Frequente de amostra de sangue da cauda-ponta em camundongos para a avaliação da secreção pulsátil de hormônio luteinizante
4 de julho de 2018
Aqui nós apresentamos um protocolo de amostragem de sangue de cauda-dica para coleta de amostra frequente em camundongos desenfreados. Este método é útil para avaliar os padrões de secreção pulsátil de hormônio luteinizante e pode ser adaptado para a análise de outros fatores circulantes.
O objetivo geral da amostragem frequente de sangue na ponta da cauda é obter amostras de sangue total para a medição da secreção pulsátil do hormônio luteinizante conhecida como LH em camundongos acordados não anestesiados e com comportamento normal. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da neuroendocronologia reprodutiva, fornecendo um protocolo confiável para avaliar a secreção pulsátil do hormônio luteinizante em camundongos. A principal vantagem dessa técnica é que o manuseio e a habituação frequentes garantirão medições robustas e confiáveis do pulso do hormônio luteinizante após tratamentos experimentais agudos ou crônicos.
Durante cinco semanas antes da coleta de sangue, manuseie os camundongos diariamente, de segunda a sexta-feira. Nas duas últimas semanas, manuseie os ratos no sábado e no domingo também. Execute o regime de manuseio do mouse em um gabinete de biossegurança.
Remova o primeiro mouse de sua gaiola e coloque-o em uma superfície adequada dentro do gabinete. Contenha suavemente o mouse nesta superfície, segurando a base de sua cauda. Em seguida, com a outra mão, acaricie firmemente a superfície ventral da cauda da base até a ponta.
Faça isso um total de seis vezes e, em seguida, retorne o mouse à sua gaiola. Isso constitui um conjunto de manipulação. Agora aguarde seis minutos e execute outro conjunto de manuseio.
Continuando esse padrão com intervalos entre conjuntos, execute quatro conjuntos de manuseio por sessão de gerenciamento. No total, isso fornece vinte e quatro golpes de cauda por sessão. Se os tratamentos experimentais durante o período de amostragem incluírem quaisquer métodos adicionais de manuseio, como scruffing ou injeção intraperitoneal, aclimate também os camundongos a essa atividade de manuseio durante as sessões de manuseio.
Duas semanas antes do dia planejado para a coleta de sangue, alojar os camundongos em pares para minimizar sua interrupção durante o período de amostragem. Para as coletas de sangue, prepare tubos de microcentrífuga de 0,6 mililitro para armazenamento de sangue. Rotule os tubos e, para três coletas de sangue de microlitros, alíquota de cinquenta e sete microlitros de tampão ACES em cada tubo.
Depois de preparados, armazene os tubos a quatro graus Celsius. No gabinete de biossegurança tenha os seguintes itens prontos: pontas de pipeta, uma lixeira, um cronômetro, um registro experimental, um balde de gelo contendo os tubos de coleta de sangue, tesoura afiada e estéril, um marcador permanente e uma pequena gaze. Quarenta e cinco minutos antes de iniciar a coleta de sangue, remova o primeiro camundongo de sua gaiola e coloque-o em uma superfície adequada.
Em seguida, marque a cauda para identificar rapidamente este rato de seu parceiro de gaiola. Agora use uma tesoura para remover um a dois milímetros da ponta da cauda. Depois de cortar essa cauda, acaricie-a cuidadosamente até que uma gota de sangue se forme na ponta.
Em seguida, colete três microlitros de sangue e descarte o sangue e a ponta na lixeira. Em seguida, certifique-se de que o fluxo sanguíneo parou. Se necessário, aplique uma leve pressão com gaze estéril.
Em seguida, retorne o mouse à sua gaiola por seis minutos. Agora, em intervalos de seis minutos ao longo de quarenta e cinco minutos, acaricie a cauda com firmeza para coletar amostras de sangue adicionais do camundongo. Se uma gota de sangue não se formar, enxugue a cauda com uma gaze embebida em solução salina para ajudar a limpar o coágulo sanguíneo.
Durante o período de pré-amostragem, rejeitar todas as alíquotas de sangue. Após quarenta e cinco minutos, iniciar o período de amostragem. Ao coletar amostras, transfira três microlitros de sangue para um tubo de coleta, misture o tubo por inversão e coloque-o de volta no gelo.
Prossiga agora com a amostragem durante o tempo que for necessário. Uma vez terminado, eutanasiar os camundongos ou garantir que o fluxo sanguíneo da cauda tenha parado completamente e, em seguida, fornecer aos camundongos uma gaiola limpa. Em seguida, transfira amostras de sangue para uma caixa de armazenamento e armazene as amostras a menos vinte graus Celsius até que possam ser analisadas.
O hormônio luteinizante ou LH foi medido em amostras de sangue frequentes para determinar a resposta a um desafio agudo de estresse psicossocial. Camundongos C57 pretos fêmeas adultas foram ovariectomizados e amostras de sangue foram coletadas por noventa minutos para estabelecer uma linha de base pré-tratamento da secreção pulsátil de LH. Para o tratamento de estresse durante a amostragem de noventa minutos, os animais experimentais foram colocados em dispositivos de contenção de roedores e transferidos para uma nova gaiola, enquanto os controles permaneceram em suas gaiolas domésticas e não foram contidos.
A análise mostrou que os animais de controle apresentaram pulsos claros e inequívocos de LH durante todo o período de amostragem. Em contraste, o estresse psicossocial da contenção suprimiu rápida e inequivocamente a secreção pulsátil de LH no grupo experimental. Ao se preparar para usar essa técnica, é importante lembrar de minimizar os distúrbios ambientais, como ruído ou interrupções de outros investigadores, que podem estressar os camundongos e interromper a secreção pulsátil de LH.
Desde o seu desenvolvimento pelo Dr. Stein e outros no laboratório de Chen, esta técnica começou a abrir caminho para pesquisadores no campo da neuroendocrinologia explorarem a regulação do pulso de LH em uma espécie onde ferramentas moleculares e genéticas complexas são práticas e disponíveis.
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Visão Geral
Este estudo descreve um protocolo de coleta de sangue pela ponta da cauda para obtenção de amostras sanguíneas em camundongos não contidos, com foco na mensuração da secreção pulsátil do hormônio luteinizante (LH). O método foi desenvolvido para permitir avaliações confiáveis da secreção pulsátil de LH, contribuindo para pesquisas em neuroendocrinologia reprodutiva.
Componentes Principais do Estudo
Área de Ciência
- Neuroendocrinologia
- Biologia reprodutiva
- Comportamento animal
Contexto
- A secreção pulsátil do hormônio luteinizante é fundamental na fisiologia reprodutiva.
- Técnicas confiáveis de coleta de sangue são essenciais para medir com precisão as flutuações hormonais.
- Os métodos existentes podem não considerar adequadamente os efeitos do estresse nos animais.
- Este protocolo tem como objetivo minimizar o estresse em camundongos durante a coleta de sangue.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo confiável de coleta de sangue da ponta da cauda em camundongos não contidos.
- Avaliar a secreção pulsátil de LH em resposta a tratamentos agudos e crônicos.
- Aprimorar a precisão dos métodos de pesquisa neuroendocrinológica.
Métodos Utilizados
- O protocolo envolve o manejo diário e a habituação de camundongos antes da coleta de sangue.
- Foram utilizados camundongos fêmeas adultas da linhagem C57BL/6, com coleta de sangue da ponta da cauda para medição de LH.
- Sessões frequentes de manejo ajudaram a facilitar um ambiente livre de estresse.
- As amostras de sangue foram coletadas em um período definido para estabelecer as concentrações hormonais basais.
Resultados Principais
- A técnica resultou na coleta bem-sucedida dos níveis de LH em animais controle.
- O estresse psicossocial provocado pela contenção suprimiu significativamente a secreção de LH nos grupos experimentais.
- O estresse minimizou medições confiáveis da secreção pulsátil de LH, destacando a eficácia do método.
- Verificou-se que distúrbios ambientais afetam as medições hormonais.
Conclusões
- Este estudo estabelece um novo método para obter medições hormonais precisas em camundongos.
- O protocolo permite que pesquisadores explorem efetivamente a regulação do LH em estudos de neuroendocrinologia.
- Compreender o impacto do estresse na secreção hormonal contribui para insights mais amplos sobre a fisiologia reprodutiva e o comportamento animal.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A coleta frequente de sangue na ponta da cauda em camundongos permite uma avaliação de alta resolução da secreção pulsátil do hormônio luteinizante (LH), preenchendo uma lacuna crítica na validação de alvos neuroendócrinos. Essa abordagem aumenta a confiança preditiva na investigação de vias mediadas por hormônios e orienta decisões em estágios iniciais de portfólio ao fornecer leituras endócrinas quantitativas e robustas. A capacidade do método de capturar padrões hormonais dinâmicos em camundongos livres para se movimentar melhora a continuidade translacional da descoberta até a pesquisa pré-clínica.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de vias de sinalização neuroendócrina por meio da medição direta da secreção pulsátil de LH.
- Apoia a desmistificação biológica ao distinguir flutuações hormonais fisiológicas de flutuações induzidas por estresse.
- Fornece dados funcionais de validação de alvo para programas de pesquisa reprodutiva e neuroendócrina.
- Facilita a confiança preditiva em estudos mecanicistas da regulação hormonal.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara modelos animais validados para ensaios endócrinos e de neurobiologia posteriores.
- Fornece medições padronizadas, reprodutíveis e quantitativas de hormônios adequadas para o desenvolvimento de ensaios.
- Permite a triagem de intervenções experimentais que afetam a dinâmica da secreção hormonal.
- Apoia a avaliação confiável de perturbações por compostos ou genéticas in vivo.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se com modelos relevantes para a doença no estudo da disregulação endócrina e das respostas ao estresse.
- Garante a continuidade dos achados em estágio de descoberta até a validação pré-clínica de intervenções moduladoras de hormônios.
- Fornece dados ajustados por risco para avançar alvos neuroendócrinos na fila de desenvolvimento.
- Aprimora a desconsideração preditiva para o desenvolvimento translacional de biomarcadores.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Este método integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir a medição dinâmica de hormônios em modelos animais vivos, apoiando tanto estudos mecanicistas quanto pesquisas translacionais.
- Biologia da Descoberta: Facilita a testagem de hipóteses e a clarificação de vias em sistemas neuroendócrinos.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis de LH para prontidão de ensaios e triagem de intervenções.
- Análises: Fornece dados hormonais com resolução temporal, permitindo comparação estatística de condições experimentais.
- Pesquisa Translacional: Conecta descobertas científicas a modelos pré-clínicos de função endócrina e resposta ao estresse.
- Reutilização Empresarial: Estabelece uma plataforma reutilizável para avaliação dinâmica de hormônios em diversos programas de pesquisa.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na validação de alvos neuroendócrinos.
- Valor Operacional: Padroniza a coleta de hormônios, garantindo reprodutibilidade e escalabilidade entre estudos.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de avançar/não avançar e a eficiência do capital ao fornecer dados endócrinos robustos e quantitativos.
- Impacto na Carteira: Permite a priorização ajustada ao risco de alvos e intervenções que modulam hormônios.
Considerações sobre a Implementação
- Exige experiência em manejo de animais e protocolos de coleta de amostras neuroendócrinas.
- Requer acesso a ensaios hormonais de alta sensibilidade e infraestrutura analítica apropriada.
- Exige padronização rigorosa entre equipes para minimizar estressores ambientais e de manejo.
- Adaptável a diversos modelos de camundongos, mas pode exigir otimização do protocolo para diferentes linhagens ou pontos finais.
- As limitações práticas incluem a necessidade de aclimatação prolongada e controle ambiental cuidadoso para garantir a integridade dos dados.
