Produção e visualização de Spheroplasts bacterianas e protoplastas para caracterizar a localização de peptídeo antimicrobiano

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de peptídeos antimicrobianos sobre se os peptídeos se localizam ou se translocam através da membrana celular. O uso de esferoplastos e protoplastos permite a visualização e análise da localização de peptídeos em um sistema modelo fisiologicamente relevante sem os desafios de resolução encontrados com imagens de células bacterianas. Embora esse método possa fornecer informações sobre peptídeos antimicrobianos, ele também pode ser aplicado a outros agentes ativos de membrana, como peptídeos que penetram nas células.

Os esferoplastos de E.coli Gram-negativos e o protoplasto de B.megaterium Gram-positivo devem ser preparados em uma cabine de segurança biológica ou capela de fluxo laminar usando a técnica estéril apropriada. Se desejado, as cepas bacterianas podem conter um plasmídeo resistente a antibióticos, e esferoplastos e protoplastos podem ser preparados em uma bancada de laboratório aberta. Neste vídeo, esferoplastos e protoplastos são preparados em uma bancada de laboratório aberta usando cepas bacterianas resistentes a antibióticos.

Para configurar uma cultura durante a noite, use uma ponta de micropipeta estéril para transferir uma única colônia bacteriana de uma placa de cultura de ágar sólido para um tubo de cultura de 14 mililitros, contendo dois a três mililitros de caldo de soja tripticase a três por cento, TSB, para uma incubação de 16 a 21 horas a 37 graus Celsius com agitação. Para preparar esferoplastos de E.coli Gram-negativos, dilua a cultura durante a noite na proporção de um para 100 e 25 mililitros de TSB em um frasco de 250 mililitros e retorne as bactérias à incubadora agitada por mais 2,5 horas. Quando a solução atingir uma densidade óptica de 0,5 a 0,8 a 600 nanômetros, diluir a cultura na proporção de um para dez em TSB fresco em um novo frasco de 250 mililitros para uma segunda incubação de 2,5 horas com uma concentração efetiva final de 60 microgramas por mililitro de cefalexina.

Produzir filamentos de célula única de cerca de 50 a 150 micrômetros de comprimento, conforme visualizado sob um microscópio óptico com uma ampliação de 1000x. Centrifugar a solução bacteriana para colher os filamentos e decantar o sobrenadante. Lave os filamentos com a adição suave de um mililitro de sacarose 0,8 molar, tomando cuidado para não perturbar o pellet.

Após um minuto, rejeitar o sobrenadante sem perturbar o sedimento e adicionar os reagentes indicados pela respectiva ordem aos filamentos. Após dez minutos à temperatura ambiente, adicione gradualmente um mililitro da solução A durante um período de um minuto, agitando suavemente a solução com a mão. Incube a solução por quatro minutos à temperatura ambiente, depois divida a suspensão do filamento em duas alíquotas iguais entre dois tubos cônicos de 15 mililitros contendo sete mililitros de solução de quatro graus Celsius B. Em seguida, pelete os filamentos por centrifugação e use pipeta assiriológica para remover cuidadosamente todos, exceto um a dois mililitros do sobrenadante, sem perturbar os pellets.

Use uma micropipeta p1000 para ressuspender suavemente os pellets. Verifique uma pequena alíquota da amostra para formação de esferoplastos por microscopia de luz. O esferoplasto pode então ser armazenado a menos 20 graus Celsius por até uma semana ou até que tenha passado por três ciclos de congelamento e descongelamento.

Para preparar protoplastos Gram-positivos de B. megaterium, dilua a cultura bacteriana durante a noite na proporção de um para 1000 em 100 mililitros de três por cento de TSB em um frasco de 250 mililitros para uma incubação de 4,5 horas a 37 graus Celsius com agitação. Quando a cultura líquida atingir uma densidade óptica de 0,9 a 1,0 a 600 nanômetros, divida a bactéria entre dois tubos cônicos de 50 mililitros para sua centrifugação e use pipeta assiriológica para asperar os sobrenadantes. Ressuspenda os pellets em 2,5 mililitros de meio protoplasto por tubo e puxe a suspensão para um único tubo cônico para cultura em um frasco de 125 mililitros.

Adicione um mililitro de cinco miligramas por mililitro de lisozima à cultura para uma incubação de uma hora a 37 graus Celsius com agitação. Monitorar o crescimento do protoplasto sob o microscópio óptico e observar quaisquer irregularidades, como bactérias que aparecem como bastonetes inchados em vez de esferas. No final da incubação, transferir a suspensão para um tubo cónico de 15 mililitros para centrifugação e suspender novamente o pellet em cinco mililitros de meio protoplasto.

O protoplasto pode então ser armazenado a menos 20 graus Celsius por até uma semana ou até que tenham passado por três ciclos de congelamento e descongelamento. Para visualização do esferoplasto ou protoplasto, transfira cinco microlitros da suspensão de interesse para uma lâmina de vidro revestida com poli L lisina, seguida por dois microlitros de peptídeo antimicrobiano ou AMP marcado com fitc de 100 a 200 micromolares. Após uma incubação de três minutos protegida da luz, adicione um microlitro de uma matriz de membrana apropriada à amostra para outra incubação de três minutos no escuro.

No final da incubação, cubra o esferoplasto ou protoplasto rotulado com uma lamínula de vidro e sele a lamínula com o esmalte. Para obter imagens das células, ligue o microscópio confocal e o laser apropriado e selecione a objetiva 63x e, em seguida, use o software de imagem apropriado para obter imagens de pilha Z compostas de oito bits 512 por 512 compostas por fatias de 0,5 micrômetro de toda a célula bacteriana de interesse. Para visualizar a localização do AMP marcado com fluorescência, abra as imagens da pilha Z composta em um programa de análise de imagem apropriado e localize a fatia mais central do primeiro esferoplasto ou protoplasto de interesse.

Coloque uma região circular de 0,3 micrômetro de diâmetro de interesse na membrana, uma no centro da célula e outra longe da célula para medir a fluorescência de fundo, tomando cuidado para evitar pixels saturados. A intensidade média de fluorescência em cada região de interesse pode então ser calculada pelo software. Os limites de resolução dos microscópios ópticos convencionais tornam difícil distinguir se os sinais peptídicos marcados com fluorescência surgem da membrana ou do espaço intracelular em bactérias normais.

À medida que os sinais se localizam na membrana, parecerão se sobrepor ao espaço intracelular. Em contraste, o tamanho aumentado do esferoplasto e do protoplasto em comparação com as bactérias normais resulta em uma resolução clara entre o marcador de membrana e o espaço intracelular. Tornando mais fácil distinguir a localização do peptídeo.

Por exemplo, a localização na membrana e a translocação através da membrana celular do peptídeo marcado com fluorescência podem ser visualizadas tanto no esferoplasto de E.coli quanto no protoplasto de B. megaterium, por microscopia de fluorescência confocal, como acabamos de demonstrar. A colocação de regiões de interesse na membrana e no espaço intracelular do esferoplasto ou protoplasto e no fundo, permite o cálculo da razão entre a intensidade de fluorescência do peptídeo intracelular e a intensidade de fluorescência do peptídeo na membrana de cada esferoplasto ou protoplasto interagindo com o AMP. Por exemplo, este método pode ser usado para visualizar as interações de um mutante peptídico microbiano derivado de histonas com protoplastos E.coli spheroplast e B.megaterium.

Neste experimento, o AMP demonstrou um padrão de localização semelhante em ambas as cepas de bactérias. Destacando sua translocação reduzida em relação ao peptídeo do tipo selvagem. Em última análise, essa técnica permite que os pesquisadores explorem os padrões de localização de peptídeos em um único nível celular.

Oferecendo insights sobre o mecanismo de ação de um peptídeo de interesse. Além de permitir que os pesquisadores coletem um número maior de imagens para a caracterização sistemática dos mecanismos peptídicos, as imagens de esferoplastos e protoplastos maiores são mais gerenciáveis para análise quantitativa do que as de células bacterianas menores.