Name: Tecido-específica miRNA Expression Profiling Mouse coração seções usando em hibridação in Situ (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Aprenda a detectar miRNAs e proteínas simultaneamente em seções de tecido cardíaco de camundongo usando hibridização in situ combinada com imunocoloração. Este método avança a pesquisa em microRNAs.

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Gostaríamos de agradecer Athanasios Papangelis, comentários críticos sobre o manuscrito. FM é apoiado pela biotecnologia e Conselho de pesquisa de ciências biológicas (BBSRC; BB/M009424/1). IP é suportado pela Associação coração americano cientista desenvolvimento Grant (17SDG33060002).

As amostras de tecido do coração de rato para este estudo foram obtidas em conformidade com a legislação e as normas institucionais e foram aprovadas pelo Comitê de uso e Yale University institucional Cuidado Animal.
1. preparação da solução
<ol><li>Preparar O RNase livre ddH2, tratando de 5 L de DDQ2O com 5 mL de diethylpyrocarbonate de 0,1% (DEPC) durante a noite (O/N), à temperatura ambiente (RT). Autoclave (121 ° C) para desactivar o DEPC. Uso tratada com DEPC ddH2O para a preparação de soluções a jusante como indicado. Cuidado: DEPC é um conhecido agente cancerígeno, lidar com na coifa.</li>
	<li>Prepare a solução de fosfato tamponado salino (PBS) 1 x dissolvendo-se 5 comprimidos de PBS em 1 L de DDQ tratada com DEPC2O. Autoclave (121 ° C).</li>
	<li>Prepare-se diluindo-se 1 mL de detergente não-iônico por 1 L de 1X PBS 0,1% detergente não-iônico/PBS (PBST).</li>
	<li>Prepare-se 90%, 70%, 50% e 30% de etanol em ddH tratada com DEPC2O.</li>
	<li>Preparar um 10 mg/mL solução de Proteinase K (ProK) em ddH tratada com DEPC2O. alíquota e armazenar a-20 ° C. Prepare uma solução de trabalho μg/mL 20 de ProK por diluição 100 μL da solução-mãe ProK em 50 mL de DDQ tratada com DEPC2O. Make fresco antes da utilização.</li>
	<li>Prepare paraformaldeído 4% (PFA), adicionar 2 g de PFA em 50 mL de 1X PBS. Aqueça a 65 ° C, agitando ocasionalmente, até dissolver. Alíquota e loja a-20 ° C. Cuidado: PFA é um conhecido agente cancerígeno, lidar com na coifa.</li>
	<li>Prepare uma solução de NaCl de 3M, acrescentando 87,8 g para 500 mL de DDQ2O. Autoclave (121 ° C).</li>
	<li>Prepare uma solução de2 1 M MgCl adicionando 20,3 g para 100 mL de DDQ2O. Autoclave (121 ° C).</li>
	<li>Preparar 1 M Tris pH 8.0 por dissolução g 121,1 em 800 mL de DDQ2O. ajustar o pH para 8,0 com algumas gotas de 1 N HCl, trazer o volume de 1 L e autoclave (121 ° C). Preparar uma solução de trabalho de 50 mM Tris pH 8.0 diluindo 2,5 mL de 1 M Tris pH 8.0 em 47,5 mL de DDQ2O.</li>
	<li>Preparar 1 M Tris pH 9,5 por dissolução 60,6 g em 400 mL de DDQ2O. ajustar o pH a 9,5 com algumas gotas de 1 N HCl, trazer o volume para 500 mL e autoclave (121 ° C).</li>
	<li>Prepare a 0,13 M 1-Methylimidazole pH 8.0 por diluição 1,6 mL de 1-Methylimidazole a 130 mL de DDQ tratada com DEPC2O. ajustar o pH para 8,0 com aproximadamente 450 µ l de 12 N HCl. Adicionar 16 mL de 3 M NaCl e traga o volume de 160 mL. Fazer fresco antes da utilização. Atenção: 1-Methylimidazole é prejudicial à pele, olhos e mucosas, lidar com na coifa.</li>
	<li>Prepare 0,16 M N cloridrato de-(3-Dimethylaminopropyl)-n-ethylcarbodiimide (EDC), diluindo µ l 176 de EDC a 10 mL de 0,13 M 1-Methylimidazole. Ajuste o pH para 8,0 com aproximadamente 100 µ l de 12 fresco N HCl. faça antes do uso. Atenção: EDC é prejudicial à pele, olhos e mucosas, lidar com na coifa.</li>
	<li>Prepare-se 1% H2O2 diluindo-se 1,5 mL de 30% H2O2 em 50 mL de 1X PBS. Fazer fresco antes da utilização.</li>
	<li>
Preparar 20 x SSC pH 7.0 dissolvendo 175,3 g de NaCl e 88,2 g de citrato de sódio (Na3C6H5O7) em 800 mL de DDQ2O. ajustar o pH a 7,0 com algumas gotas de 1 N HCl, trazer o volume de 1 L e autoclave (121 ° C).
	<ol>
<li>Preparar uma solução de trabalho de 2 x SSC pH 7.0 diluindo 20ml de 20 x SSC pH 7.0 em 180 mL de DDQ2O.</li>
		<li>Preparar uma solução de trabalho de 1 x SSC pH 7.0 diluindo 2,5 mL de x SSC pH 7.0 em 47,5 20ml de DDQ2O.</li>
		<li>Preparar uma solução de trabalho de 0,2 x SSC pH 7.0 diluindo-se 5 mL de 2 x SSC pH 7.0 em 45 mL de DDQ2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare 1 x solução de hibridação diluindo-se 0,5 mL de tampão ISH x microRNA 2 em 0,5 mL de DDQ tratada com DEPC2O. Make fresco antes de usar.</li>
	<li>Preparar a solução stock de 200 mM de Levamisole adicionando 250mg 5ml de DDQ2O. alíquota e armazenar a-20 ° C.</li>
	<li>Prepare solução de bloqueio para a etapa 5 (10% ovelha serum/1% BSA/0.2 mM Levamisol) diluir 1 mL de soro de carneiro em 9 mL PBST, e adicionando 0,1 g de BSA. Adicione 10 μL de Levamisole antes de usar. Fazer fresco antes da utilização.</li>
	<li>Prepare solução de bloqueio para a etapa 6 (10% cabra serum/1% BSA) diluir 1 mL de soro de cabra em 9 mL de PBST, e adicionando 0,1 g de BSA. Armazenar a 4 ° C e usar dentro de uma semana.</li>
	<li>Preparar prestaining solução diluindo 3,3 mL de 3 M NaCl, 5 mL de 1 M MgCl2, 10 mL de 1 M Tris pH 9,5, 100 µ l de Tween-20, 100 µ l de Levamisole em 81,5 mL de DDQ2O. Make fresco antes de usar.</li>
	<li>Use Tetrazolium tetrazólio (tabletes de fosfato (BCIP) NBT)/5-bromo-4-chloro-3-indoly para preparar 20 mL de solução de substrato de fosfatase alcalina (AP) de acordo com as instruções do fabricante. Adicione 20 μL de Levamisole. Fazer fresco antes de usar e proteger da luz.</li>
	<li>Prepare a solução KTBT adicionando 4G de Tris, 4,4 g de NaCl e 375 mg de KCl em 500 mL de DDQ2O. Autoclave (121 ° C).</li>
	<li>Opcional: Prepare uma solução de trabalho de DAPI (1 μg/mL) por diluição 50 μL de solução estoque DAPI (1 mg/mL) em 50 mL de 1X PBS. Nota: Soluções padrão como 3 M NaCl, 1m MgCl2, 1 M Tris-HCl, livre de nuclease ddH2O, 1X PBS e 20 x SSC pode ser comprado como alternativa. Para este protocolo, frascos de Coplin de vidro de 50 mL ou mailer de polipropileno slide 20 mL frascos têm sido utilizados.</li>
</ol>2. preparação do tecido
Nota: As seções de coração de rato usadas aqui foram elaboradas pelos serviços de tecido de patologia Yale, do tecido Formalin-fixos/parafina, cortadas em 5 μm e posicionadas em slides carregados.
<ol><li>
Hidratação do tecido.
	<ol>
<li>Aquecer os slides a 60 ° C durante 10 minutos, no forno da hibridação até parafina visivelmente está derretendo.</li>
		<li>Incubar os slides em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de despachante comercialmente disponíveis (ver Tabela de materiais) por 10 min, duas vezes.</li>
		<li>Incube os slides em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de etanol a 100% por 2 min, duas vezes, seguido por etanol 90% por 2 min, etanol a 70% por 2 min, duas vezes, etanol a 50% por 2 min e 30% de etanol por 2 min.</li>
		<li>Incube os slides em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de DDQ tratada com DEPC2O por 5 min.</li>
		<li>Incube os slides em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 1X PBS por 5 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Tecido de-proteinating.
	<ol>
<li>Incube em jarra de Coplin um vidro contendo 50 mL de solução de trabalho de ProK, a 37 ° C por 15 min no forno da hibridação de 20 μg/mL. Atenção: Sob digestão pode resultar em pobres ou sem desenvolvimento de sinal, enquanto a digestão excessiva pode resultar em degradação do tecido e o desenvolvimento de coloração de fundo. Otimização pode ser exigida para esta etapa (1-20 μg/mL ProK, incubação de 5 a 20 min, RT-37 ° C).</li>
		<li>Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 1X PBS durante 5 min, à RT, duas vezes.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Fixação de tecidos.
	<ol>
<li>Use uma caneta hidrofóbica para desenhar um círculo repelente de água ao redor do tecido em cada slide.</li>
		<li>Aplicar 500 µ l de solução PFA de 4% para o comprimento de cada slide e incubar-se horizontalmente para 10 min, a RT</li>
		<li>Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 1X PBS durante 5 min, à RT, duas vezes.</li>
		<li>Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 0,13 M 1-methylimidazole por 10 min, em RT, duas vezes.</li>
		<li>Aplicar 500 µ l de solução EDC de 0,16 M para o comprimento de cada slide e incubar horizontalmente por 1h no RT, numa câmara umidificada.</li>
		<li>Lave os slides em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de pH 8.0 do Tris 50mm no RT</li>
		<li>Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 1X PBS em RT, duas vezes. Nota: Ambos os passos de fixação PFA e EDC são necessários para miRNA reticulação e não devem ser omitidos. 31
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bloqueio da peroxidase endógena.
	<ol>
<li>Incubar em jarra de Coplin um vidro contendo 50 mL de 1% H2O2 por 30 min em RT</li>
		<li>Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 1X PBS em RT, duas vezes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. hibridação
<ol><li>Pré-aquecer a solução de hibridação (500 µ l por slide) a 50 ° C no forno da hibridação, até a temperatura-alvo, é atingido (10-15 min).</li>
	<li>Preparar a câmara de hibridação colocando 2 pedaços de filtro ou papel de tecido na parte inferior da câmara e molhar o papel com 50% formamida/1 x SSC. Cuidado: Formamida é prejudicial para as mucosas, olhos e pele, identificador único na coifa.</li>
	<li>Aplicam-se 200 µ l de solução de hibridização para o comprimento de cada slide. Incube-se horizontalmente para 1 – 3 h a 50 ° C, numa câmara umidificada.</li>
	<li>Prepare a solução de sonda misturando sonda estoque de 0.5 µ l (25 µM) em solução de ofhybridization 250 µ l (concentração final 50 nM), em um tubo de 1,5 mL. Nota: Os miRNAs diferentes são expressos em diferentes níveis, por otimização sobre a concentração de sonda pode ser exigida para esta etapa (1 – 50 nM) não evitar nenhum sinal ou desenvolvimento de fundo elevado.</li>
	<li>Aplicar 250 µ l de solução de sonda para o comprimento de cada slide e coloque uma lamela de RNase livre na parte superior. Evite a formação de bolhas.</li>
	<li>Cuidadosamente, selar a câmara de hibridação com parafilm e incubar O/N a 50 ° C. Nota: A temperatura de hibridização deve ser definida aproximadamente 30 ° C abaixo da temperatura de fusão de RNA (Tm) de cada teste. Otimização pode ser necessária. Aqui, 50 ° C é usado como a hibridação/lavagem temperatura miRNA-182, ajustar conformemente para diferentes sondas.</li>
</ol>4. rigor lavagens
<ol><li>Escaldar a 200 mL de 2 x SSC a 50 ° C no forno da hibridação, até atingir a temperatura de alvo (20 – 40 min).</li>
	<li>Lavar as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 2 x SSC a 50 ° C por 5 min, ou até soltar as lamelas.</li>
	<li>Lavar as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 2 x SSC em RT por 5 min, duas vezes.</li>
	<li>Lavar as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 0.2 x SSC em RT por 5 min.</li>
	<li>Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de PBST em RT por 5 min.</li>
	<li>Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 1X PBS em RT por 5 min. Nota: Uso de condições RNase-livre não é necessário desde os híbridos de RNA-RNA são considerados estáveis.</li>
</ol>5. CAVAR de anticorpos
<ol><li>Use uma caneta hidrofóbica para re-desenhar um círculo repelente de água ao redor do tecido em cada slide, se necessário.</li>
	<li>Aplica 500 µ l de solução para o comprimento de cada slide de bloqueio. Incube-se horizontalmente por 30 min em RT, numa câmara umidificada.</li>
	<li>Prepare a solução de anticorpo de escavação (1:1, 000) por diluição 0,5 μL do anticorpo de escavação na solução de ofblocking 500 µ l em um tubo de 1,5 mL. Cuidado: Otimização pode ser necessária para esta etapa (1: 500 – 1:2, 000).</li>
	<li>Aplica 500 µ l de solução de anticorpo de escavação para o comprimento de cada slide. Incube-se horizontalmente por 1h no RT, numa câmara umidificada.</li>
	<li>Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de PBST em RT por 5 min, três vezes.</li>
	<li>Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de prestaining solução em RT por 5 min, duas vezes.</li>
	<li>Incube em uma jarra de mailer slide polipropileno contendo 20 mL solução de substrato ofAP a 37 ° C, por 6-24 h, protegido da luz. Atenção: Desenvolvimento de cor deve ser verificado que cada 2 h. otimização pode ser necessária para esta etapa.</li>
	<li>Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de solução KTBT a RT por 5 min, duas vezes.</li>
	<li>Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 1X PBS em RT por 5 min.</li>
</ol>6. miocardite de anticorpos
<ol><li>Use uma caneta hidrofóbica para re-desenhar um círculo repelente de água ao redor do tecido em cada slide, se necessário.</li>
	<li>Aplica 500 µ l de solução para o comprimento de cada slide de bloqueio. Incube-se horizontalmente por 1h no RT, numa câmara umidificada.</li>
	<li>Prepare a solução de anticorpo de miocardite (1: 100) por diluição 2 μL do anticorpo de miocardite na solução de ofblocking 200 μL em um tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Aplicam-se 200 µ l de solução de anticorpo miocardite para o comprimento de cada slide. Incubar horizontalmente O/N a 4 ° C, numa câmara umidificada.</li>
	<li>Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 1X PBS em RT por 5 min, três vezes.</li>
	<li>Prepare a solução de anticorpo anti-rabbit-568 (1: 500) por diluição 0,5 μL do anticorpo anti-rabbit-568 na solução de ofblocking 250 μL em um tubo de 1,5 mL.</li>
	<li>Aplica 250 µ l de solução de anticorpo anti-rabbit-568 para o comprimento de cada slide. Incube-se horizontalmente por 1h no RT, numa câmara umidificada.</li>
	<li>Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 1X PBS em RT por 5 min, três vezes.</li>
	<li>Opcional: Aplicar 250 µ l de solução de trabalho de DAPI para o comprimento de cada slide e incubar horizontalmente por 1 min em RT, protegido da luz.</li>
	<li>Lave as lâminas em uma jarra de Coplin de vidro contendo 50 mL de 1X PBS em RT por 5 min, duas vezes.</li>
</ol>7. montagem e imagem
<ol><li>Monte as lâminas com 2 a 3 gotas de meio de montagem e uma lamela de vidro. Permitir que os slides secar liso, O/N, a 4 ° C, protegido da luz.</li>
	<li>Continue a epifluorescente ou microscopia confocal.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

deteção de transcrição de miRNA pode ser conseguida através de técnicas diferentes que variam em sensibilidade, especificidade e poder quantitativa. Aqui, demonstramos o acoplamento de miRNA hibridação in situ com imunocoloração e descrever um protocolo que permite a avaliação simultânea dos níveis de expressão de moléculas miRNA e proteína, sobre as mesmas seções de coração. Nós primeiro mostrar como realizar a hibridação in situ de sondas de miRNA LNA escavar-etiquetadas em seções de coração de parafi...

micro-RNAs (miRNAs) são curtas (18-25 nucleotides), RNAs single-stranded, não codificante que funcionam como reguladores negativos da expressão génica a nível pós-transcricional por inibição da tradução do RNA mensageiro (mRNA) e/ou promover a degradação do mRNA 1. os miRNAs são transcritas de intrões ou exões de codificação ou não-codificante genes e são clivadas no núcleo por DROSHA, que os miRNAs precursor (pre-miRNAs), que são estruturas de Hairpin loop curto de 70 nucleotídeos2. Seguindo citoplasmática de exportação, pré-miRNAs são subsequentemente transformados por DICER em miRNAs maduros que abrangem 18-25 nucleotides3,4. Posteriormente, o complexo silencioso induzido por RNA (RISC) incorpora estes miRNAs como single-stranded RNA, que permite a sua ligação à 3' untranslated região (3'-UTR) dos seus mRNAs alvo para suprimir sua expressão3,5 .
Dentro nas últimas três décadas, desde que eles foram primeiramente identificados, miRNAs surgiram para mestre reguladores da expressão do gene, cujos níveis de expressão são rigidamente controlada6. Funções para os miRNAs têm sido descritas em órgão desenvolvimento7,8,9,10,11,12, manutenção da homeostase13,14 , bem como os contextos de doença que incluem neurológico15,16,17,18,19, cardiovascular20, doenças auto-imunes21 ,22, cancros23,24e outros25. A crescente valorização para a relevância de padrões de expressão de miRNA apresentou a necessidade de métodos de deteção confiável de miRNA transcrições. Tais métodos incluem PCR em tempo Real, microarrays, mancha do Norte, hibridação in situ e outros, que variam de sensibilidade, especificidade e poder quantitativa, predominantemente, devido ao fato de que miRNA transcrições são compostas de curto e sequências homólogas altamente6.
Recentemente, informou um papel importante no desenvolvimento da hipertrofia miocárdica26, uma condição descrevendo a adaptação estrutural do coração em resposta às elevadas exigências hemodinâmica27,28de miRNA-182. Hipertrofia cardíaca é caracterizada pelo aumento da massa miocárdica, que, se associado com remodelação mal-adaptativos29, pode levar a aumento do risco de insuficiência cardíaca, uma condição de contabilização de 8,5% de todas as mortes atribuíveis a cardiovascular doença de30.
Aqui, descrevemos nosso protocolo que combina a hibridação in situ com uma sonda de ácido nucleico de bloqueado (escavação) (LNA) Digoxigenina-etiquetadas e imunocoloração para a detecção simultânea de moléculas miRNA e proteína em cortes de tecido de coração de rato, em nosso modelo de hipertrofia cardíaca.

<table><tbody><tr><td>Dietilpirocarbonato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5758</td><td>DEPC</td></tr><tr><td>Solução salina tamponada com fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td>PBS</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td>surfactante não iônico</td></tr><tr><td>Histoclear</td><td>National Diagnostics</td><td>HS-200</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K, recombinante, PCR Grau</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3115879001</td><td></td></tr><tr><td>ProK Paraformaldeído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>PFA</td></tr><tr><td>Cloreto de Sódio</td><td>ThermoFisher</td><td>S271</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Cloreto de Magnésio Hexahidratado</td><td>ThermoFisher</td><td>M33</td><td>MgCl2</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6066</td><td></td></tr><tr><td>Solução de Ácido Clorídrico, 1 N</td><td>ThermoFisher</td><td>SA48</td><td>HCl</td></tr><tr><td>Solução de ácido clorídrico, 12 N</td><td>ThermoFisher</td><td>S25358</td><td>HCl</td></tr><tr><td>1-metilimidazol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>336092</td><td></td></tr><tr><td>cloridrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N&prime;-etilcarbodiimida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>39391</td><td>EDC</td></tr><tr><td>Solução de peróxido de hidrogênio H2O2</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216763</td><td>H2O2</td></tr><tr><td>Citrato trissódico di-hidratado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1804</td><td>Citrato de sódio</td></tr><tr><td>miRCURY LNA miRNA ISH Buffer Set (FFPE)</td><td>Qiagen</td><td>339450</td><td>scramble miRNA/U6 snRNA</td></tr><tr><td>miRCURY LNA mmu-miR-182 sonda de detecção</td><td>QIagen</td><td>YD00615701</td><td>cloridrato de Levamisol marcado com 5'-DIG e 3'-DIG</td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>31742</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9647</td><td>BSA</td></tr><tr><td>NBT/BCIP Comprimidos</td><td>Sigma</td><td>Aldrich 11697471001</td><td>NBT-BCIP</td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>ThermoFisher</td><td>P217</td><td>KCl</td></tr><tr><td>solução DAPI (1mg/ml)</td><td>ThermoFisher</td><td>62248</td><td>DAPI</td></tr><tr><td>Glass coverbreaker</td><td>ThermoFisher</td><td>12-545E</td><td>Lamínula de vidro</td></tr><tr><td>Lamínula de plástico</td><td>Grace Bio-Labs</td><td>HS40 22mmX40mmX0.25mm</td><td>RNA-ase lamínula de plástico livre</td></tr><tr><td>Anti-Digoxigenina-AP, fragmentos de Fab</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>11093274910 DIG anticorpo</td></tr><tr><td>Caneta de barreira hidrofóbica</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>Papanicolau</td></tr><tr><td>anticorpo anti-cardíaco Troponina T</td><td>Abcam</td><td>ab92546</td><td>anticorpo cTnT</td></tr><tr><td>Anticorpo secundário de absorção cruzada IgG (H+L) anticorpo anti-coelho de cabra, Alexa Fluor 568</td><td>ThermoFisher</td><td>A-11011</td><td>anticorpo anti-coelho-568</td></tr><tr><td>Meio de montagem de fluorescência Dako DAKO</td><td></td><td>S3023</td><td>meio de montagem Soro</td></tr> de <tr><td>ovelha</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S3772</td><td></td></tr><tr><td>Soro de cabra</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>Formamida deionizada</td><td>americana Forno de</td> hibridização <td>AB00600</td><td></td>bioanalítica</tr><tr><td></td><td>ThermoFisher</td><td>UVP HB-1000 Hybridizer</td><td></td></tr></tbody></table>

tecido-específica mirna expression profiling mouse coração seções usando em hibridação in situ

Tissue-specific miRNA Expression Profiling in Mouse Heart Sections Using In Situ Hybridization

micro-RNAs (miRNAs) são transcrições de single-stranded RNA que se ligam ao RNA mensageiro (mRNAs) e inibem a sua tradução ou promovem a sua degradação. Até à data, os miRNAs têm sido implicados em um grande número de processos biológicos e doença, que tem representado a necessidade para os métodos de detecção confiável de miRNA transcrições. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para Digoxigenina-rotulado (escavação) trancado ácido nucleico (LNA) baseada em investigação miRNA deteção, combinada com proteína immunostaining em seções de coração de rato. Primeiro, realizamos uma técnica hibridização em situ utilizando a sonda para identificar miRNA-182 expressão nas seções de coração de controle e os ratos de hipertrofia cardíaca. Em seguida, realizamos imunocoloração para proteína cardíaca de troponina T (miocardite), sobre as mesmas seções, co localizar miRNA-182 com as células de casos. Usando este protocolo, fomos capazes de detectar miRNA-182 através uma fosfatase alcalina baseado ensaio colorimetric e miocardite através de coloração fluorescente. Este protocolo pode ser usado para detectar a expressão de qualquer miRNA de interesse através das sondas LNA escavar-etiquetadas e expressão de proteínas relevantes em cortes de tecido de coração de rato.

hibridação de miRNA in situ foi otimizada em seções de coração de rato usando um scramble miRNA e U6-snRNA, que serviu como controles positivos e negativos, respectivamente. Coloração positiva é indicada em azul, enquanto a coloração negativa é indicada pela falta de desenvolvimento de cor (figura 1A-1B). Casos específico expressão de miRNA-182 foi avaliada em seções de coração de controle e PlGF superexpressão ratos. Os ratos carreg...

micro-RNAs (miRNAs) são sequências de RNA curtas e altamente homólogas, servindo como reguladores pós-transcricional de RNAs mensageiro (mRNAs). Métodos de deteção de miRNA atuais variam em sensibilidade e especificidade. Descreveremos um protocolo que combina a hibridação in situ e imunocoloração para a deteção simultânea de moléculas miRNA e proteína em cortes de tecido de coração de rato.

Tecido-específica miRNA Expression Profiling Mouse coração seções usando em hibridação in Situ

micro-RNAs (miRNAs) are single-stranded RNA transcripts that bind to messenger RNAs (mRNAs) and inhibit their translation or promote their degradation. To ...

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo do microRNA, fornecendo ferramentas para detectar a lcalização relativa de moléculas de proteína e microRNA. A principal vantagem desta técnica é que você pode detectar moléculas de proteína e microRNA da mesma seção tecidual. Este protocolo começa com uma reidratação dos tecidos montados em slides.Aqueça os slides a 60 graus Celsius por 10 minutos no forno de hibridização. A parafina deve estar visivelmente derretendo. Em seguida, incubar os slides em um frasco de vidro Coplin contendo agente de compensação comercialmente disponível por 10 minutos.Faça isso duas vezes. Em seguida, transfira os slides da lavagem para lavar para reidratar os tecidos. Uma vez hidratado, incubar os tecidos na solução de trabalho proteinase K a 37 graus Celsius por 15 minutos.Para remover a proteína K, lave os slides em 1x PBS duas vezes. Agora, conserte os tecidos. Primeiro, faça reservatórios nos slides usando uma caneta hidrofóbica para desenhar um círculo repelente de água em torno dos preparativos.Em seguida, aplique 500 microliters de solução 4%PFA dentro da barreira, e incubar os slides em um capô de fumaça. Para remover o fixador, l

tissue-specific-mirna-expression-profiling-mouse-heart-sections-using

Research

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Genetics

Genética

Aqui, descrevemos uma produção eficiente de...

A High Throughput In situ Método de hibridização para caracterizar padrões de expressão de mRNA no Rato Fetal Trato urogenital inferior

Perfil de expressão única célula permite a análise detalhada de expressão gênica de células individuais. Descrevemos métodos para o isolamento dos cardiomiócitos, e preparar a lisados ​​resultando tanto para microarray transcriptoma todo ou qPCR de metas específicas.

Profiling única célula transcricional dos cardiomiócitos de rato adulto

Este artigo descreve um protocolo de hibridização in situ em otimizado para detecção colorimétrica de expressão de microRNA em seções renais fixados em formalina.

MicroRNA<em&gt; Em situ</em&gt; Hibridização de tecidos de rim fixadas em formalina

Para analisar os perfis de expressão de genes cardíacos durante o desenvolvimento do coração de peixe-zebra, o RNA total foi de ser extraído do coração isolado. Aqui, apresentamos um protocolo para a coleta / corações batendo funcionais por um rápido esvaziamento manual a partir de embriões de peixes-zebra para obter mRNA específico cardíaca.

Em larga escala Zebrafish Embryonic Coração de dissecação para a análise transcricional

Mutações que levam a defeitos cardíacos congênitos se beneficiam da investigação in vivo da estrutura cardíaca durante o desenvolvimento, mas estudos estruturais de alta resolução no coração embrionário de camundongos são tecnicamente desafiadores. Aqui apresentamos um método robusto de imunofluorescência e análise de imagem para avaliar estruturas específicas de cardiomiócitos no coração de camundongo em desenvolvimento.

Análise do Cardiomyocyte Desenvolvimento utilizando imunofluorescência em Embryonic Coração do rato

Aqui apresentamos um protocolo para detectar a expressão de miRNAs em amostras de pacientes com câncer de mama usando hibridização in situ de miRNA.

Análise clínico-patológico de miRNA Expressão em cancro da mama tecidos usando miRNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridização

Localizar a expressão gênica em tipos específicos de células pode ser um desafio devido à falta de anticorpos específicos. Aqui descrevemos um protocolo para detecção tripla simultânea de expressão gênica combinando hibridização in situ de RNA de fluorescência dupla com imunocoloração.

Combinando Duplo Fluorescência<em&gt; In Situ</em&gt; A hibridação com imunomarcação para a detecção da expressão de três genes em secções do cérebro do rato

Aqui nós apresentamos um protocolo para realizar polysome de criação de perfil em coração isolado de rato perfundido. Nós descrevemos os métodos para análise das frações no que diz respeito a mRNAs, miRNAs e o proteome polysome polysome, polysome de criação de perfil e perfusão do coração.

Dinâmica proteómica e miRNA análise de polissomos de coração de rato isolado após Langendorff perfusão

Apresentamos os protocolos para examinar o desenvolvimento de coração de rato usando microscopia epifluorescente de montagem toda em embriões de rato dissecados de ventricular específica MLC-2v-tdTomato repórter bater-em ratos. Este método nos permite visualizar diretamente a cada estágio da formação ventricular durante o desenvolvimento de coração de rato sem métodos histoquímicos trabalho intensivos.

Análise do desenvolvimento de câmara cardíaca durante a embriogênese de rato usando toda montagem de epifluorescência

A oogênese de Drosophila continua a ser excepcionalmente útil no estudo da proliferação e herança mitocondrial. Este manuscrito descreve um protocolo detalhado usado para rotular o DNA mitocondrial replicante (mtDNA) em ovários adultos de Drosophila com 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU), o que facilita a descoberta de mecanismos associados à herança mitocondrial que antes eram discutíveis.

In Situ Rotulagem de replicação de DNA mitocondrial em Drosophila Adulto Ovários por Edu Coloração

Aprenda a detectar miRNAs e proteínas simultaneamente em seções de tecido cardíaco de camundongo usando hibridização in situ combinada com imunocoloração. Este método avança a pesquisa em microRNAs.

Tecido-específica miRNA Expression Profiling Mouse coração seções usando em hibridação in Situ

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