Name: Uma medida quantitativa de espécies reativas de oxigênio e senescência-associado fenótipo secretor em fibroblastos humanos normais durante a senescência induzida pelo Oncogene (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-12T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 59 s
Description: Aprenda a medir espécies reativas de oxigênio e fenótipo secretor associado à senescência em fibroblastos humanos WI-38 durante senescência induzida por H-Ras. Este método utiliza citometria de fluxo, PCR em tempo real e ELISA para análise quantitativa.

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Este trabalho foi apoiado por uma concessão da Fundação de pesquisa nacional da Coreia (2015R1D1A1A01060839) (para Young Yeon Kim) e por uma bolsa de pesquisa nacional Fundação da Coreia (NRF), financiado pelo governo da Coreia (MSIT) (no. 2016R1A2B2008887, n. º 2016R1A5A2007009) (para Jeanho Yun).

<ol><li>Hayflick, L., Moorhead, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+serial+cultivation+of+human+diploid+cell+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">The serial cultivation of human diploid cell strains.</a> Experimental Cell Research. 25, 585-621 (1961).</li>
<li>Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging%2C+cellular+senescence%2C+and+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Aging, cellular senescence, and cancer.</a> Annual Review of Physiology. 75, 685-705 (2013).</li>
<li>Braig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogene-induced+senescence+as+an+initial+barrier+in+lymphoma+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oncogene-induced senescence as an initial barrier in lymphoma development.</a> Nature. 436 (7051), 660-665 (2005).</li>
<li>Michaloglou, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BRAFE600-associated+senescence-like+cell+cycle+arrest+of+human+naevi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">BRAFE600-associated senescence-like cell cycle arrest of human naevi.</a> Nature. 436 (7051), 720-724 (2005).</li>
<li>Collado, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+biology%3A+senescence+in+premalignant+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour biology: senescence in premalignant tumours.</a> Nature. 436 (7051), 642(2005).</li>
<li>Malaquin, N., Martinez, A., Rodier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+the+senescence+secretome+under+control%3A+Molecular+reins+on+the+senescence-associated+secretory+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Keeping the senescence secretome under control: Molecular reins on the senescence-associated secretory phenotype.</a> Experimental Gerontology. 82, 39-49 (2016).</li>
<li>Kuilman, T., Michaloglou, C., Mooi, W. J., Peeper, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essence+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">The essence of senescence.</a> Genes & Development. 24 (22), 2463-2479 (2010).</li>
<li>Lu, T., Finkel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Free+radicals+and+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Free radicals and senescence.</a> Experimental Cell Research. 314 (9), 1918-1922 (2008).</li>
<li>Furumoto, K., Inoue, E., Nagao, N., Hiyama, E., Miwa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+telomere+shortening+is+slowed+down+by+enrichment+of+intracellular+vitamin+C+via+suppression+of+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Age-dependent telomere shortening is slowed down by enrichment of intracellular vitamin C via suppression of oxidative stress.</a> Life Sciences. 63 (11), 935-948 (1998).</li>
<li>Lee, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras+proteins+induce+senescence+by+altering+the+intracellular+levels+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ras proteins induce senescence by altering the intracellular levels of reactive oxygen species.</a> The Journal of Biological Chemistry. 274 (12), 7936-7940 (1999).</li>
<li>Chen, Q., Ames, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-like+growth+arrest+induced+by+hydrogen+peroxide+in+human+diploid+fibroblast+F65+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Senescence-like growth arrest induced by hydrogen peroxide in human diploid fibroblast F65 cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (10), 4130-4134 (1994).</li>
<li>Dumont, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+replicative+senescence+biomarkers+by+sublethal+oxidative+stresses+in+normal+human+fibroblast%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">Induction of replicative senescence biomarkers by sublethal oxidative stresses in normal human fibroblast.</a> Free Radical Biology & Medicine. 28 (3), 361-373 (2000).</li>
<li>Blander, G., de Oliveira, R. M., Conboy, C. M., Haigis, M., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+dismutase+1+knock-down+induces+senescence+in+human+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Superoxide dismutase 1 knock-down induces senescence in human fibroblasts.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (40), 38966-38969 (2003).</li>
<li>Packer, L., Fuehr, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+oxygen+concentration+extends+the+lifespan+of+cultured+human+diploid+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Low oxygen concentration extends the lifespan of cultured human diploid cells.</a> Nature. 267 (5610), 423-425 (1977).</li>
<li>Serra, V., von Zglinicki, T., Lorenz, M., Saretzki, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+superoxide+dismutase+is+a+major+antioxidant+in+human+fibroblasts+and+slows+telomere+shortening%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Extracellular superoxide dismutase is a major antioxidant in human fibroblasts and slows telomere shortening.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (9), 6824-6830 (2003).</li>
<li>Rodier, F., Campisi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four+faces+of+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Four faces of cellular senescence.</a> The Journal of Cell Biology. 192 (4), 547-556 (2011).</li>
<li>Munoz-Espin, D., Serrano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence%3A+from+physiology+to+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence: from physiology to pathology.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 15 (7), 482-496 (2014).</li>
<li>Tchkonia, T., Zhu, Y., van Deursen, J., Campisi, J., Kirkland, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+senescence+and+the+senescent+secretory+phenotype%3A+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Cellular senescence and the senescent secretory phenotype: therapeutic opportunities.</a> The Journal of Clinical Investigation. 123 (3), 966-972 (2013).</li>
<li>van Deursen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+senescent+cells+in+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The role of senescent cells in ageing.</a> Nature. 509 (7501), 439-446 (2014).</li>
<li>Livak, K. J., Schmittgen, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+relative+gene+expression+data+using+real-time+quantitative+PCR+and+the+2%28-Delta+Delta+C%28T%29%29+Method%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method.</a> Methods. 25 (4), 402-408 (2001).</li>
<li>Kim, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperation+between+p21+and+Akt+is+required+for+p53-dependent+cellular+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Cooperation between p21 and Akt is required for p53-dependent cellular senescence.</a> Aging Cell. 16 (5), 1094-1103 (2017).</li>
<li>Serrano, M., Lin, A. W., McCurrach, M. E., Beach, D., Lowe, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oncogenic+ras+provokes+premature+cell+senescence+associated+with+accumulation+of+p53+and+p16INK4a%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Oncogenic ras provokes premature cell senescence associated with accumulation of p53 and p16INK4a.</a> Cell. 88 (5), 593-602 (1997).</li>
<li>Wu, D., Yotnda, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+and+detection+of+reactive+oxygen+species+%28ROS%29+in+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Production and detection of reactive oxygen species (ROS) in cancers.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), (2011).</li>
<li>Wojtala, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+monitor+ROS+production+by+fluorescence+microscopy+and+fluorometry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Methods to monitor ROS production by fluorescence microscopy and fluorometry.</a> Methods in Enzymology. 542, 243-262 (2014).</li>
<li>Duncan, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-associated+dysregulation+of+protein+metabolism+in+the+mammalian+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-associated dysregulation of protein metabolism in the mammalian oocyte.</a> Aging Cell. 16 (6), 1381-1393 (2017).</li>
<li>Yang, L., Song, T., Chen, L., Soliman, H., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleolar+repression+facilitates+initiation+and+maintenance+of+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Nucleolar repression facilitates initiation and maintenance of senescence.</a> Cell Cycle. 14 (22), 3613-3623 (2015).</li>
<li>Coppe, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+secretory+phenotypes+reveal+cell-nonautonomous+functions+of+oncogenic+RAS+and+the+p53+tumor+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated secretory phenotypes reveal cell-nonautonomous functions of oncogenic RAS and the p53 tumor suppressor.</a> PLoS Biology. 6 (12), 2853-2868 (2008).</li>
<li>Kosar, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Senescence-associated+heterochromatin+foci+are+dispensable+for+cellular+senescence%2C+occur+in+a+cell+type-+and+insult-dependent+manner+and+follow+expression+of+p16%28ink4a%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Senescence-associated heterochromatin foci are dispensable for cellular senescence, occur in a cell type- and insult-dependent manner and follow expression of p16(ink4a).</a> Cell Cycle. 10 (3), 457-468 (2011).</li>
<li>Sharpless, N. E., Sherr, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Forging+a+signature+of+in+vivo+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Forging a signature of in vivo senescence.</a> Nature Reviews. Cancer. 15 (7), 397-408 (2015).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+roles+for+p16Ink4a+and+p19Arf+in+senescence+and+ageing+caused+by+BubR1+insufficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Opposing roles for p16Ink4a and p19Arf in senescence and ageing caused by BubR1 insufficiency.</a> Nature Cell Biology. 10 (7), 825-836 (2008).</li>
<li>Baker, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+p16Ink4a-positive+senescent+cells+delays+ageing-associated+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clearance of p16Ink4a-positive senescent cells delays ageing-associated disorders.</a> Nature. 479 (7372), 232-236 (2011).</li>
<li>Baar, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Apoptosis+of+Senescent+Cells+Restores+Tissue+Homeostasis+in+Response+to+Chemotoxicity+and+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Targeted Apoptosis of Senescent Cells Restores Tissue Homeostasis in Response to Chemotoxicity and Aging.</a> Cell. 169 (1), 132-147 (2017).</li>
<li>Farr, J. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cellular+senescence+prevents+age-related+bone+loss+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Targeting cellular senescence prevents age-related bone loss in mice.</a> Nature Medicine. 23 (9), 1072-1079 (2017).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clearance+of+senescent+cells+by+ABT263+rejuvenates+aged+hematopoietic+stem+cells+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Clearance of senescent cells by ABT263 rejuvenates aged hematopoietic stem cells in mice.</a> Nature Medicine. 22 (1), 78-83 (2016).</li>
<li>Yosef, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+elimination+of+senescent+cells+by+inhibition+of+BCL-W+and+BCL-XL%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Directed elimination of senescent cells by inhibition of BCL-W and BCL-XL.</a> Nature Communications. 7, 11190(2016).</li>
<li>Jeon, O. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+clearance+of+senescent+cells+attenuates+the+development+of+post-traumatic+osteoarthritis+and+creates+a+pro-regenerative+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Local clearance of senescent cells attenuates the development of post-traumatic osteoarthritis and creates a pro-regenerative environment.</a> Nature Medicine. 23 (6), 775-781 (2017).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Aqui, apresentamos métodos para monitorar níveis ROS intracelulares durante a senescência de H-Ras-induzida em WI-38 fibroblastos humanos normais. Níveis ROS intracelulares em células vivas podem ser medidos quantitativamente usando o reagente de célula-permeável DCF-DA e citometria de fluxo. Após absorção celular, DCF-DA é deacetilada por esterases intracelulares e, posteriormente, oxidada pela ROS para formar altamente fluorescente 2', 7'-diclorofluoresceína (DCF). Fluorescência de DCF pode ser detectada por citometria...

Mais de 50 anos atrás, Hayflick e Moorhead revelaram que as células normais entrem prisão de crescimento irreversível após o esgotamento do seu potencial proliferativa após um determinado número de divisões celulares1. Este fenómeno é agora conhecido como senescência replicative e acredita-se que correlaciona-se fortemente com o envelhecimento dos2. Embora a progressiva erosão dos telômeros é considerada das principais causas da senescência replicative, várias tensões celulares, tais como o DNA danos, ativação oncogênica e estresse oxidativo, têm sido relatados para induzir um outro tipo de senescência celular chamado de "senescência precoce" ou "senescência induzida por estresse". Curiosamente, senescência prematura desempenha um papel de tumor-supressora potente sobre a ativação de oncogenes, tais como H-Ras e BRAF. Estudos de modelos de rato e tecidos humanos produziram fortes evidências que biomarcadores de senescência celular eram predominantemente presentes em lesões pré-malignas onde oncogênica Ras e BRAF são ativados, mas foram diminuídos em cânceres malignos que desenvolveu a partir Estas lesões3,4,5. Além de seu papel no envelhecimento e supressão de tumor, senescência celular tem demonstrada em estudos anteriores para jogar um papel em vários processos fisiológicos, incluindo a cicatrização de feridas, reparação tecidual, vigilância imunológica e desenvolvimento embrionário6.
Embora a prisão de crescimento tem sido estudado extensivamente como uma marca registrada da senescência celular7, um significativo corpo de evidência sugere que espécies reativas de oxigênio intracelular (ROS) também contribuem para a senescência celular8. A elevação dos níveis ROS durante vários tipos de senescência celular, incluindo replicative senescência e senescência induzida pelo oncogene (OIS), foi originalmente relatada há décadas9,10. Mais diretamente, tratamento exógeno com uma dose subletais de H2O2 induz a senescência11,12. A inibição de enzimas ROS-eliminação, tais como a SOD1, também provoca senescência prematura13. Em contraste, baixas condições de oxigênio ambiente e aumentando o atraso de eliminação de ROS o início da senescência10,14,15. Estes resultados indicam, sem dúvida, que ROS são importantes mediadores ou determinantes da indução da senescência celular. No entanto, como ROS contribuem para a indução da senescência celular e como ROS níveis são elevados durante a senescência celular requerem mais investigação.
Estudos recentes têm revelado que células senescentes têm atividades parácrina potente em células e tecidos através de uma de16,de SASP17vizinhas. No tecido envelhecido, células senescentes promovem relacionadas com o envelhecimento do tecido disfunções através de muitos caminhos através de SASP além uma autónoma depleção de células proliferativas. Vários fatores proinflammatory, tais como IL-6, IL-8, TGFβ e metaloproteinases de matriz (MMPs), secretado pelas células senescentes, causam disfunções relacionadas com o envelhecimento do tecido através do comprometimento da homeostase do tecido, destruição da arquitetura do tecido, senescência das células vizinhas e inflamação estéril18,19. No entanto, SASPs pode ter efeitos benéficos, dependendo do contexto biológico. Além disso, a natureza heterogenetic do SASPs depende do tipo de células senescentes e o estágio de célula, enfatizando a necessidade de investigação mais19.
Aqui, descrevemos técnicas baseadas em citometria rápidas e sensíveis para avaliar os níveis intracelulares de ROS durante OIS. Além disso, métodos de análise dos fatores SASP usando a reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (qPCR) e ELISA são introduzidos.

<table><tbody><tr><td>REAGENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>poly-L-lysine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>BOSC 23</td><td>ATCC</td><td>CRL-11269</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>GIBCO</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td><td>wellgene</td><td>LS202-02</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30013,02</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800-082</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM&nbsp;</td><td>GIBCO</td><td>31985-070</td><td></td></tr><tr><td>pBabe puro-H-RasV12&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>1768</td><td></td></tr><tr><td>pGAG/pol</td><td>Addgene</td><td>14887</td><td></td></tr><tr><td>pVSVG</td><td>Addgene</td><td>1733</td><td></td></tr><tr><td>Turbofect</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R0531</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9268</td><td>8 mg/mL</td></tr><tr><td>puromicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td>2 mg/mL&nbsp;</td></tr><tr><td>formaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-4-cloro-3-indolil &beta; D-galactopiranosídeo (X-gal)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>ferrocianeto de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4252</td><td></td></tr><tr><td>ferricianeto de potássio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9387</td><td></td></tr><tr><td>tripsina-EDTA</td><td>wellgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>DCF-DA</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>D6883</td><td>10 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>MMLV Transcriptase reversa</td><td>Promega</td><td>M1701</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR master 2x mix</td><td>Takara</td><td>PR820A</td><td></td></tr><tr><td>Random Primer</td><td>Promega</td><td>C118A</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>Água destilada ultra-pura</td><td>Invitrogen</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio humano de IL-6 ELISA</td><td>PeproTech</td><td>#900-TM16</td><td></td></tr><tr><td>Ensaio humano de IL-8 ELISA</td><td>PeproTech</td><td>#900_TM18</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENTS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.45 &mu; M Filtro de Seringa</td><td>Sartorius</td><td>16555</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>BEMIS&nbsp;</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio</td><td>NIKON</td><td>TS100</td><td></td></tr><tr><td>Citômetro de fluxo</td><td>BD Bioscience</td><td>LSR Fortessa</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4ml</td><td>Merk Millipore</td><td>UFC800324</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop espectrofotômetro</td><td>BioDrop</td><td>80-3006-61</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de PCR em tempo real</td><td>Applied Biosystems</td><td>ABI Prism 7500</td><td></td></tr><tr><td>ELISA Leitor</td><td>Molecular Devices</td> Leitor <td></td>de <td>microplacas EMax</td></tr></tbody></table>

uma medida quantitativa de espécies reativas de oxigênio e senescência-associado fenótipo secretor em fibroblastos humanos normais durante a senescência induzida pelo oncogene

A Quantitative Measurement of Reactive Oxygen Species and Senescence-associated Secretory Phenotype in Normal Human Fibroblasts During Oncogene-induced Senescence

Senescência celular tem sido considerada um estado de detenção do crescimento irreversível após o esgotamento da capacidade proliferativa ou exposição a várias tensões. Estudos recentes têm estendido o papel da senescência celular para vários processos fisiológicos, incluindo desenvolvimento, cicatrização de feridas, vigilância imunológica e disfunção do tecido relacionadas com a idade. Embora a detenção do ciclo celular é uma característica crítica da senescência celular, uma produção de (ROS) de espécies reativas de oxigênio intracelular aumento também foi demonstrada a desempenhar um papel importante na indução da senescência celular. Além disso, estudos recentes revelaram que células senescentes apresentam potente parácrina atividades em células e tecidos através de um fenótipo secretor associada a senescência (SASP) vizinhas. O acentuado aumento no interesse sobre estratégias terapêuticas contra senescência celular enfatiza a necessidade de uma compreensão precisa de mecanismos de senescência, incluindo ROS intracelular e a SASP. Aqui, descrevemos os protocolos para avaliar quantitativamente os níveis intracelulares de ROS durante a senescência celular H-Ras-induzido usando tintura fluorescente ROS-sensíveis e citometria de fluxo. Além disso, apresentamos técnicas sensíveis para a análise da indução da expressão de RNAm e secreção de fatores SASP. Esses protocolos podem ser aplicados a vários modelos de senescência celular.

Um exemplo de H-Ras-induzido senescência é mostrado na Figura 1. Uma infecção de WI-38 fibroblastos humanos normais com o retrovírus H-RasV12 induzida por dramáticas mudanças morfológicas (figura 1B). Além disso, como mostrado na Figura 1, SA β-gal coloração atividade foi aumentou notavelmente sobre expressão de H-RasV12. Mais de 70% das células mostrou SA β-gal coloração atividade 6D após a infecção...

ROS intracelular foi mostrado para jogar um papel importante na indução da senescência celular. Aqui, descrevemos um ensaio sensível para quantificação dos níveis ROS durante a senescência celular. Nós também fornecemos protocolos para avaliar o fenótipo secretor associada a senescência, que alegadamente contribui para várias desordens relacionadas com a idade.

Uma medida quantitativa de espécies reativas de oxigênio e senescência-associado fenótipo secretor em fibroblastos humanos normais durante a senescência induzida pelo Oncogene

Cellular senescence has been considered a state of irreversible growth arrest upon exhaustion of proliferative capacity or exposure to various stresses. ...

O objetivo geral deste procedimento é fornecer técnicas sensíveis para monitorar os níveis intracelulares de ROS e o fenótipo secretor associado à senescência, ou SASP, durante a senescência celular. Aqui, demonstramos que esses métodos revelam com sucesso os aumentos nos níveis de ROS intracelulares e nos fatores SASP IL-6 e IL-8 durante a senescência induzida por H-Ras em fibroblastos humanos normais WI-38. Essas técnicas permitem monitorar alterações nos níveis de ROS intracelulares durante a senescência celular e a análise da expressão de fatores SASP.A principal vantagem deste método é que eles podem ser aplicados a muitos modelos diferentes de senescência celular. Portanto, este método pode nos ajudar a entender o papel de ROS e SASP na senescência celular e a estudar os mecanismos regulatórios subjacentes. Demonstrando o procedimento estarão Young Yeon Kim e Jee-Hyun Um do meu laboratório.Comece este procedimento preparando o retrovírus H-Ras. Primeiro, semeie células BOSC ecotrópicas em uma placa de cultura revestida com poli-L-lisina e cultive a 37 graus Celsius em uma incubadora de cultura de tecidos por um dia. No dia seguinte, transfectar as células BOSC com DNA retrovi

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

Este vídeo ilustra um ensaio baseado em citometria de fluxo para quantificar células cancerígenas senescentes induzidas por terapia com marcadores de senescência duplos. A detecção e quantificação de células senescentes envolvem o uso de um substrato de β-galactosidase. O substrato é clivado por β-galactosidase lisossômica ativa dentro das células senescentes, produzindo um produto fluorescente que, em conjunto com grânulos de lipofuscina autofluorescentes, marca as células cancerígenas...

Quantificação baseada em citometria de fluxo de células cancerígenas senescentes induzidas por terapia

Se senescência impede ou promove tumorigenesis permanece controverso. Desde agentes quimioterápicos podem induzir as células cancerosas senesce, estudando senescência é essencial para propor novas terapias. No entanto, o ensaio de β-galactosidase padrão e amplamente utilizado apresenta grandes inconvenientes. Propomos aqui um fluxo de ensaio baseado em citometria rápido e sensível para quantificar a senescência.

Um método sensível para quantificar células senescentes Câncer

A senescência celular, o estado irreversível de paragem do ciclo celular, pode ser induzida por vários stresses celulares. Aqui, descrevemos os protocolos para induzir a senescência e métodos celular para avaliar marcadores de senescência.

Técnicas para induzir e quantificar Cellular Senescence

Aqui, vamos discutir uma série de protocolos para indução e validação da senescência celular em culturas de células. Podemos focar diferentes estímulos indutores senescência e descrever a quantificação de marcadores comuns associadas a senescência. Nós fornecemos detalhes técnicos utilizando fibroblastos como modelo, mas os protocolos podem ser adaptados para vários modelos de celulares.

Indução e validação da senescência celular em células humanas primárias

A senescência celular é o fator-chave no desenvolvimento de patologias crônicas relacionadas à idade. A identificação da terapêutica que visam as células senescentes mostra a promessa de estender o envelhecimento saudável. Aqui, nós apresentamos um ensaio novo à tela para a identificação do senotherapeutics baseado na medida da atividade associada da senescência β-galactosidase em únicas pilhas.

Ensaio de triagem à base de SA-β-galactosidase para a identificação de medicamentos Senoterapêuticos

Este protocolo descreve o fluxo de trabalho para rotulagem metabólica de células senescentes e não-divisórias com SILAC pulsado, análise de espectrometria de massa não-alvo, e um cálculo simplificado de meias-vidas proteicas.

Medição das Taxas de Rotatividade de Proteínas em Células Cultivadas Senescentes e Não-Divisórias com Rotulagem Metabólica e Espectrometria de Massa

Aqui apresentamos um método baseado em citometria de fluxo para visualização e quantificação de marcadores associados à senescência múltipla em células únicas.

Detecção simultânea baseada em imagens e flutometria de marcadores de senescência fluorescentes múltiplas em células cancerígenas senescentes induzidas por terapia

Um protocolo para quantificação citométrica de fluxo fluorescente de células cancerígenas senescentes induzidas por drogas quimioterápicas em cultura de células ou em modelos de tumores murinos é apresentado. Os procedimentos opcionais incluem co-imunocoloração, fixação de amostras para facilitar a análise de grandes lotes ou pontos de tempo e o enriquecimento de células senescentes viáveis por classificação citométrica de fluxo.

Sonda de β-Galactosidase Associada à Senescência Fluorescente Vermelha Distante para Identificação e Enriquecimento de Células Tumorais Senescentes por Citometria de Fluxo

Este protocolo apresenta microscopia confocal com luz refletida para a detecção objetiva, por célula única, da atividade beta-galactosidase associada à senescência (SA-β-gal) na fração vascular estromal isolada do tecido adiposo humano. O método é compatível com imunocitoquímica, incorpora controles de pH para avaliação quantitativa e, adicionalmente, oferece uma alternativa mais sensível e menos subjetiva à coloração convencional de SA-β-gal.

Detecção de Senescência usando luz refletida na fração vascular estromal adiposa

Este artigo apresenta um protocolo LysoTracker de células vivas para medir a remodelação lisossômica durante a senescência em fibroblastos humanos IMR-90.

Perfil Lisossômico com LysoTracker para avaliação quantitativa da senescência celular em fibroblastos humanos

Esse método estuda como fibroblastos cutâneos senescentes afetam os saudáveis. A senescência é induzida por exposição à UVB, e o meio condicionado é aplicado aos fibroblastos normais. Ele ajuda a avaliar compostos bioativos que visam a comunicação celular alterada no envelhecimento da pele.

Nova combinação de antioxidantes para restaurar a comunicação intercelular saudável em um modelo in vitro usando meio condicionado de células senescentes

Aprenda a medir espécies reativas de oxigênio e fenótipo secretor associado à senescência em fibroblastos humanos WI-38 durante senescência induzida por H-Ras. Este método utiliza citometria de fluxo, PCR em tempo real e ELISA para análise quantitativa.

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Uma medida quantitativa de espécies reativas de oxigênio e senescência-associado fenótipo secretor em fibroblastos humanos normais durante a senescência induzida pelo Oncogene

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