Name: Correspondência de contraste detergente em experimentos de espalhamento pequeno ângulo nêutrons para análise estrutural de proteínas de membrana e modelagem do Ab Initio (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: Aprenda a usar espalhamento de nêutrons de pequeno ângulo (SANS) para análise estrutural de proteínas de membrana em solução. Este método permite determinar tamanho, forma e estado oligomérico enquanto mascara detergentes.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

O escritório de biológica e investigação ambiental apoiaram pesquisa do ORNL centro de Biologia Molecular estrutural (CSMB) e Bio-SANS usando recursos suportados pela divisão de instalações científicas usuário, escritório de ciências básicas de energia, departamento dos EUA de energia. O trabalho estrutural em proteínas de membrana no laboratório de Lieberman foi apoiado pelo NIH (DK091357, GM095638) e NSF (0845445).

Os autores Volker S. Urban, Sai Venkatesh Pingali, Kevin L. Weiss e Ryan C. Oliver são contratados através de UT-Battelle nos DOE para apoiar o programa de usuário ciência nêutrons e Bio-SANS instrumento no Oak Ridge National Laboratory usado neste artigo.
Este manuscrito tem sido co-autoria de UT-Battelle, LLC, sob contrato DE-AC05-00OR22725 com nos departamento de energia (DOE). O governo dos EUA mantém e Publicador, aceitando o artigo para publicação, reconhece que o governo dos EUA mantém uma licença não exclusiva, integralizada, irrevogável, mundial, para publicar ou reproduzir o formulário publicado este manuscrito ou permitir que outros a fazê-lo, para fins de governo dos Estados Unidos. DOE fornecerá acesso público a esses resultados de pesquisa patrocinado pelo governo federal, em conformidade com o plano de acesso público do DOE. 82

Pesquisadores de biologia estrutural aproveitam técnicas estruturais complementares como espalhamento da solução para obter detalhes bioquímicos e estruturais (como forma e tamanho total) de biomoléculas em solução. SANS é uma técnica particularmente atraente para a determinação de estruturas de baixa resolução de proteínas de membrana, um foco central de Bioquímica e biologia estrutural moderna. SANS requer quantidades de proteínas purified comparáveis dos ensaios cristalográficos (1 mg/amostra). A disponibilidade comer...

Proteínas da membrana são codificadas por um estimado de 30% de todos os genes1 e representam uma forte maioria de alvos para drogas medicinais modernos. 2 estas proteínas executam uma grande variedade de funções celulares vitais,3 mas apesar da sua abundância e importância — representam apenas cerca de 1% do totais estruturas depositados na organização da pesquisa para proteína de Bioinformática estrutural (RCSB) Banco de dados. 4 devido à sua natureza parcialmente hidrofóbica, determinação estrutural de proteínas de membrana-limite tem sido extremamente desafiador. 5 , 6 , 7
Como muitas técnicas biofísicas exigem monodisperso partículas em solução para medição, isolando as proteínas de membrana de membranas nativas e estabilizar estas proteínas em um mímico solúvel das membranas nativas tem sido uma área ativa de pesquisa em recentes décadas. 8 , 9 , 10 estas investigações levaram ao desenvolvimento de muitos conjuntos de romance anfifílica para solubilizar as proteínas de membrana, tais como nanodiscs,11,12,13 bicelles,14,15 e amphipols. 16 , 17 no entanto, o uso de detergentes micelas continua a ser uma das abordagens mais comuns e simples para satisfazer os requisitos de solubilidade de uma determinada proteína. 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 -infelizmente, nenhum único detergente ou mistura mágica de detergentes existe atualmente que satisfaça todas as proteínas de membrana; assim, estas condições devem ser empiricamente selecionadas para os requisitos exclusivos de cada proteína. 26 , 27
Detergentes auto-montagem na solução acima da concentração crítica micelle para formar estruturas agregadas chamadas micelas. Micelas são compostas de muitos monômeros detergentes (normalmente variando de 20-200) com cadeias alquila hidrofóbicas, formando um núcleo micelle e grupos cabeça hidrofílicos, dispostos em uma camada de casca micelle enfrentando o solvente aquoso. O comportamento de detergentes e formação micela foi classicamente descrito por Charles Tanford em O efeito hidrofóbico,28 e tamanhos e formas das micelas de detergentes usados em estudos de proteínas de membrana têm sido caracteriza-se usando o pequeno ângulo espalhamento. 29 , 30 organização de detergente sobre as proteínas de membrana também tem sido estudada, e a formação de complexos proteína-detergente (PDCs) é esperada com moléculas de detergente em torno da proteína em um arranjo que se assemelha o detergente puro micelas. 31
Um adicionado a vantagem em usar detergentes é que as propriedades de micela resultante podem ser manipuladas, incorporando outros detergentes. Muitos detergentes exibem uma mistura ideal, e selecione Propriedades de micelas mistas nem podem ser previstas a partir os componentes e a proporção de mistura. 22 no entanto, a presença de detergente pode ainda apresentar desafios para caracterizações biofísicos, contribuindo para o sinal global. Por exemplo, com raio-x e técnicas de espalhamento de luz, sinal de detergente no PDC é praticamente indistinguível da proteína. 32 investigações com single-particle cryo-microscopia (cryo-EM) normalmente contam com partículas (congeladas) presas; detalhes estruturais da proteína ainda são obscurecidos por determinados detergentes ou uma alta concentração de detergente, que acrescenta ao fundo. 33 abordagens alternativas para interpretar a estrutura completa do PDC (incluindo o detergente) foram feitas através de métodos computacionais que visam reconstruir o detergente em torno de uma proteína de membrana determinado. 34
Para o caso de dispersão de nêutrons, o arranjo de núcleo-casca de detergente no micelle produz um fator de forma que contribui para a dispersão observada. Felizmente, componentes de solução podem ser alterados, tal que eles não contribuem para a dispersão líquida observada. Este processo de "correspondência de contraste" é conseguido pela substituição de deutério de hidrogênio obter uma densidade de comprimento de dispersão que corresponde do fundo (tampão). Uma escolha criteriosa de detergente (com contrapartes deuterados disponíveis) e sua proporção de mistura devem ser considerados. Para detergentes micelas, essa substituição pode ser realizada usando um detergente com o mesmo grupo de cabeça mas tendo uma cadeia deuterado (d-cauda em vez de h-cauda). Uma vez que os detergentes são bem misturados,35 seus agregados terá uma densidade de comprimento de dispersão que é a fração molar-ponderada média dos dois componentes (h-caudas e d-caudas). Quando este contraste médio é consistente com a do grupo principal, as estruturas de agregação uniformes podem ser correspondidas totalmente para remover todas as contribuições para dispersão observada.
Apresentamos aqui um protocolo para manipular o contraste de nêutrons de micelas detergentes pela incorporação de moléculas de detergente quimicamente idênticas com cadeias alquila deutério-rotulados. 19 , 36 , 37 isto permite completo contraste simultâneo de correspondência do micelle núcleo e casca, que é um recurso exclusivo de dispersão de nêutrons. 35 , 38 com este significativamente refinado nível de detalhe, correspondência de contraste pode habilitar caso contrário inviáveis estudos de estruturas de proteínas de membrana. Além disso, esta abordagem de correspondência de contraste pode ser estendida para outros sistemas que envolvem detergente, como polímero troca reações dispersantes óleo-água e39 ,40 ou até mesmo outros agentes solubilizante, tais como bicelles,41 nanodiscs,42 ou bloco de copolímeros. 43 A abordagem semelhante como descrito neste manuscrito, mas empregando uma única espécie de detergente com substituições de deutério parcial sobre o grupo alquila de cadeia e/ou cabeça, foi recentemente publicada. 37 enquanto isso pode ser esperado para melhorar a distribuição aleatória de hidrogênio e deutério em todo o detergente em comparação com a abordagem apresentada aqui, o número limitado de posições disponíveis sobre o detergente para substituição e em duas etapas síntese de detergente necessário coloca desafios adicionais para a consideração.
As etapas 1 e 2 do Protocolo detalhado abaixo muitas vezes sobrepõem-se desde o planejamento do experimento inicial deve ser feito para apresentar uma proposta de qualidade. No entanto, a apresentação de proposta é considerada aqui como o primeiro passo para enfatizar que esse processo deve ser iniciado bem antes de um experimento de nêutrons. Também deve ser notado que um passo pré-requisito, que deve ser demonstrado pela proposta, é a caracterização bioquímica e física (incluindo pureza e estabilidade) da amostra apoiando a necessidade de estudos de nêutrons. Uma discussão geral do ângulo pequeno neutrão espalhamento (SANS) está além do escopo deste artigo. Uma introdução breve, mas completa está disponível na obra de referência, Caracterização de materiais por Kaufmann,44 e uma abrangente livro focado em pequeno ângulo solução biológica dispersando recentemente tem sido publicado. 45 -mais leitura recomendada é dado na seção de discussão. Dispersão de ângulo pequeno usa o vetor de dispersão chamado Q como a quantidade de central que descreve o processo de espalhamento. Este artigo usa a definição amplamente aceita Q = 4π sin (θ) / λ, onde θ é meio o ângulo entre o feixe de entrada e dispersado e λ é o comprimento de onda da radiação de nêutron em Angstroms. Outras definições existem que uso diferentes símbolos tais como está ' para o vetor de dispersão e que podem diferir por um fator 2 π ou usando nanômetros no lugar de Angstrom (Veja também a discussão da Figura 10).

<table><tbody><tr><td>Concentrador Amicon Ultra MWCO 50KDa&nbsp;</td>Material de <td>laboratório</td> <td>EMD Millipore</td><td>UFC905096</td></tr><tr><td>Citrato de amônio dibásico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A663</td><td>componente médio</td></tr><tr><td>Sulfato de amônio</td><td>EMD Millipore</td><td>2150</td><td>componente médio</td></tr><tr><td>Bioflo 310 Sistema de biorreator</td><td>Eppendorf</td><td>M1287-2110</td><td>equipamento</td></tr><tr><td>Cloreto de cálcio di-hidratado</td><td>Acros</td><td>423525000</td><td>componente médio</td></tr><tr><td>Carbenicilina</td><td>IBI</td><td>Antibiótico</td><td>IB02025</td> científico</tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>EMD Antibiótico Millipore</td><td>3130</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de cobalto (II)</td><td>Acros</td><td>AC21413-0050</td><td>componente médio</td></tr><tr><td>Sulfato de cobre (II)</td><td>Acros</td><td>AC19771-1000&nbsp;</td><td>componente médio</td></tr><tr><td>Óxido de deutério</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>756822</td><td>Purificador</td>de</tr><tr><td>gás Drierite</td> de componente médio <td>W.A. Hammond Drierite Co. Ltd.</td><td>27068</td><td></td></tr><tr><td>EDTA, dissódico, di-hidratado</td><td>EMD Millipore</td><td>4010</td><td>componente médio</td></tr><tr><td>Emulsiflex-C3</td><td>Avestin</td><td>EF-C3</td><td>equipamento</td></tr><tr><td>&Auml; Purificador kta UPC100</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td></td><td>equipamento</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5516</td><td>componente médio</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR coluna</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td></td><td></td>17116701</tr><tr><td>Imidazol</td><td>VWR</td><td>97064-622</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Teknova</td><td>I3325</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de ferro (III) hexahidratado</td><td>MP Bioquímicos</td><td>ICN19404590</td><td>componente médio</td></tr><tr><td>LB Agar Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1425-2</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de magnésio heptahidratado</td><td>VWR</td><td>97062-134</td><td>componente médio</td></tr><tr><td>Sulfato de manganês(II) monohidratado</td><td>Acros</td><td>AC20590-5000</td><td>componente médio</td></tr><tr><td>MaxQ 6000 Incubated/Refrigerated Shaker</td><td>Thermo Scientific</td><td>SHKE6000-7&nbsp;</td><td>equipamento</td></tr><tr><td>n-Dodecil-d25-&beta;-D-maltopiranosídeo</td><td>Anatrace</td><td>D310T</td><td></td></tr><tr><td>n-Dodecil-&beta;-D-maltopiranosídeo</td><td>Anatrace</td><td>D310A</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio monobásico</td><td>VWR</td><td>97062-346</td><td>componente médio</td></tr><tr><td>RC 6 Plus Centrífuga</td><td>Thermo Scientific Sorvall</td><td>46910</td><td>equipamento</td></tr><tr><td>SIGMAFAST comprimidos de coquetel inibidor de protease, Cloreto de</td> sódio <td>Sigma-Aldrich</td><td>S8830</td><td></td>sem EDTA</tr><tr><td>Hidróxido de sódio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td> S3014 Sigma-Aldrich 795429 <td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio dibásico</td> Filtro de seringa estéril de 25mm de <td>componente médio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7907</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> com 0,2&micro;<td></td></tr><tr><td> m Membrana PES</td><td>VWR</td><td>28145-501</td><td>Labware</td></tr><tr><td>Filtro de topo de garrafa descartável estéril com 0,2&micro; m Membrana PES</td><td>Thermo Scientific</td><td>596-4520&nbsp;</td><td>material de laboratório</td></tr><tr><td>Superdex 200 10/300 GL&nbsp;</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td></td><td></td>17517501</tr><tr><td>coluna Superose-12 10/300 GL&nbsp;</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td></td><td></td>17517301</tr><tr><td>Ultrospec 10 Medidor de Densidade de Células</td><td>GE Healthcare&nbsp;</td><td>80211630</td><td>equipamento</td></tr><tr><td>Sulfato de zinco monohidratado</td><td>Acros</td><td>AC38980-2500&nbsp;</td><td>componente médio</td></tr></tbody></table>

correspondência de contraste detergente em experimentos de espalhamento pequeno ângulo nêutrons para análise estrutural de proteínas de membrana e modelagem do ab initio

Contrast-Matching Detergent in Small-Angle Neutron Scattering Experiments for Membrane Protein Structural Analysis and Ab Initio Modeling

O instrumento de dispersão de nêutrons de pequeno ângulo biológico no alto fluxo Isotope Reactor de Oak Ridge National Laboratory dedica-se à investigação de materiais biológicos, processamento de biocombustíveis e materiais bio-inspirado cobrindo nanômetros para escalas de comprimento do micrômetro. Os métodos apresentados aqui para investigar propriedades físicas (ou seja, o tamanho e forma) de proteínas de membrana (aqui, MmIAP, um intramembrane aspartil protease de Methanoculleus marisnigri) em soluções de formação de micela detergentes são well-suited para este instrumento de dispersão de nêutrons de pequeno ângulo, entre outros. Outras técnicas de caracterização biofísica são prejudicadas por sua incapacidade de abordar as contribuições de detergente em uma estrutura complexa de proteína-detergente. Além disso, o acesso ao laboratório de Bio-Deuteration fornece recursos exclusivos para a preparação de cultivos em grande escala e expressando proteínas deutério-labeled pelo sinal de maior dispersão da proteína. Enquanto esta técnica não fornece detalhes estruturais em alta resolução, a lacuna de conhecimento estrutural para proteínas de membrana contém muitas áreas endereçáveis de pesquisa sem a necessidade de resolução atômica perto. Por exemplo, estas áreas incluem a determinação dos Estados oligoméricos, a formação do complexo, a mudanças conformacionais durante a perturbação e eventos de dobradura/revelação. Estas investigações podem ser facilmente realizadas através de aplicações deste método.

Uma proposta de tempo e instrumento de feixe claramente deve transmitir todas as informações necessárias para o Comitê de revisão para que uma avaliação válida do experimento proposto pode ser feita. Comunicação com um NSS é altamente recomendada para usuários inexperientes. O NSS podem avaliar a viabilidade inicial e apresentação de proposta de guia para enfatizar o potencial para a ciência de alto impacto, segurança e viabilidade. As informações fornecidas na proposta devem incluir info...

Este protocolo demonstra como obter um modelo de baixa resolução ab initio e detalhes estruturais de uma proteína de membrana detergente-solubilizado em solução usando dispersão de nêutrons de ângulo pequeno com correspondência de contraste do detergente.

Correspondência de contraste detergente em experimentos de espalhamento pequeno ângulo nêutrons para análise estrutural de proteínas de membrana e modelagem do Ab Initio

The biological small-angle neutron scattering instrument at the High-Flux Isotope Reactor of Oak Ridge National Laboratory is dedicated to the ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave sobre proteínas de membrana integral, como o estado oligomerico, seu tamanho, forma geral e estrutura de baixa resolução na solução. Estudos de solução de proteínas de membrana requer moléculas estabilizadoras como detergentes. Essa técnica tem a vantagem de que torna os detergentes invisíveis e destaca o sinal da proteína da membrana.As implicações dessa técnica se estendem a muitas questões de pesquisa biológica e médica porque mais de 1/3 das proteínas residem em membranas onde realizam muitas funções celulares vitais. A demonstração visual deste método é fundamental, pois a rotulagem de deutério e as etapas de dispersão de nêutrons são difíceis de aprender porque pouquíssimas instituições oferecem treinamento nessas técnicas. Para começar, determine densidades de comprimento de dispersão de nêutrons ou SLDs usando o aplicativo web MULCh, módulos para a análise de dados de variação de contraste.Abra o módulo de contraste clicando em contraste localizado no painel de navegação esquerdo. Forneça texto para um título de projeto e insira os detalhes abaixo para dois componentes como subunnit um e subunit dois. Digite a fórmula mo

contrast-matching-detergent-small-angle-neutron-scattering

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Muitas proteínas desempenham sua função quando ligadas às superfícies da membrana. A ligação de proteínas extrínsecas nas membranas dos nanodiscos pode ser indiretamente visualizada por microscopia eletrônica de transmissão. Mostramos que o empilhamento característico (rouleau) de nanodiscos induzido pela coloração negativa fosfotungstato de sódio é impedido pela ligação de proteínas extrínsecas.

Método para visualizar e analisar membrana proteínas que interagem por Microscopia Eletrônica de Transmissão

Estruturas de conjuntos supramoleculares proteína em resolução atômica são de alta relevância, por causa de seus papéis cruciais em uma variedade de fenômenos biológicos. Neste documento, apresentamos um protocolo para realizar estudos estruturais de alta resolução em assemblies de proteína macromolecular insolúvel e não cristalina por magia-ângulo girando espectroscopia da ressonância magnética nuclear Solid-State (MAS SSNMR).

Escala atômica estudos estruturais de conjuntos macromoleculares por espectroscopia de estado sólido da ressonância magnética Nuclear

É apresentado um protocolo simplificado para realizar uma extensa Caracterização bioquímica e estrutural de uma proteína de ligação do substrato de hidrato de carbono do Streptococcus pneumoniae .

Caracterização bioquímica e estrutural do carboidrato transporte proteína-substrato-SP0092

Este método descreve a clonagem, expressão e purificação de recombinantes Nsa1 para determinação estrutural por cristalografia de raios x e espalhamento de raios-x de pequeno ângulo (SAXS) e é aplicável para a análise estrutural de híbrido de outras proteínas contendo os dois ordenados e desordenada de domínios.

Combinando a cristalografia de raios x com espalhamento de raios-x de pequeno ângulo para modelar regiões não-estruturadas de Nsa1 de S. Cerevisiae

Descreveremos um protocolo para a deteção de detergente sensíveis interações entre proteínas de membrana, usando a ligação do receptor classificação, sortilin, o primeiro loop luminal da proteína do transportador de glicose, GLUT4, como exemplo.

Deteção de detergente sensíveis interações entre proteínas de membrana

Aqui, apresentamos como espalhamento de raio-x do pequeno ângulo (SAXS) pode ser utilizada para obter informações sobre envelopes de baixa resolução que representa as estruturas macromoleculares. Quando usado em conjunto com técnicas estruturais de alta resolução como a cristalografia de raio-x e ressonância magnética Nuclear, SAXS pode fornecer insights detalhadas em vários domínios de proteínas e complexos macromoleculares em solução.

Estudos estruturais de macromoléculas em solução usando o pequeno ângulo de espalhamento de raios-x

Apresentado aqui é um protocolo para a determinação do estado oligomerico de proteínas de membrana que utiliza um sistema de nanopartículas de membrana celular nativa em conjunto com microscopia eletrônica.

Sistema de nanopartículas de membrana celular nativa para análise de interação proteína-proteína de membrana

O presente protocolo descreve métodos para investigar a estrutura e a dinâmica de duas proteínas modelo que têm um papel importante na saúde humana. A técnica combina caracterização biofísica de bancada com espectroscopia de eco de giro de nêutrons para acessar a dinâmica em escalas de tempo e comprimento relevantes para movimentos interdomínios proteicos.

Estudo da Dinâmica da Proteína via Espectroscopia de Eco de Neutron Spin

Este artigo descreve os protocolos de preparação de amostras, redução de dados e análise de dados em estudos de eco de giro de nêutrons (NSE) de membranas lipídicas. A rotulagem criteriosa de deutério de lipídios permite o acesso a diferentes dinâmicas de membrana em comprimento mesoscópico e escalas de tempo, sobre as quais ocorrem processos biológicos vitais.

Espectroscopia de Eco de Rotação de Nêutrons como uma sonda única para dinâmicas de membrana lipídica e interações membrana-proteína

A espectroscopia de retroespalhamento de nêutrons oferece um acesso não destrutivo e livre de rótulos à dinâmica ps-ns de proteínas e sua água de hidratação. O fluxo de trabalho é apresentado com dois estudos sobre proteínas amiloides: sobre a dinâmica resolvida no tempo da lisozima durante a agregação e sobre a dinâmica da água de hidratação da tau após a formação de fibras.

Espectroscopia de Nêutrons de Alta Resolução para Estudo da Dinâmica de Proteínas e Água de Hidratação de Picossegundos-Nanossegundos

Este estudo descreve o procedimento para reconstituir o canal K+ sensível à ácido-sensitivo relacionado à proteína de membrana TWIK (Task2) em nanodiscos. A montagem bem-sucedida foi confirmada por microscopia crio-eletrônica de partícula única, que forneceu médias de classe bidimensionais bem definidas.

Uma técnica para estabilizar proteínas de membrana em nanodiscos

Aprenda a usar espalhamento de nêutrons de pequeno ângulo (SANS) para análise estrutural de proteínas de membrana em solução. Este método permite determinar tamanho, forma e estado oligomérico enquanto mascara detergentes.

Correspondência de contraste detergente em experimentos de espalhamento pequeno ângulo nêutrons para análise estrutural de proteínas de membrana e modelagem do Ab Initio (Vídeo) | JoVE Journal

Correspondência de contraste detergente em experimentos de espalhamento pequeno ângulo nêutrons para análise estrutural de proteínas de membrana e modelagem do Ab Initio

Explorar mais vídeos