Um 3-dimensional (3D)-impresso modelo alto Throughput Zebrafish embrião põr
1 de junho de 2018
Aqui, apresentamos um protocolo para projetar e fabricar um embrião de zebrafish põr modelo, seguido por um procedimento detalhado sobre a utilização de tal modelo para alto throughput zebrafish embrião põr em uma placa de 96 poços.
Este método pode acelerar significativamente o procedimento de disposição de embriões de peixe-zebra e tornar o peixe-zebra verdadeiramente receptivo à triagem de alto rendimento. A principal vantagem dessa técnica é o uso de um modelo impresso em 3D para pré-organizar embriões de peixe-zebra em uma matriz de 96 ou 384 poços, o que facilita um processo de preparação de placas altamente eficiente. Tivemos a ideia do método pela primeira vez enquanto realizávamos a triagem de nanopartículas escolhendo e selecionando manualmente embriões individuais em cada poço de uma placa modular e queríamos aumentar a eficiência.
Além de Tianyu, o colega de pós-graduação Yue Jiang demonstrará o procedimento. Comece este procedimento com o design do modelo de arranjo com um layout de doze por oito 96 poços que se encaixa em uma placa padrão de 96 poços. Conforme detalhado no protocolo de texto.
Use uma impressora 3D com precisão de 0,1 milímetro para imprimir o modelo. Alguns componentes-chave do modelo são a câmara de aprisionamento, o poço de aprisionamento, a câmara de vácuo e a saída de entrada. Para realizar a desova do embrião do peixe-zebra, primeiro separe machos e fêmeas por uma divisória de plástico transparente.
Em seguida, coloque dois pares de peixes machos e fêmeas por caixa de acasalamento um dia antes da desova. No dia da desova, retire as divisórias pela manhã para misturar peixes machos e fêmeas. Remova os peixes machos e fêmeas e colete embriões de peixe-zebra usando uma peneira de malha fina.
Lave os embriões com 250 mililitros de água de ovo. Transfira os embriões coletados para placas de Petri com a solução de Holtfreter. Remova os embriões mortos e não fertilizados usando um microscópio estéreo.
Coloque os embriões em uma incubadora a 28,5 graus Celsius. Quatro horas após a fertilização, observe os embriões e remova todos os embriões mortos e insalubres. Os embriões estão agora prontos para a próxima etapa.
Lave o molde duas a três vezes com 500 mililitros de água deionizada antes de colocá-lo no forno de secagem por cinco minutos. Em seguida, prenda a câmara inferior com um filme de vedação de peças. Conecte uma bomba de vácuo através da saída de ar na parte inferior do gabarito para gerar pressão negativa na câmara selada pelo filme de vedação.
Usando uma pipeta de transferência de plástico, coloque aproximadamente 150 embriões no molde. Agite todo o gabarito horizontalmente até que cada poço tenha um embrião preso. Com esta etapa, é fundamental verificar e certificar-se de todos os embriões de peixe-zebra disponíveis.
Se o buffer Holtfreter fosse muito baixo, pode-se adicionar buffer adicional agitando o modelo. Descarte a solução extra de Holtfreter e os embriões que não estão presos nos poços. Desligue e desconecte a bomba de vácuo.
Coloque uma placa padrão de 96 poços de cabeça para baixo contra o gabarito e gire os dois ao mesmo tempo. Bata na parte inferior do gabarito ou conecte a saída de ar a uma lata de gás comprimido para transferir todos os embriões presos do gabarito para a placa de 96 poços. Por fim, remova o filme de vedação e lave o gabarito três vezes de cima para baixo com 500 mililitros de água deionizada para uso futuro.
Aqui é mostrada a imagem parcial de uma placa de 96 poços disposta pelo modelo. Por outro lado, esta imagem mostra a imagem parcial de uma placa de 96 poços disposta manualmente. O estado geral de saúde dos embriões após serem plaqueados por métodos manuais e de modelo de arranjo é exibido aqui.
Com base nas taxas de eclosão, sobrevivência e malformação dos embriões, não foram observados efeitos significativos na saúde geral dos embriões em nenhum dos casos. Uma vez dominada, essa técnica preparará uma placa de 96 ou 384 poços em apenas dois a três minutos, se executada corretamente. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para que os pesquisadores aproveitassem ao máximo os novos recursos desse organismo modelo e realmente alcançassem a triagem in vitro de alto rendimento.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para projetar e fabricar um modelo de ordenação de embriões de zebrafish, permitindo a ordenação de alto rendimento em uma placa de 96 poços. O método aumenta significativamente a eficiência do procedimento de ordenação de embriões de zebrafish.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia do Desenvolvimento
- Triagem de Alto Rendimento
Fundo
- Zebrafish são amplamente utilizados na pesquisa biológica devido aos seus embriões transparentes.
- A ordenação eficiente de embriões é crucial para aplicações de triagem de alto rendimento.
- Métodos tradicionais envolvem seleção manual, o que pode ser demorado.
- A introdução de um modelo impresso em 3D oferece uma solução inovadora para melhorar a eficiência.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo para ordenação de alto rendimento de embriões de zebrafish.
- Utilizar um modelo impresso em 3D para colocação eficiente de embriões.
- Melhorar o processo de triagem para várias aplicações, incluindo teste de nanopartículas.
Métodos Utilizados
- Design de um modelo de ordenação impresso em 3D com um layout de 12 por 8.
- Pré-ordenação de embriões de zebrafish em uma matriz de 96 ou 384 poços.
- Demonstração do procedimento por estudantes de pós-graduação.
- Protocolo de texto detalhado para implementação.
Principais Resultados
- O modelo impresso em 3D permite uma ordenação rápida e eficiente de embriões.
- Economia significativa de tempo em comparação com métodos manuais.
- Facilita capacidades de triagem de alto rendimento.
- Demonstrou eficácia na preparação de placas para experimentos.
Conclusões
- O protocolo desenvolvido melhora a eficiência da ordenação de embriões de zebrafish.
- A utilização de um modelo impresso em 3D é uma inovação chave.
- Este método é benéfico para pesquisadores que realizam triagens de alto rendimento.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
High throughput zebrafish embryo arraying is a critical bottleneck in phenotypic screening and early-stage compound evaluation. The introduction of a 3D-printed template with vacuum manipulation enables rapid, reproducible preparation of multi-well plates, directly supporting scalable screening workflows. This innovation enhances operational efficiency and supports portfolio-wide compound triage in discovery-stage biopharma R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Accelerates preparation of zebrafish embryos for hypothesis-driven compound testing.
- Enables robust phenotypic screening by standardizing embryo placement across wells.
- Supports functional target validation by facilitating high-content, parallelized assays.
Screening & Assay Development
- Delivers rapid, reproducible arraying of embryos for multi-well plate-based screening.
- Improves assay throughput and consistency, reducing manual variability.
- Enables efficient scaling to 96- and 384-well formats for compound libraries.
Translational & Preclinical Research
- Supports disease-relevant phenotypic assays in zebrafish embryos for translational insights.
- Facilitates continuity from early discovery to preclinical model validation.
- Reduces operational barriers to implementing high-throughput in vivo screening platforms.
Pipeline & Workflow Integration
This 3D-printed template method integrates at the interface of early discovery and screening, enabling seamless transition from embryo collection to high-throughput phenotypic assays.
- Discovery Biology: Streamlines hypothesis testing by enabling rapid setup of parallel experimental conditions.
- Screening: Provides standardized, reproducible embryo arraying for quantitative screening outputs.
- Analytics: Supports consistent measurement of phenotypic endpoints across large sample sets.
- Translational Research: Bridges early discovery and preclinical validation by enabling scalable in vivo assays.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable platform for repeated high-throughput screening campaigns.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces biological variability in screening assays.
- Operational Value: Standardizes embryo arraying, enabling reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and resource allocation in early discovery.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by enabling robust, high-throughput phenotypic data generation.
Implementation Considerations
- Requires access to precision 3D printing and basic vacuum instrumentation.
- Demands operator proficiency in embryo handling and template operation.
- Standardization of washing and transfer steps is critical for reproducibility.
- Adaptable to both 96- and 384-well plate formats for diverse screening needs.
- Template cleaning and maintenance are essential for sustained performance.
