Reversão química de células-tronco pluripotentes humanas convencionais para um estado de ingenuidade com potência melhorada Multilineage diferenciação

O método LIF-3i reverte as células-tronco pluripotentes humanas convencionais em um estado pluripotente mais primitivo com características bioquímicas, transcricionais e epigenéticas do epiblasto humano pré-implantação. Este método melhora a funcionalidade das células-tronco pluripotentes humanas convencionais, diminuindo a expressão gênica orientada para a linhagem e apagando a variabilidade interlinha da diferenciação direcionada comumente observada entre linhas independentes de hPSC. Usando este método, as células-tronco pluripotentes humanas revertidas quimicamente mantêm estabilidade cariotípica e epigenômica após passagem prolongada, incluindo em loci impressos e podem ser diferenciadas diretamente com eficiências aprimoradas sem necessitar de uma etapa de re-priming.

O método LIF-3i abrirá novas avenidas de investigação na biologia do desenvolvimento humano precoce e pode avançar a medicina regenerativa, melhorando a diferenciação de células-tronco pluripotentes humanas, o direcionamento gênico e a geração de quimeras interespécies. Para iniciar o protocolo, mantenha e expanda células-tronco pluripotentes humanas convencionais ou hPSCs com cariótipos normais validados em co-culturas com um fibroblasto embrionário de camundongo ou sistema de cultura alimentadora baseado em MEF ou em um sistema de cultura livre de alimentadora. Prepare os alimentadores MEF em uma placa de seis poços gelatinizada preparada anteriormente pelo menos um dia antes da passagem das culturas hPSC convencionais adaptadas a LIF-5i.

Após as culturas hPSC convencionais atingirem cerca de 50% de confluência, substitua o meio de cultura hESC padrão por dois mililitros por poço de meio de Fator Inibidor de Leucemia 5i ou LIF-5i. Cultive e mantenha as hPSCs convencionais e MEFs por até dois dias em LIF-5i em um incubador de CO2. Troque o meio LIF-5i diariamente para adaptá-los para sua passagem subsequente e reversão estável em LIF-3i.

Para as culturas convencionais livres de alimentadora, cultive hPSC em LIF-5i apenas durante a noite antes da passagem na manhã seguinte. Antes da passagem, lave as hPSC convencionais adaptadas a LIF-5i uma vez com PBS e adicione um mililitro de reagente de dissociação celular a cada poço. Em seguida, incube a placa por cinco minutos a 37 graus Celsius em um incubador de CO2.

Após a incubação, triture suavemente as células com uma pipeta em uma suspensão de células únicas de volta. Colete a suspensão celular no meio hESC em pelo menos uma diluição de duas vezes em um tubo cônico estéril de 15 mililitros e triture suavemente as células por pipetagem para obter uma suspensão de células únicas. Centrifugue as células a 300 g por cinco minutos.

Após a centrifugação, aspire e descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular em um a dois mililitros de meio LIF-5i. Em seguida, conte as células. Lave a placa MEF pré-preparada de seis poços duas vezes com dois mililitros de PBS por poço.

Distribua de uma a duas vezes 10 ao sexto de células em dois mililitros de meio LIF-5i em um poço da placa MEF lavada com PBS. Coloque a placa em um incubador de CO2. No dia seguinte, agite suavemente a placa para levantar todas as células não fixadas e aspire o meio e substitua o meio por dois mililitros de meio LIF-5i.

Repita este passo diariamente por três a cinco dias ou até que as células estejam 60 a 70% confluentes. Este protocolo suporta reversão rápida e em massa semelhante ao estado ingênuo de uma ampla gama de linhas celulares pluripotentes embrionárias e induzidas humanas, desde que as preparações de células-tronco pluripotentes humanas com diferenciação marcada ou cariótipos anormais sejam meticulosamente excluídas. Após a adaptação inicial a LIF-5i, passe as culturas LIF-3i estáveis subsequentes a cada três a quatro dias em um gabinete de biossegurança ou quando as culturas se tornarem 60 a 70% confluentes.

Descarte o meio de cultura e lave cada poço das culturas LIF-5i-LIF-3i adicionando suavemente dois mililitros de PBS. Descarte o PBS e adicione um mililitro de solução de desprendimento celular. Incube as células por cinco minutos a 37 graus Celsius em um incubador de CO2.

Após a incubação, colecione a suspensão celular, adicione meio hESC não tratado em uma diluição de duas vezes e triture suavemente as células por pipetagem para obter uma suspensão de células únicas. Transfira a suspensão para um tubo cônico estéril de 15 mililitros. Centrifugue as células a 300 g por cinco minutos e aspire e descarte o sobrenadante.

Ressuspenda o pellet em meio LIF-3i e, em seguida, conte as células. Em seguida, plaqueie duas vezes 10 ao quinto de células por poço no MEF irradiado na placa de seis poços gelatinizada para o passaging de rotina das culturas LIF-3i. Para as culturas adaptadas inicialmente a LIF-5i, coloque uma densidade inicialmente maior antes da primeira passagem para o MEF LIF-3i.

As linhas celulares de células-tronco pluripotentes humanas individuais devem ser otimizadas e ajustadas para altas densidades de plantio iniciais, se necessário, para manter o passaging em massa contínuo durante os primeiros passagens da cultura de reversão LIF-3i. Re-plate e distribua as hPSC adaptadas a LIF-5i em placas alimentadoras MEF irradiadas frescas lavadas com PBS no meio LIF-3i. Substitua o meio LIF-3i diariamente.

Passe N-hPSC por pelo menos quatro a sete passagens em massa contínuas no meio LIF-3i antes do uso de N-hPSC em estudos funcionais ou criopreservação. Registre o número de passagens de N-hPSC em meios convencionais ou LIF-3i. Tinções imunofluorescentes e western blot detectaram a expressão das isoformas fosforiladas e totais ativadas de STAT3 e Erk1/2, marcadores-chave da pluripotência molecular.

As colorações de hematoxilina e eosina de microssecções de teratoma revelaram uma diferenciação robusta em todas as três camadas germinativas com linhagens de ectoderma, mesoderma e endoderma bem estruturadas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como reverter eficientemente as células-tronco pluripotentes humanas convencionais em massa para um estado semelhante ao ingênuo usando o método químico universal sequencial LIF-5i para LIF-3i. Antes de tentar este protocolo, é importante começar com uma baixa passagem de linhas celulares de células-tronco pluripotentes humanas convencionais que se conformam com cariótipos normais.

As culturas convencionais de células-tronco pluripotentes humanas devem estar principalmente indiferenciadas e conter poucas células espontaneamente diferenciadas antes de começar. A etapa inicial e breve de adaptação a LIF-5i aumenta significativamente a expansão clonal das células-tronco pluripotentes humanas convencionais e permite que elas sejam subsequentemente revertidas para o estado ingênuo com LIF-3i sozinho em quantidades em massa, evitando assim a necessidade de escolher ou subclonar colônias raras de células-tronco pluripotentes humanas ingênuas posteriormente. A otimização adicional deste método químico utilizando inibidor de tankirase em condições de cultura GMP definidas e livres de alimentadora facilitará a geração eficiente e clinicamente útil de uma ampla gama de tipos celulares funcionais e enxertáveis para uso terapêutico.