Name: Produção e visualização de Spheroplasts bacterianas e protoplastas para caracterizar a localização de peptídeo antimicrobiano (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-11T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 13 s
Description: Aprenda a produzir esferoplastos de Escherichia coli e protoplastos de Bacillus megaterium para visualizar a localização de peptídeos antimicrobianos. Este método permite caracterizar interações peptídeo-bactéria em sistemas modelos fisiologicamente relevantes.

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Pesquisa foi apoiada pelo Instituto Nacional de alergia e doenças infecciosas (NIAID-NIH) prêmio R15AI079685.

1. preparação da solução
Nota: Prepare soluções descritas nos passos 1.1 – 1.9 e 1.8 – 1.11 para produzir spheroplasts de e. coli e b. megaterium protoplastas, respectivamente.
<ol><li>Preparar 1 M Tris-Cl, pH 7,8 dissolvendo 10,34 Tris HCl e 4,17 g de Tris OH em 50 mL de dH2O num balão de 125 mL. Esterilizar por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm e armazenar em um tubo cônico em temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare a solução A 20 mM MgCl2, 0,7 M de sacarose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8 dissolvendo 0,10 g MgCl2 (95,2 g/mol) e sacarose g 11,98 (342.3 g/mol), em 25 mL dH2O num 125 mL. Adicionar 500 µ l 1 M Tris-Cl (pH 7,8) e ajuste o volume para 50 mL. Esterilizar por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm e armazenar em um tubo cônico em temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare a solução B (10 mM MgCl2, 0,8 M de sacarose, 10 mM Tris-Cl, pH 7,8) dissolvendo-se 0,05 g MgCl2 (95,2 g/mol) e 13,69 g sacarose (342.3 g/mol), em 25 mL dH2O num 125 mL. Adicionar 500 µ l 1 M Tris-Cl (pH 7,8) e ajuste o volume para 50 mL. Esterilizar por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm e armazenar em um tubo cônico em temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare-se pela dissolução de sacarose g 13,69 (342.3 g/mol) em 50 mL dH2O num 125 mL 0,8 M de sacarose. Esterilizar por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm e armazenar em um tubo cônico em temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparar a desoxirribonuclease 5mg/mL eu (DNase eu) pela dissolução de 0,015 g DNase I em 3 mL de dH2O num balão de 50 mL. Esterilize por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm. Alíquota solução nos tubos de microcentrífuga e loja a-20 ° C.</li>
	<li>Preparar a 0,125 M o ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), pH 8.0, dissolvendo dissódico de EDTA 0,698 g desidratar (372.2 g/mol) em 15ml dH2O num balão de 125 mL. Esterilizar por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm e armazenar em um tubo cônico em temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare-se 600 cefalexina µ g/mL, dissolvendo 0,03 g de hidrato de Cefalexina (365.404 g/mol) em 50 mL de dH2O num balão de 125 mL. Esterilizar por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm e armazenar em um tubo cônico em 4 ° C.</li>
	<li>Prepare lisozima de 5 mg/mL, dissolvendo lisozima 0,015 g em 3 mL de dH2O num balão de 50 mL. Esterilize por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm. Alíquota solução nos tubos de microcentrífuga e loja a-20 ° C.</li>
	<li>Prepare-se 3% w/v trypcase soja caldo (TSB) dissolvendo-se 30 g de TSB em 1 L de dH2O em um frasco de 2 L. Alíquota da solução em frascos contendo 25 mL ou 100 mL TSB para ser usado na preparação de Escherichia coli spheroplasts ou b. megaterium protoplastas, , respectivamente. Frascos de autoclave para esterilizar o meio líquido. TSB estéril pode ser armazenado em temperatura ambiente ou em 4 ° C.</li>
	<li>Prepare a solução C (1 M de sacarose, maleato de 0,04 M, 0,04 M MgCl2, pH 6.5) dissolvendo-se sacarose g 34,23 (342.3 g/mol), ácido maleico de 0,46 g (116.07 g/mol) e 0,38 g MgCl2 (95.21 g/mol) em 100 mL de dH2O num balão de 250 mL. Ajuste o pH para 6,5. Esterilizar por filtração através de um filtro de seringa de 25 mm com uma membrana de 0,2 µm e armazenar em um tubo cônico em temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepare 200 mL de meio de protoplastos misturando 100 mL 3% w/v TSB e 100 mL solução C em um frasco de vidro de 1 L. Autoclave para esterilizar a solução e armazenar à temperatura ambiente.</li>
</ol>2. preparação da cultura durante a noite
Nota: Execute seções 2-4 usando técnicas estéreis adequadas. Se desejado, uma estirpe bacteriana pode conter um plasmídeo para resistência a antibióticos reduzir o potencial de contaminação. Se usando uma tensão com a resistência aos antibióticos, adicione os antibióticos necessários em passos 2.1, 3.1, 3.2 e 4.1 – 4.4.
<ol><li>Prepare uma cultura durante a noite, escolher uma única colônia de bactérias, usando a ponta da pipeta estéril e colocando-o em um tubo de cultura de 14 mL contendo 2-3 mL de 3% w/v TSB. Incube a 37 ° C, agitando para 16 – 21 h.</li>
</ol>3. preparação de bactérias Gram-negativas Escherichia coli Spheroplasts
<ol><li>Em um balão de 250 mL, diluir a 1: 100 cultura durante a noite em volume de 25 mL de 3% w/v TSB e incubar a solução bacteriana a 37 ° C, agitando-se por cerca de 2,5 h até que a solução alcançou uma densidade óptica de 0,5-0,8 em 600 nm. Medir a densidade óptica usando um espectrofotômetro.</li>
	<li>Em um balão de 250 mL, diluir esta cultura 01:10 em 30 mL de 3% w/v TSB e incubar a 37 ° C, agitando para 2,5 h na presença de cefalexina de 60 µ g/mL (347.4 g/mol) para produzir filamentos unicelulares de cerca 50 – 150 µm de comprimento , que são observáveis sob magnificação de X 1.000 usando um microscópio de luz (figura 1B).</li>
	<li>Recolher os filamentos por centrifugação a solução bacteriana a 1.500 x g, 4 ° C por 4 min. decantar e descartar o sobrenadante, reservando-se o pellet.</li>
	<li>Lave os filamentos, suavemente, adicionando 1 mL de 0,8 M de sacarose, tomando cuidado para não perturbar a pelota. Incubar durante 1 min e em seguida, descartar o sobrenadante sem perturbar o sedimento.</li>
	<li>Adicionar 150 µ l de 1 M Tris-Cl (pH 7,8), 120 µ l de lisozima de 5 mg/mL, 30 µ l de 5mg/mL DNase I e 120 µ l de 0,125 M EDTA em seus respectivos a fim da pelota e incubar a solução à temperatura ambiente por 10 min.</li>
	<li>Adicione 1 mL da solução A gradualmente mais 1 min a solução preparada no 3.5 usando uma micropipeta, enquanto suavemente agitando a solução à mão. Incube a solução para 4 min à temperatura ambiente.</li>
	<li>7 mL de solução de 4 ° C B colocar dois tubos cônico de 15 mL. Adicione quantidades iguais de solução preparada no 3.6 a cada um destes dois tubos. Centrifugue a solução a 1.500 x g, 4 ° C por 4 min.</li>
	<li>Usando uma pipeta sorológica, cuidadosamente remova todos, mas 1–2 mL do sobrenadante sem perturbar o sedimento. Resuspenda o pellet pipetando delicadamente acima e para baixo usando uma micropipeta P1000. Verifique visualmente para ver a formação de spheroplasts, observando a amostra na ampliação de X 1.000 usando um microscópio de luz (Figura 1).</li>
	<li>Armazene os spheroplasts a-20 ° C por até uma semana ou até que eles passaram por 3 ciclos de congelamento e descongelamento.</li>
</ol>4. preparação de protoplastas de Gram-positivas b. megaterium
<ol><li>Em um balão de 250 mL, diluir o 1:1,000 durante a noite de cultura em 100 mL de 3% w/v TSB e incubar a solução bacteriana a 37 ° C, agitando para aproximadamente 4.5 h até que a solução alcançou uma densidade óptica de 0,9–1.0 em 600 nm. Medir a densidade óptica usando um espectrofotômetro.</li>
	<li>Despeje a líquido cultura em dois tubos de Erlenmeyer de 50 mL e centrifugar a 2.000 x g, 4 ° C por 10 min.</li>
	<li>Usando uma pipeta sorológica, desprezar o sobrenadante de ambos os tubos cónicos. Cada Ressuspender em 2,5 mL de meio de protoplastos e combinar as ressuspensa soluções em um único tubo cónico. Adicionar a solução de ressuspensa combinada em um balão de 125 mL.</li>
	<li>Adicionar 1 mL de lisozima de 5 mg/mL e incubar durante 1 h a 37 ° C, agitando.</li>
	<li>Monitore o crescimento dos protoplastas sob a ampliação de x 1.000 usando um microscópio de luz, anotando quaisquer irregularidades, tais como bactérias que aparecem como varetas inchadas em vez de esferas (Figura 2). Usando uma pipeta sorológica, transferi a solução para um tubo cônico de 15 mL e centrifugar a 2.000 x g, 4 ° C por 10 min.</li>
	<li>Decante o sobrenadante e ressuspender o sedimento em mídia de protoplastos de 5 mL. Loja protoplastas a-20 ° C por até uma semana ou até que eles passaram por 3 ciclos de congelamento e descongelamento.</li>
</ol>5. preparação da solução de peptídeo e tintura de membrana para a imagem latente
<ol><li>
Solução de peptídeo
	<ol>
<li>Em um tubo de microcentrífuga envolvido em papel alumínio, dissolva 2 mg de FITC rotulado P11A BF2 em 800 µ l dH2O. uso um peptídeo contendo pelo menos um resíduo de triptofano a fim de realizar medições de concentração de proteína.</li>
		<li>Espectrofotometria, medir a absorvância da solução de peptídeo em 280 nm em triplicado. Calcule a concentração de peptídeo usando o coeficiente de extinção molar para triptofano (5.700/Mcm).</li>
		<li>Dilua a concentração de peptídeo em dH2O a uma concentração final de 100 – 200 µM. armazene-o em um tubo de microcentrífuga a-20 ° C, envolto em papel alumínio para proteger da luz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tintura de membrana
	<ol>
<li>Em um tubo de microcentrífuga, prepare um estoque de 10 mM de di-8-ANEPPS (592.9 g/mol) dissolvendo-se 5 mg de di-8-ANEPPS em 843.3 µ l de DMSO. Armazenar a 4 ° C, envolto em papel alumínio para proteger da luz.</li>
		<li>Em um tubo de microcentrífuga, prepare-se 1 mL de 0,03 mM di-8-ANEPPS adicionando 3 µ l de 10mm di-8-ANEPPS de 997 µ l DMSO. Armazenar em um tubo de microcentrífuga a 4 ° C, envolto em papel alumínio para proteger da luz.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. visualização de Escherichia coli Spheroplasts e b. megaterium protoplastas usando microscopia Confocal
<ol><li>Pipete 5 µ l de spheroplasts ou protoplastas numa lâmina de vidro revestido de poli-L-lisina. Adicionar 2 µ l de FITC rotulado AMP (100-200 µM) para o slide e incubar durante 3 min, protegido da luz.</li>
	<li>Adicionar 1 µ l da membrana tintura di-8-ANEPPS (0,03 mM) para o slide e incubar durante 3 min, protegido da luz. Cobrir com uma lamela de vidro e lacre com o esmalte.</li>
	<li>Ligue o laser confocal de microscópio e argônio. Ajuste o laser de argônio de potência de saída de 20% e 20% de transmissão.</li>
	<li>Defina intervalos de comprimento de onda de emissão de 499-532 nm e 745 – 670 nm para o canal de emissão do peptídeo FITC-etiquetadas e canal de emissão de tintura di-8-ANEPPS-rotulado de membrana, respectivamente.</li>
	<li>Protoplastas de imagem ou spheroplasts (Figura 1 e Figura 2) com um objetivo X 63. Use o software de imagem para obter 8 bits, imagens de 512 x 512 composto z-pilha composta de 0,5 µm fatias da totalidade dos protoplastos ou do spheroplast. Nota: Levar consideração cuidadosa para reduzir a emissão de infiltração enquanto imagem spheroplasts e protoplastas. Consulte a discussão para mais detalhes.</li>
</ol>7. Caracterização da localização da AMP
<ol><li>Abra a imagem do composto z-pilha em software de imagem. Localize a centro mais fatia do spheroplast ou protoplastos e coloque uma região circular de interesse (ROI) (0,3 µm de diâmetro) sobre a membrana (ROI 1), um no centro do spheroplast ou protoplastos (ROI 2) e um longe do spheroplast ou protoplastos para medir a fluorescência de fundo (ROI 3) (Figura 5). Evite a inclusão de pixels saturados. A intensidade de fluorescência em cada ROI pode ser calculada pelo software de imagem. Nota: Em casos quando não localizar o peptídeo para a totalidade da membrana, desenhe 1 ROI em uma área da membrana onde o peptídeo é localizado.</li>
	<li>Use a seguinte equação para determinar a relação de intensidade de fluorescência do peptide intracelular a intensidade de fluorescência de peptídeo de membrana: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57904/57904eq1.jpg"> Nota: A intensidade de fluorescência em ROI 3 é subtraída de intensidades de fluorescência no ROI 2 e 1 de ROI para dar conta da fluorescência do fundo.</li>
</ol>

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<li>Sun, Y., Sun, T. L., Huang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patch+clamp+electrophysiology+for+the+study+of+bacterial+ion+channels+in+giant+spheroplasts+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Patch clamp electrophysiology for the study of bacterial ion channels in giant spheroplasts of E. coli.</a> Biophys J. 111 (1), 132-139 (2016).</li>
<li>Xie, Y., Fleming, E., Chen, J. L., Elmore, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+proline+position+on+the+antimicrobial+mechanism+of+buforin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Effect of proline position on the antimicrobial mechanism of buforin II.</a> Peptides. 32 (4), 677-682 (2011).</li>
<li>Kobayashi, S., Takeshima, K., Park, C. B., Kim, S. C., Matsuzaki, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interactions+of+the+Novel+Antimicrobial+Peptide+Buforin+2+with+Lipid+Bilayers%3A+Proline+as+a+Translocation+Promoting+Factor%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">Interactions of the Novel Antimicrobial Peptide Buforin 2 with Lipid Bilayers: Proline as a Translocation Promoting Factor.</a> Biochem. 39 (29), 8648-8654 (2000).</li>
<li>Decad, G. M., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outer+Membrane+of+Gram-Negative+Bacteria+XII.+Molecular-Sieving+Function+of+Cell+Wall%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Outer Membrane of Gram-Negative Bacteria XII. Molecular-Sieving Function of Cell Wall.</a> J. Bacteriol. 128 (1), 325-336 (1976).</li>
<li>Choi, H., Yang, Z., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell%2C+real-time+detection+of+oxidative+stress+induced+in+Escherichia+coli+by+the+antimicrobial+peptide+CM15%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-cell, real-time detection of oxidative stress induced in Escherichia coli by the antimicrobial peptide CM15.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (3), E303-E310 (2015).</li>
<li>Yang, Z., Choi, H., Weisshaar, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melittin-Induced+Permeabilization%2C+Re-sealing%2C+and+Re-permeabilization+of+E.+coli+Membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Melittin-Induced Permeabilization, Re-sealing, and Re-permeabilization of E. coli Membranes.</a> Biophys J. 114 (2), 368-379 (2018).</li>
<li>Ruthe, H. J., Adler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fusion+of+bacterial+spheroplasts+by+electric+fields%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Fusion of bacterial spheroplasts by electric fields.</a> Biochim. Biophys. Acta. 819 (1), (1985).</li>
</ol>

Não há conflitos de interesse são declarados.

Os protocolos aqui apresentados torná-lo viável para os investigadores mais rapidamente obter maiores tamanhos de amostra de imagens bacterianas porque as bactérias alargadas, esféricas são mais fáceis de localizar, orientar e da imagem. Melhorada a capacidade de coletar dados é valiosa em vários aspectos. Em primeiro lugar, permite uma análise quantitativa mais sistemática dos padrões de localização de peptídeo. Enquanto tendências qualitativas podem ser demonstradas de pequenos conjuntos de imagens, apenas um conjunto ...

Peptídeos antimicrobianos (AMPs) ganharam atenção devido ao seu potencial uso como alternativas para os antibióticos convencionais1,2,3,4,5. Amplificadores de matam as bactérias, ou se através da membrana celular e interagindo com componentes intracelulares, como os ácidos nucleicos ou por permeabilizing da membrana, causando vazamento de célula conteúdo6. Além de sua utilização como antibióticos, se AMPs pode ser adaptado para aplicações de entrega de drogas porque interrupções podem atravessar a membrana impermeável7,8. Nós, portanto, procurar compreender mecanismos fundamentais de AMP de ação para estabelecer as bases para a sua utilização em design de drogas.
Microscopia confocal oferece uma forma de avaliar os padrões de localização de AMPs fluorescente etiquetadas em células bacterianas, fornecendo insights sobre seu mecanismo de ação9,10,11,12, 13 , 14. através da marcação da membrana da bactéria, um pode determinar se um peptídeo fluorescente etiquetado localiza a membrana ou espaço intracelular de uma célula bacteriana. No entanto, esta técnica é limitada pelo pequeno tamanho e haste forma de bactérias, que pode tornar a imagem desafiadora devido os limites de resolução dos microscópios de luz convencionais e a variável orientação das bactérias no slide15.
O objetivo do método apresentado é permitir melhorar a visualização dos padrões fluorescente etiquetadas peptídeo localização utilizando microscopia confocal. Visualização é reforçada pelo pequeno, magro, em forma de haste Gram-negativas Escherichia coli (e. coli) ligando e desligando o Gram-positiva Bacillus megaterium (b. megaterium) bactérias em formas esféricas, alargadas referido como SPHEROPLASTS (por cepas de bactérias Gram-negativas) e protoplastas (para cepas Gram-positivas)16,17,18,19,20,21. SPHEROPLASTS e protoplastas são mais fáceis de imagem devido à sua forma simétrica, o que torna a orientação de uma bactéria em um slide, irrelevante para a sua imagem e seu tamanho aumentado. Além disso, apresentamos uma abordagem sistemática para analisar quantitativamente dados de microscopia confocal para caracterizar AMPs como qualquer membrana localizando ou se. Aplicar esses métodos torna mais fácil distinguir fluorescente etiquetado padrões de localização de peptídeo. Os protocolos aqui apresentados podem ser usados para avaliar a localização de uma variedade de agentes de membrana-ativo diferente de AMPs, incluindo peptídeos penetra no celular.
Uma vantagem desta técnica é que ele fornece insights sobre o mecanismo de ação dos amplificadores em um nível de célula única, que pode revelar a heterogeneidade de célula para célula15, ao contrário de outros ensaios de fluorescência comumente usado para identificar o mecanismos de ação dos amplificadores, que fornecem apenas em massa estimativas9,22,23,24,25. O uso de spheroplasts e protoplastas para avaliar a entrada de celular AMP é especial útil26 porque eles são fisiologicamente mais relevantes15 do que outros modelos utilizados para avaliar a entrada da pilha, tais como de vesículas lipídicas24.

<table><tbody><tr><td>Trizma hidroclorito (Tris HCl)</td> <td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base (Tris OH)</td> <td>Sigma</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de magnésio</td><td>Sigma</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Sacarose</td><td>Sigma</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Sigma</td><td>L6876</td><td></td></tr><tr><td>Desoxirribonuclease I</td><td>Sigma</td><td>D4527</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético</td><td>Sigma</td><td>106361</td><td>Usado Sigma 106361 no desenvolvimento do protocolo original; 106361 descontinuado com ED2SS como substituto</td></tr><tr><td>Hidrato de cefalexina</td><td>Sigma</td><td>C4895</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760</td><td></td></tr><tr><td>BBL Caldo de soja tripticase</td><td>Fisher Scientific</td><td>B11768</td><td></td></tr><tr><td>BF2 P11A</td><td>FITC NeoScientific</td><td></td> Di-8-ANEPPS Biotium 61012 DMSO Sigma 34869 Usado <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> Sigma D8779 no desenvolvimento do protocolo original;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> D8779 descontinuado com 34869 como substituição</td></tr><tr><td>Ácido maleico</td><td>Sigma</td><td>M0375</td><td></td></tr><tr><td>Acrodisc 25 mm Filtro de Seringa com 0.2 &mu; m HT Tuffryn Membrane</td><td>Pall Corporation</td><td>4192</td><td></td></tr><tr><td>Microscópio confocal de varredura a laser</td><td>Leica Microsystems</td><td>TCS SP5 II</td><td>para aquisição de imagens</td></tr><tr><td>Leica Application Suite, Fluorescência Avançada</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td>Para processamento de imagens</td></tr></tbody></table>

produção e visualização de spheroplasts bacterianas e protoplastas para caracterizar a localização de peptídeo antimicrobiano

Production and Visualization of Bacterial Spheroplasts and Protoplasts to Characterize Antimicrobial Peptide Localization

O uso da microscopia confocal como um método para avaliar padrões de localização de peptídeo dentro bactérias comumente é inibido nos limites de resolução de microscópios de luz convencionais. Como a resolução de um microscópio de determinado não pode ser facilmente reforçada, apresentamos os protocolos para transformar a pequena bacilares Gram-negativas Escherichia coli (e. coli) e Gram-positiva Bacillus megaterium (b. megaterium) em formas esféricas maiores, facilmente imagens chamado spheroplasts ou protoplastas. Esta transformação permite que os observadores rapidamente e claramente determinar se peptídeos apresentar-se na membrana bacteriana (ou seja, localização de membrana) ou atravessam a membrana para entrar na célula (ou seja, se). Com esta abordagem, também apresentamos um método sistemático de caracterização de peptídeos como membrana localizando ou se. Enquanto este método pode ser usado para uma variedade de peptídeos de membrana-ativo e cepas bacterianas, demonstramos a utilidade do presente protocolo, observando a interação de Buforin II P11A (BF2 P11A), um peptídeo antimicrobiano (AMP), com e. coli SPHEROPLASTS e b. megaterium protoplastas.

Ampliando as bactérias e tornando-os esféricos, podemos facilmente distinguir peptídeos localizar à membrana bacteriana ou translocar prontamente através da membrana bacteriana. Os limites de resolução dos microscópios de luz convencionais torná-lo desafiador para distinguir se o peptídeo sinais surgem da membrana ou espaço intracelular de bactérias normais porque sinais localizados na membrana aparecerá para coincidir com o espaço intracelular (Figura 3A). E...

Aqui nós apresentamos um protocolo para produzir Gram-negativas Escherichia coli (e. coli) spheroplasts e Gram-positiva Bacillus megaterium (b. megaterium) protoplastas claramente Visualizar e caracterizar rapidamente interações de peptídeo-bactérias. Isso fornece um método sistemático para definir membrana localizando e se peptídeos.

Produção e visualização de Spheroplasts bacterianas e protoplastas para caracterizar a localização de peptídeo antimicrobiano

The use of confocal microscopy as a method to assess peptide localization patterns within bacteria is commonly inhibited by the resolution limits of ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo de peptídeos antimicrobianos sobre se os peptídeos se localizam ou se translocam através da membrana celular. O uso de esferoplastos e protoplastos permite a visualização e análise da localização de peptídeos em um sistema modelo fisiologicamente relevante sem os desafios de resolução encontrados com imagens de células bacterianas. Embora esse método possa fornecer informações sobre peptídeos antimicrobianos, ele também pode ser aplicado a outros agentes ativos de membrana, como peptídeos que penetram nas células.Os esferoplastos de E.coli Gram-negativos e o protoplasto de B.megaterium Gram-positivo devem ser preparados em uma cabine de segurança biológica ou capela de fluxo laminar usando a técnica estéril apropriada. Se desejado, as cepas bacterianas podem conter um plasmídeo resistente a antibióticos, e esferoplastos e protoplastos podem ser preparados em uma bancada de laboratório aberta. Neste vídeo, esferoplastos e protoplastos são preparados em uma bancada de laboratório aberta usando cepas bacterianas resistentes a antibióticos.Para configurar uma cultura durante a noite, use uma ponta de micropipeta estéril par

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Os métodos para a purificação do colesterol de ligação da toxina a partir de estreptolisina O...

Visualização das respostas toxina bacteriana induzida por microscopia de fluorescência de células vivas

Fonte: Figueroa, D. M., et.al. Produção e visualização de esferoplastos e protoplastos bacterianos para caracterizar a localização de peptídeos antimicrobianos. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra a produção de esferoplastos de Escherichia coli inibindo primeiro a divisão celular para induzir a filamentação, seguida pela digestão enzimática da parede celular. O processo inclui a adição controlada de um agente quelante, DNase, e um estabilizador osmótico para garantir a formação e...

Preparação de E. coli Spheroplasts

Fonte: Figueroa, D. M., et al. Produção e visualização de esferoplastos e protoplastos bacterianos para caracterizar a localização de peptídeos antimicrobianos. J. Vis. Exp. (2018)Este vídeo demonstra um procedimento passo a passo para gerar protoplastos a partir da bactéria Gram-positiva Bacillus megaterium.

Geração de protoplastos a partir da bactéria Gram-positiva Bacillus megaterium

Fonte: Bratton, B. P., et al., Imagem tridimensional de células bacterianas para representações celulares precisas e localização precisa de proteínas. J. Vis. Exp. (2019)Este vídeo demonstra o método para adquirir e analisar imagens de fluorescência tridimensionais de células bacterianas para estudar a organização das proteínas no nível de célula única.

Visualizando a distribuição de proteínas bacterianas em três dimensões por meio de imagem por fluorescência

Fonte: Figueroa, D. et al. Produção e visualização de esferoplastos e protoplastos bacterianos para caracterizar a localização de peptídeos antimicrobianos. J. Vis. Exp. (2018).Este vídeo demonstra a preparação de esferoplastos a partir de bactérias gram-negativas em forma de bastonete. Bactérias são cultivadas na presença de um antibiótico para formar filamentos alongados. Esses são lavados com uma solução hipertônica e tratados com um tampão de lise para remover a parede celular externa. O...

Geração de Esferoplastos a partir de Bactérias Gram-Negativas

O protocolo apresenta o Escherichia coli-baseado pressão seletiva incorporação de aminoácidos não-canônicos (ncAAs) a lactococcal peptídeo antimicrobiano nisina. Suas propriedades podem ser alteradas durante a expressão recombinantes através de substituição com ncAAs desejado em meios de crescimento definido. As alterações resultantes na Bioatividade são mapeadas por ensaios de inibição de crescimento e de microscopia de fluorescência.

Peptídeos antimicrobianos produzidos pela incorporação de pressão seletiva de aminoácidos não-canônicos

Abordagens de baseados em proteína fluorescentes para monitorar efetores secretadas pelas bactérias em células hospedeiras são desafiadores. Isto é devido à incompatibilidade entre proteínas fluorescentes e o sistema de secreção do tipo III. Aqui, é utilizado um sistema GFP de superfolder de separação otimizada para visualização de efetores secretada pelas bactérias para a célula da planta hospedeira.

Sistema de proteína verde fluorescente Split Visualizar efetores entregue de bactérias durante a infecção

Antibióticos fluorescentes são ferramentas poderosas que podem ser usadas para estudar múltiplos aspectos da resistência antimicrobiana. Este artigo descreve a preparação de antibióticos fluorescentes e sua aplicação para estudar a resistência a antibióticos em bactérias. As sondas podem ser usadas para estudar mecanismos de resistência bacteriana (por exemplo, efflux) por espectrofotometria, citometria de fluxo e microscopia.

Visualização da resistência bacteriana usando sondas de antibióticos fluorescentes

O presente protocolo descreve um método detalhado para a produção bacteriana de proteínas recombinantes, incluindo proteínas tipicamente insolúveis ou contendo ligação dissulfeto, embaladas dentro de vesículas ligadas à membrana extracelular. Isso tem potencial para ser aplicado a áreas versáteis da pesquisa científica, incluindo biotecnologia aplicada e medicina.

Produção e análise otimizadas de vesículas cheias de proteína recombinante de E. coli

Aqui, descrevemos um procedimento que permite a detecção de bactérias patogênicas em todo o órgão durante a infecção e a quantificação das atividades do repórter fluorescente.

Tomografia tridimensional de órgãos inteiros de alta resolução de infecções microbianas

Este protocolo descreve um método para produzir e avaliar a atividade antimicrobiana e a citotoxicidade do peptídeo catiônico Mel4 e do mímico de peptídeos RK758. Ao integrar síntese química, expressão recombinante e ensaios funcionais padronizados, proporciona um fluxo de trabalho simplificado para a produção e teste de peptídeos e imitadores de pequenas moléculas.

Produção e Testes de Peptídeos Antimicrobianos e Seus Mimics

Aprenda a produzir esferoplastos de Escherichia coli e protoplastos de Bacillus megaterium para visualizar a localização de peptídeos antimicrobianos. Este método permite caracterizar interações peptídeo-bactéria em sistemas modelos fisiologicamente relevantes.

Produção e visualização de Spheroplasts bacterianas e protoplastas para caracterizar a localização de peptídeo antimicrobiano

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