da borboleta azul miami ameaçada pelo governo federal(Cyclargus thomasi bethunebakeri) e 2) avaliando informações básicas da história da vida, como tempo de desenvolvimento imaturo e número de estádios larvais. Ambos os métodos podem ser adaptados para uso com outros programas de conservação ex situ.

Programas de propagação em cativeiro de borboletas em risco para melhorar o conhecimento da história da vida e técnicas eficazes de conservação ex situ

Aqui descrevemos dois protocolos: primeiro para propagar, extrair, purificar e quantificar grandes quantidades de partículas de vírus não envoltas em abelhas, incluindo um método para remover pupas de abelha mel e segundo para testar os efeitos da infecção viral usando um bioensaão de gaiola altamente repetigível e de alto rendimento.

Preparação do Inóculo Enriquecido por Vírus para Infecção Oral de Abelhas (Apis mellifera)

Este protocolo foi desenvolvido para aprimorar a compreensão de como os agrotóxicos afetam a reprodução das abelhas de mel (Apis mellifera),estabelecendo métodos para expor rainhas das abelhas e seus cuidadores de trabalhadores a agrotóxicos em um ambiente controlado e laboratorial e monitorando cuidadosamente suas respostas relevantes.

Avaliando o risco agroquímico para rainhas de abelhas de mel acasaladas

O presente protocolo explica um método para alimentar provisões contaminadas por pesticidas às larvas das abelhas solitárias, Osmia escavada. O procedimento examina a ecotoxicidade do pesticida para as larvas das abelhas solitárias.

Avaliando o efeito dos pesticidas nas larvas das abelhas solitárias

Neste trabalho, são detalhados dois protocolos para avaliação da fonte alimentar e preferências de oviposição em larvas e fêmeas de moscas-varejeiras. Estes compreendem quatro opções com dois fatores interagentes: tipo de substrato e temperatura. Os ensaios permitem determinar a preferência da fonte alimentar das larvas e a preferência do sítio de oviposição para as fêmeas.

Explorando escolhas de história de vida: usando a temperatura e o tipo de substrato como fatores de interação para as preferências de larvas e fêmeas de mosca-varejeira

Demonstramos um método testado para manusear com segurança abelhas coletadas em campo. Este método permite rápida manipulação, identificação, amostragem genética e confirmação das interações planta-inseto por meio do pólen coletado durante a amostragem. Facilmente adaptável, essa abordagem oferece um meio econômico e não letal para estudar grupos raros de insetos.

Um método rápido para confinar e manusear com segurança as abelhas no campo

Aprenda a criar larvas de abelhas solitárias in vitro para avaliar os efeitos de fungicidas e microrganismos simbiontes na saúde dos polinizadores. Este método auxilia pesquisadores em ecologia e entomologia.

In Vitro Criação de abelhas solitárias: uma ferramenta para avaliar os fatores de risco Larval

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