Modelo de Rato de Demyelinação Cortical Cerebral Generalizada Induzida por uma injeção intracerebral de citocinas pró-inflamatórias
21 de setembro de 2021
O protocolo aqui apresentado permite a reprodução de uma desmielinização de matéria cinzenta generalizada de ambos os hemisférios corticais em ratos agouti machos adultos. O método compreende a implantação intracerebral de um cateter, imunização subclínica contra glicoproteína de oligodendrocyte de mielina e injeção intracerebral de uma mistura de citocinas pró-inflamatórias através do cateter implantado.
O objetivo geral deste procedimento é gerar uma demyelinação generalizada do córtex de ambos os hemisférios cerebrais em um modelo de rato usando a imunização subclíquida contra a glicoproteína oligodendrocicta de mielina, seguida por injeção cerebral de citocinas por meio de um cateter implantado. Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave em doenças inflamatórias desmielinizantes do cérebro, como a esclerose múltipla. A principal vantagem desta técnica é que ela pode gerar inflamação induzida de desmielinação de matéria cinzenta no córtex de ambos os hemisférios cerebrais sem levar a plugues de matéria branca.
As implicações dessa técnica estendem-se para uma melhor compreensão dos mecanismos de desmielinização cortical que é observado principalmente em tipos progressivos de esclerose múltipla. Para iniciar este procedimento, monte o cateter e a tampa do cateter com a entrada. Em seguida, corte o cateter para um comprimento de dois milímetros com um bisturi.
Em seguida, raspe a cabeça de um rato anestesiado entre as orelhas usando a máquina de barbear elétrica. Coloque o rato na estrutura estereotática e fixe a cabeça usando as barras de ouvido e a placa de mordida. Certifique-se de que a cabeça está horizontal e verifique se há estabilidade aplicando pressão sobre ela com dedo ou fórceps.
Depois, aplique colírios lubrificantes para evitar o ressecamento da córnea durante a cirurgia, cubra os olhos com um material opaco para evitar qualquer exposição à luz cirúrgica. Em seguida, limpe a área raspada alternando a aplicação de 70% de etanol e complexo de iodo de 10% povidone. Para implantar o cateter, faça uma incisão longitudinal de cerca de dois centímetros de comprimento ao longo da linha média.
Em seguida, use grampos de buldogue para segurar a pele para os lados. Remova o sangue usando um aplicador de ponta de algodão. Depois, retire o periosteum, limpe o tecido com o aplicador da ponta de algodão, exponha o crânio e deixe-o secar por cerca de um minuto.
Em seguida, identifique os marcos anatômicos, lambda, bregma e sutura medial. Com a broca instalada no quadro estereotático, posicione a ponta da broca no bregma como ponto de partida. Mova dois milímetros posteriores do bregma, e 2,4 milímetros lateralmente para a sutura medial.
Em seguida, faça um orifício de 0,5 milímetros de diâmetro para o cateter nesta posição. Faça mais três furos de 1,3 milímetro de diâmetro para os parafusos da âncora a poucos milímetros do primeiro orifício. Remova o pó ósseo por irrigação com cerca de um a dois mililitros de PBS estéreis e limpe o crânio.
Posteriormente, aperte os parafusos de âncora por duas a três voltas completas. Insira um cateter de comprimento de dois milímetros através do primeiro orifício perpendicular à superfície do crânio. Enquanto ainda segura o cateter, aplique um pouco de cimento dental e deixe polimerizar com uma breve exposição à luz de cura dentária, a fim de estabilizar o cateter.
Em seguida, aplique mais cimento dentário ao redor do cateter, ancore os parafusos e solidifique o cimento dentário com a luz de cura dentária por cerca de 15 a 30 segundos, confirme que o cimento está endurecido. Após a implantação, feche a pele com suturas resorbáveis anteriores e posteriores ao cateter. Em seguida, injete a mistura de antídoto subcutânea.
Em seguida, administre 2,5% enrofloxacina por injeção subcutânea para tratamento de antibióticos profiláticos. Devolva o animal à gaiola modificada e mantenha-o sob observação por uma a três horas com uma aplicação de luz infravermelha para evitar hipotermia. Repita o tratamento enrofloxacina e administre o carprofeno a um miligrama por mililitro subcutâneamente para alívio da dor por injeção no dia seguinte à cirurgia.
Para preparar a mistura de imunização, conecte duas seringas de vidro de ponta de bloqueio inferior de 10 mililitros aos braços curtos de uma torneira de três vias e feche a terceira tomada com o braço longo. Em seguida, pipeta um mililitro de IFA e 50 microgramas de rMOG juntos. E ajuste a mistura a um volume final de dois mililitros com PBS estéril.
Coloque a mistura IFA e rMOG diluídas na seringa aberta e, em seguida, insira o pistão suavemente enquanto mantém uma pressão solta sobre o pistão oposto. Emulsione o inóculo dirigindo-o de uma seringa para outra, empurrando os pistões para frente e para trás até que seja branco e viscoso. Em seguida, fixe uma seringa de bloqueio inferior de um mililitro no braço curto aberto da torneira de três vias e preencha-a com inóculo.
Distribua todo o inóculo em uma seringa mililitro e mantenha-as no gelo até a injeção. Posteriormente, injete 200 microliters da mistura IFA e rMOG subcutânea na base traseira sob uma anestesia isoflurane temporária usando uma agulha de calibre 21. Para injeção de citocina intracerebral, ajuste o comprimento da cânula do conector para dois milímetros.
Encha uma seringa de um mililitro com a mistura de citocinas. Em seguida, conecte a seringa à cânula do conector. Em seguida, encha a cânula com a mistura de citocinas, evite criar bolhas.
Em seguida, monte a seringa na bomba de seringa programável e programe-a para injetar a uma taxa de 0,2 microliters por minuto. Inicie a bomba e mantenha-a funcionando para evitar uma formação de bolha de ar na ponta da cânula. Depois, remova a tampa do cateter com a entrada.
Insira a cânula do conector no cateter, coça e aperte-a. Em seguida, deixe a injeção prosseguir por 10 minutos antes de parar a bomba. Deixe a cânula dentro do cateter por 20 minutos para permitir que o volume injetado seja totalmente difuso.
Posteriormente, desaparafusar a cânula do conector e removê-la lentamente para evitar um efeito de vácuo. Recoloque a tampa do cateter com a entrada e enrosque-a. Permita que o animal se recupere da anestesia em uma gaiola.
A demyelinação cortical poderia ser avaliada em diferentes momentos após uma injeção de citocina por imuno histoquímica para PLP. A Figura 6A mostra imunoreatividade PLP intacta no dia 15 em um animal de controle imunizado moggy que recebeu apenas PBS estéril através do cateter implantado. No primeiro dia após a injeção de citocina, a desmielinização já poderia ser detectada em animais primos mog.
Embora, apenas nas proximidades da área cateterizada. A imunoreatividade PLP permanece intacta no córtex contralateral um dia após a injeção de citocina. No terceiro dia, foi observado um aumento gradual da perda da reatividade imunológica PLP, que se espalha no córtex ipsilateral.
A demyelinação cortical contralateral também pode ser detectada no terceiro dia, mas é bastante restrita à área abaixo dos parafusos de âncora. Entre os dias nove e 15, a dessalinização afeta grande parte do córtex de ambos os hemisférios. A demyelinação cortical é sustentada por até 30 dias após a injeção de citocina em ambos os hemisférios com apenas uma remielinação parcial.
A Figura 6J mostra uma quantificação da perda de PLP na matéria cinzenta cortical após a injeção de citocina intracerebral. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar desmielinização da matéria cinzenta usando a imunização subclínica contra proteínas de mielina, seguida de injeção intracerebral de citocinas através do cateter implantado. Este modelo animal poderia ajudar os pesquisadores no estudo de tipos progressivos de esclerose múltipla, a dessalinização da matéria cinzenta em camadas é uma marca completa.
O cateter implantado permite múltiplas rodadas de desmielinização ou entrega intercerebral de potenciais drogas terapêuticas submetidas a investigação pré-clínico sem causar trauma induzido por injeção.
Visão Geral
Este estudo apresenta um protocolo para induzir desmielinização difusa da substância cinzenta na córtex de ambos os hemisférios cerebrais em ratos adultos machos da linhagem Dark Agouti. O método inclui imunização subclínica contra a glicoproteína oligodendrocítica da mielina e injeção intracerebral de citocinas, com o objetivo de aprofundar o entendimento das doenças inflamatórias desmielinizantes, como a esclerose múltipla.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Demielinização
- Doenças inflamatórias
Contexto
- As metodologias atuais não dispõem de um meio para induzir desmielinização cortical sem causar lesões na substância branca.
- Este protocolo fornece informações sobre os mecanismos de desmielinização cortical relevantes para doenças como a esclerose múltipla.
- Tem como objetivo aprimorar a compreensão da progressão da doença em distúrbios inflamatórios desmielinizantes.
Objetivo do Estudo
- Gerar desmielinização induzida por inflamação na substância cinzenta em um modelo controlado de rato.
- Investigar os mecanismos envolvidos na desmielinização cortical, particularmente na esclerose múltipla progressiva.
- Desenvolver um método experimental confiável que evite complicações relacionadas a lesões da substância branca.
Métodos Utilizados
- Implante intracerebral de um cateter para injeções direcionadas.
- Ratos machos adultos da linhagem Dark Agouti foram utilizados como modelo biológico, com foco em lesões relacionadas à desmielinização.
- Imunização subclínica contra a glicoproteína oligodendrocítica da mielina seguida por injeção intracerebral de citocinas.
- O método inclui etapas cirúrgicas e cronogramas específicos para garantir o implante e tratamento bem-sucedidos.
Resultados Principais
- A indução da desmielinização foi confirmada por imunohistoquímica para PLP, demonstrando alterações corticais precoces.
- Os efeitos imediatos da injeção de citocinas levaram a uma desmielinização detectável logo após o procedimento.
- O método destacou o potencial para estudar os mecanismos de desmielinização cortical sem interferência de alterações na substância branca.
Conclusões
- Este protocolo permite o estudo dos processos de desmielinização cortical in vivo.
- Ele auxilia na exploração de abordagens terapêuticas para doenças como a esclerose múltipla.
- As implicações facilitam uma melhor compreensão das respostas inflamatórias e da progressão de condições neurodegenerativas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Este protocolo permite o estudo da desmielinização induzida por inflamação na substância cinzenta em um modelo de rato, abordando uma lacuna importante na pesquisa da esclerose múltipla, onde a patologia da substância cinzenta é sub-representada. Ao evitar lesões na substância branca, o modelo fornece uma plataforma mais específica para avaliar os mecanismos de desmielinização cortical relevantes para a esclerose múltipla progressiva. A abordagem permite a avaliação pré-clínica de candidatos terapêuticos direcionados a vias neuroinflamatórias, com menor interferência decorrente de lesões na substância branca.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Permite investigar os mecanismos inflamatórios responsáveis pela desmielinização cortical na substância cinzenta.
- Valor Operacional: Fornece um modelo reprodutível para validar alvos envolvidos em vias de desmielinização mediadas por citocinas.
Desenvolvimento de Triagem e Ensaios
- Valor Científico: Gera resultados quantificáveis de desmielinização por meio de imunohistoquímica para PLP, destinados à triagem de compostos.
- Valor Operacional: O cateter implantado permite administrações repetidas e avaliação longitudinal sem retraumatização cirúrgica.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Modela a desmielinização cortical observada na EM progressiva, apoiando a validação de alvos relevantes para a doença.
- Valor Operacional: Permite a administração intracerebral de agentes terapêuticos para avaliar o engajamento do alvo e a eficácia na substância cinzenta.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método se insere no continuum de descoberta, desde a validação do alvo até os testes de eficácia pré-clínica, especialmente para programas voltados à neuroinflamação e à desmielinização.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses sobre mecanismos de desmielinização induzidos por citocinas em matéria cinzenta cortical.
- Triagem: Permite a administração padronizada e repetível de compostos por meio de cateter para avaliação de resposta à dose.
- Análises: Fornece medições quantitativas da perda de PLP para comparar condições e acompanhar a progressão da desmielinização.
- Pesquisa Translacional: Modela a patologia da matéria cinzenta relevante para a esclerose múltipla progressiva, apoiando a validação de alvos alinhados a biomarcadores.
- Reutilização Empresarial: A plataforma de cateter permite múltiplas rodadas de intervenção, aumentando a utilidade em campanhas de triagem.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Reduz a ambiguidade mecanicista ao isolar a desmielinização cortical da patologia da substância branca.
- Valor Operacional: Procedimentos cirúrgicos e de injeção padronizados melhoram a reprodutibilidade entre laboratórios.
- Valor Estratégico: Orienta decisões de avançar/não avançar ao fornecer confiança preditiva na modulação do alvo dentro da substância cinzenta.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização ajustada ao risco de terapêuticos para o sistema nervoso central com base na modulação da desmielinização cortical.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em cirurgia estereotáxica e implante de cateter em modelos de roedores.
- Depende de infraestrutura cirúrgica estéril, cimento dental e bombas de seringa programáveis para a administração de citocinas.
- Necessita padronização entre equipes para garantir colocação consistente do cateter e dosagem de citocinas.
- Deve levar em conta a variabilidade na resposta imune entre linhagens de ratos e lotes de citocinas.
- Limitado ao entendimento mecanicista pré-clínico; não modela a fisiopatologia completa da esclerose múltipla, incluindo infiltração de células imunes ou ciclos de recaída-remissão.
