Administração exógena de agregados de microssomas associados alfa-synuclein para os neurônios primários como um modelo de célula poderosos de formação de fibrilas

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da alfa-sinucleína, como elucidar o mecanismo de agregação, espalhamento e toxicidade da alfa-sinucleína in vivo. A principal vantagem dessa técnica é que ela não requer a purificação demorada de fibrilas pré-formadas por alfa-sinucleína. Demonstrando o procedimento estará Lucia Rota, uma estudante de pós-graduação do COLA Lab.

Para iniciar o procedimento, prepare o tampão de homogeneização e mantenha-o no gelo. Em seguida, homogeneizar o tecido fresco ou congelado em um volume de um a 10 de tampão de homogeneização gelada usando um homogeneizador de pilão de Teflon com 10 a 15 pinceladas. Em seguida, transfira todo o homogeneizado inicial para um tubo de microcentrífuga e centrifugue a 1.000 vezes G por 10 minutos a quatro graus Celsius para remover núcleos e células intactas do pellet resultante.

Em seguida, descarte o pellet resultante. Em seguida, transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga limpo e centrifugá-lo a 10 000 vezes G durante 20 minutos a quatro graus Celsius, utilizando uma centrifugadora refrigerada, a fim de obter o segundo sobrenadante e o sedimento. Em seguida, transferir este sobrenadante para um frasco de policarbonato e centrifugá-lo a 100 000 vezes G durante uma hora a quatro graus Celsius, utilizando uma ultracentrífuga e um rotor de ângulo fixo.

Ressuspenda o pellet bruto P100 com 500 microlitros do tampão de homogeneização. Transfira o pellet de petróleo bruto P100 para um tubo de microcentrífuga limpo e centrifugue a 10.000 vezes G por 20 minutos a quatro graus Celsius em uma centrífuga refrigerada. Após 20 minutos, descarte o sobrenadante e ressuspenda o P100 com 100 microlitros de tampão de homogeneização.

Em seguida, sonice a amostra por dois segundos no gelo e armazene-a a 80 graus Celsius negativos. Para realizar o Western Blot, lançar um gel de poliacrilamida de tris-glicina gradiente de quatro a 20% em um aparelho de eletroforese vertical. Dissolver um micrograma de fracções de alfa-sinucleína associadas aos microssomas no tampão da amostra de desnaturação e colocá-lo no gel.

Em um poço diferente, carregue cinco microlitros de marcador padrão de proteína. Execute o gel a 100 volts em um tampão de corrida SDS de tris-glicina até que o marcador de proteína atinja o final do gel. Em seguida, transfira as proteínas para uma membrana de nitrocelulose usando um tampão básico de carbonato.

Mantenha a amostra durante a noite na câmara fria com uma potência constante ajustada em 200 miliamperes. No dia seguinte, bloqueie a membrana com PBS-T com 5% de leite em pó desnatado em um agitador orbital por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, enxágue brevemente a membrana com PBS-T.

Incube a membrana com SIN-1 a um a 5.000 ou anticorpo P-Ser129 alfa-sinucleína a um a 5.000 em leite em pó desnatado a 2,5% em PBS-T durante a noite na câmara fria ou geladeira a quatro graus Celsius em um agitador orbital. No dia seguinte, lave a membrana por 10 minutos em temperatura ambiente com PBS-T em um agitador orbital. Incube a membrana com anticorpo secundário conjugado com HRP anti-camundongo ou anti-coelho a um a 3.000 em leite em pó desnatado a 2,5% em PBS-T por uma hora em temperatura ambiente em um agitador orbital.

Em seguida, lave a membrana por 10 minutos em temperatura ambiente com PBS-T em um agitador orbital por três vezes. Obtenha o sinal através do kit de quimioluminescência regular. Para tratar os neurônios, puxe os agregados de alfa-sinucleína associados a microssomas obtidos da medula espinhal de três camundongos transgênicos doentes diferentes para obter uma solução de um micrograma por microlitro diluída com o tampão de homogeneização original.

Em seguida, remova um terço do meio e substitua-o suavemente por um meio de neurônios fresco. Adicionar um micrograma de agregados alfa-s associados a microssomas agrupados ao meio celular. Retorne os neurônios na incubadora a 37 graus Celsius.

Adicionar um terço do meio fresco à amostra, sem substituir o meio, uma vez de três em três dias durante uma semana. Após uma semana de tratamento, remova um terço do meio e substitua-o suavemente por meio fresco contendo 2% de B27, 10 microgramas por mililitro de gentamicina e dois milimolares de glutamina. Repita a cada três dias por uma semana antes de fixar as células.

Para realizar a imunofluorescência, em uma capela de exaustão química, fixar os neurônios com 2% de paraformaldeído e PBS em solução de sacarose a 5% por 15 minutos em temperatura ambiente sem agitação. Após 15 minutos, remova a solução de fixação e lave brevemente os neurônios com PBS três vezes. Em seguida, permeabilize os neurônios com 0,3% de surfactina não iônica em PBS por cinco minutos à temperatura ambiente.

Em seguida, lave brevemente os neurônios com PBS três vezes. Incube os neurônios com 3% de FBS e PBS por 30 minutos em temperatura ambiente em um agitador orbital para bloquear locais de ligação inespecíficos. Depois, incube os neurônios com anticorpo primário apropriado dissolvido em 3% FBS e PBS durante a noite na câmara fria ou geladeira durante a noite a quatro graus Celsius em um agitador orbital.

No dia seguinte, remova a solução de anticorpos e lave as células brevemente com PBS por três vezes. Em seguida, incube os neurônios com o anticorpo secundário fluorescente apropriado dissolvido em 3% FBS e PBS por uma hora em temperatura ambiente no escuro em um agitador orbital. Remova a solução de anticorpos e lave brevemente com PBS por três vezes.

Em seguida, core os neurônios com solução de DAPI por 15 minutos em temperatura ambiente no escuro em um agitador orbital. Após 15 minutos, remova a solução de anticorpos e lave brevemente com PBS por três vezes. Monte as lamínulas no slide usando um meio de montagem anti-desbotamento.

Neste estudo, a administração de um micrograma de agregados de alfa-sinucleína associados a microssomas agrupados de camundongos transgênicos A53T doentes ao meio de cultura de neurônios corticais ou hipocampais induz uma formação dependente do tempo de inclusões de alfa-sinucleína, positivas para anticorpos de alfa-sinucleína específicos de agregados. Após dois dias de tratamento, esses agregados aparecem como pequenos pontos dispersos que se tornarão mais abundantes em momentos posteriores. Após duas semanas, as inclusões de alfa-sinucleína se assemelham a estruturas longas e maduras semelhantes a contas, fortemente espalhadas pelas culturas neuronais seguindo um padrão de neurite e colocalizando parcialmente com marcadores pré-sinápticos e neuritos.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de ajustar a proporção de microgramas de agregados de alfa-sinucleína associados a microssomas para a densidade de neurônios plaqueados e isolar agregados de alfa-sinucleína associados a microssomas de tecidos ricos em inclusões de alfa-sinucleína. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como purificar agregados de alfa-sinucleína associados a microssomas de camundongos transgênicos doentes, para serem usados como tratamento para neurônios primários para induzir a formação de inclusões de alfa-sinucleína.