Name: Na Vivo Photolabeling de células no cólon para avaliar o potencial migratória das células hematopoiéticas em camundongos Neonatais (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 39 s
Description: Aprenda a técnica de fotomarcação in vivo em camundongos neonatais para rastrear células imunes do cólon até sítios extra-intestinais. Este método auxilia pesquisadores a estudar interações hospedeiro-microbioma na vida precoce.

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Nitya Junior foi apoiado por um prêmio de transição de carreira NIAID/NIH 1K22AI116661-01.

Todos os procedimentos de animais foram realizados com a aprovação de acordo com o cuidado de Animal institucional e uso Comité (IACUC) no Hospital Geral de Massachusetts.
Atenção: Este protocolo envolve o uso de um laser de classe 3b (LG3). Óculos de segurança do laser de LG3 sempre devem ser usados quando este laser em funcionamento. Orientações adequadas de treinamento e segurança devem ser seguidas para evitar o risco de lesões.
1. projeto e montagem de Laser
<ol><li>Se conectar o diodo emissor de luz (LED) (405 nm, 19,3 mW, 1400 mA, fibra-acoplado) para o LED driver via o cabo conector M8 de 4 pinos que vem anexado para o LED. Com cuidado, aperte o parafuso para fixar a conexão.</li>
	<li>Antes de fixar o cabo de remendo de optogenetics o LED, segure o conector não abertura do LED para a luz para assegurar-se lá são nenhuma obstrução visível. Sopre o furo para eliminar obstruções, se necessário e insira o cabo de remendo de optogenetics na abertura.</li>
	<li>Conecte a cânula de fibra óptica do cabo de remendo de optogenetics por inserir a cânula em cada extremidade da manga do conector. Fixe a outra extremidade da manga do conector para o cabo de remendo.  Aplica pressão suficiente para garantir a conexão, mas tenha cuidado para não dobrar ou quebrar a fibra óptica da cânula. Nota: A cânula de frágil da fibra óptica é coberta com a tampa de protecção sempre que o laser não está em uso.</li>
	<li>Definir o driver de LED para o modo de onda contínua (CW) com o botão de ajuste contínuo em 0 e o limite atual definido como 1.2 A.</li>
</ol>2. Photoconversion de células do cólon
Nota: Ratos machos e fêmeas foram expostos à intracolonic 405 nm luz 1-2 dia (s) após o seu nascimento e sacrificaram-se antes de 1 semana de idade.
<ol><li>Assegurar um local escuro, com um acesso a uma tomada elétrica. O driver de LED ficha eléctrica. Nota: Este procedimento é realizado na luz branca mínima como uma longa exposição dos ratos a luz ambiente pode causar um indesejado photoconversion das células. Luz vermelha é usada como uma alternativa. Atenção: O passo seguinte envolve o uso de um anestésico de animal. A administração do anestésico tem lugar em um bairro de classe II ou usando outro sistema de eliminação adequado. A inalação de anestésico pode causar tonturas, sonolência ou até mesmo inconsciência.</li>
	<li>Anestesia o mouse pela exposição aos 4-5% de isoflurano em 100% de O2 em uma caixa de indução. Verificar a profundidade apropriada da anestesia beliscando firmemente uma pata traseira (sem resposta). Manter a anestesia através de um cone de nariz em aproximadamente 2% de isoflurano. Evitar a exposição de manipulador de isoflurano pelo uso de um dispositivo de eliminação anestésico ou capuz adequado.</li>
	<li>Posicione o mouse anestesiado para a exposição de intracolonic usando 1 mão à nuca, as costas do mouse suavemente com o dedo indicador e o polegar. Vire o mouse para expor o abdome. Solte o punho se o rato começa a perder sua cor-de-rosa ou se sua taxa de respiração começa a desacelerar. Prenda o rabo do mouse entre o anel e os dedos pequenos.</li>
	<li>Com a outra mão, retire a capa protetora da cânula. Mantendo o longo eixo da cânula paralela à linha mediana do rato, Introduza cuidadosamente a cânula de fibra óptica através do ânus para o cólon para que todos os 5 mm da fibra óptica são dentro do mouse. Nota: Este procedimento é realizado lentamente e com cuidado para não perfurar a parede do cólon. Minuto se mexer e torção da cânula auxilia o avanço para o cólon.</li>
	<li>Não os óculos de segurança e aumentar a laser atual para o valor máximo (todo o caminho no sentido horário). Confirme a presença da luz UV de olhar para o abdômen translúcido do mouse. Nota: Os óculos de segurança do laser LG3 dramaticamente diminuem a visibilidade. Tenho um colega (usando equipamentos de proteção) auxiliar na acoplando os óculos e ligar o laser.</li>
	<li>Expor o cólon para a luz do laser para um total de 2 min. retirar a cânula de aproximadamente 1 mm a cada 30 s para maximizar a área luminal exposta à luz. No final de 2 min, desligue o laser.</li>
	<li>Remova lentamente a cânula do mouse. Depois de se recuperar da anestesia em uma gaiola vazia quente, retorne o rato da gaiola em casa.</li>
</ol>3. isolamento de linfócitos Intestinal
<ol><li>Preparar 1 L de tampão de soro (HBSS/CS) solução equilibrada sal/bezerro do Hank, 200 mL de tampão epitelial tira, 500 mL de mídia de lavagem e 200 mL de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA)-lavagem de mídia livre. Nota: Os volumes de reagente são calculados para um tamanho de amostra de 9.<ol>
<li>Fazer o buffer HBSS/CS (HBSS; 5% CS) adicionando-se 50 mL de CS a 950 mL de HBSS. Armazená-lo no gelo.</li>
		<li>Preparar o buffer tira epiteliais [HBSS; 5% CS 1 mM ditiotreitol (DTT); 5 mM EDTA; ácido de piperazina-1-etanesulfónico 15mm 4-(2-Hydroxyethyl) (HEPES) (pH 7,2-7,5)], adicionando 10 mL de CS, 200 µ l de 1 M DTT, 2 mL de EDTA 0,5 M e 3 mL de tampão HEPES de 1m para 185 mL de HBSS. Coloca o tampão tira epiteliais em banho maria a 37 ° C.</li>
		<li>Fazer a mídia de lavagem (HBSS; 1% CS 1 mM EDTA) adicionando-se 5 mL de CS e 1 mL de EDTA 0,5 M a 494 mL de HBSS. Armazená-lo em temperatura ambiente.</li>
		<li>Prepare a mídia de lavagem livre de EDTA (HBSS; 1% CS 15 mM HEPES), adicionando 2 mL de CS e 3 mL de 1 M HEPES a 195 mL de HBSS. Armazená-lo em temperatura ambiente.</li>
		<li>Fazer uma reserva de FACS [1 x salina tamponada fosfato (PBS) (pH = 7,2); 2% CS] adicionando 10 mL de CS a 490 mL de PBS. Armazená-lo no gelo.</li>
	</ol></li>
	<li>Prepare o prato de coleção de tecidos, colocando um filtro de célula 70 µm dentro de um prato de cultura 60 x 10 mm. Adicionar 10 mL de tampão HBSS/CS (HBSS; buffer de CS 5% feita na etapa 3.1.1 e armazenado no gelo) para o prato e coloque-o no gelo.</li>
	<li>Eutanásia o rato através de uma overdose de isoflurano inalado usando a eliminação adequada de anestésico (aproximadamente 3 min exposição a > 4% de isoflurano no ar ambiente ou em 100% O2). Após a aparente cessação da respiração e reflex movimento, verificar a ausência de dor profunda por beliscar firmemente uma pata traseira (usar fórceps é recomendado). Certifique-se a eutanásia através de uma decapitação usando um par de tesouras cirúrgicas ou uma navalha nova. Nota: O deslocamento Cervical não é recomendado para esta etapa, devido ao tamanho e idade do animal. Esses métodos são coerentes com as orientações de AVMA 2013 sobre eutanásia e aprovaram pelo MGH IACUC.</li>
	<li>Colheita do cólon usando pinça limpa e tesoura para abrir o abdômen. Refletem os intestinos para 1 lado do abdômen do rato para expor o cólon. Remover o cólon inteiro pela primeira cruza-lo apenas distal (na direção do ânus) para o ceco. Então, enquanto segurando firmemente o cólon com fórceps, utilize tesouras para cortar através da uretra até ao recto. Corte o cólon como perto do ânus quanto possível. Colheita do baço após a remoção do cólon (ver etapas 4.1-4.2 abaixo). Nota: Enquanto o protocolo de photoconversion apenas alvos ~ 25% do cólon do recém-nascido (5 mm da cânula fibra óptica), todo o cólon é colhido para ajudar no isolamento da célula.</li>
	<li>Limpeza do cólon usando fórceps para empurrar o conteúdo fora do cólon e em uma toalha de papel seca. Homogeneizar o tecido usando lâminas de barbear, pique finamente o cólon em um colar na capa de um prato de cultura e depois transferir esta pasta para o filtro de célula na caixa de Petri.</li>
	<li>Adicionar uma barra de agitação magnética tempo limpo 8 mm para o filtro e coloque o prato em um prato de agitador magnético 9 posições. Definir a velocidade de barra de agitação magnética para 800 rpm e incube as celulas por 5 min à temperatura ambiente. Descartar o buffer e repita a lavagem com 10 mL de HBSS/CS (o HBSS; buffer de CS 5% feita na etapa 3.1.1 e armazenado no gelo). Descarte o buffer no final da lavagem.</li>
	<li>Dissociar as células epiteliais, adicionando 10 mL de tampão de escaldadas tira epitelial (o HBSS; 5% CS 1mM DTT; 5mM EDTA; 15mM de tampão de HEPES [pH 7,2-7,5] que foi feita no passo 3.1.2 e armazenado em banho maria a 37 ° C) para o filtro de célula e mexa a 800 rpm por 30 min em um 3 Incubadora de 7 ° C. No final da incubação, transferi o buffer enriquecido na fração epitelial para um tubo limpo 15 mL. Nota: O epitélio e o associado células (células epiteliais intestinais e os linfócitos epiteliais intestinais) são liberadas para o buffer, enquanto as células no intacto do propria do lamina permanecem no filtro célula durante esta etapa11.<ol>
<li>Centrifugue a fração epitelial intestinal (LAL) enriquecida a 700 x g durante 5 min à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante e ressuspender as células em 1 mL de tampão de FACS. Armazená-lo no gelo para uso na etapa 3.15.</li>
	</ol></li>
	<li>Lave a fração propria do lamina dentro do filtro célula 2 x com HBSS/CS. Para fazer isso, adicionar 10 mL de solução HBSS/CS (HBSS; reserva de CS de 5% que foi feita na etapa 3.1.1 foi armazenado no gelo) para o filtro de célula e agite-a 800 rpm por 5 min em uma incubadora de 37 ° C. Descarte o buffer depois de cada lavagem.</li>
	<li>Lavar a amostra 2 x em meios de lavagem. Adicionar 10 mL de mídia de lavagem (HBSS; 1% CS; reserva de EDTA 1 mM que foi feita no passo 3.1.3 e armazenada à temperatura ambiente) para o filtro de célula e agite-a 800 rpm por 15 min em uma incubadora de 37 ° C. Descarte o buffer depois de cada lavagem.<ol>
<li>Depois de usar a mídia de lavagem, armazená-lo no gelo para o uso na etapa 3.14.</li>
	</ol></li>
	<li>Lavar a amostra 2 x com HBSS/CS. adicionar 10 mL de tampão HBSS/CS (HBSS; 5% CS buffer feitas na etapa 3.1.1 foi armazenado no gelo) para o filtro de célula e agite-a 800 rpm por 5 min em uma incubadora de 37 ° C. Descarte o buffer depois de cada lavagem.</li>
	<li>Incube o tecido em EDTA livre de tampão de lavagem. Adicionar 10 mL de tampão de lavagem livre de EDTA (HBSS; 1% CS; tampão HEPES de 15 mM que foi feito no passo 3.1.4 e armazenado à temperatura ambiente) para o filtro de célula e incubar a placa por 10 min à temperatura ambiente sem agitação. Descarte o buffer no final desta etapa.</li>
	<li>Lavar a amostra 2 x com HBSS/CS e preparar a solução de enzima. Adicionar 10 mL de HBSS/CS (HBSS; buffer de CS 5% feita na etapa 3.1.1 foi armazenado no gelo) do buffer para o filtro de célula e agite-a 800 rpm por 10 minutos em uma incubadora de 37 ° C. Descarte o buffer depois de cada lavagem.<ol>
<li>Preparar a solução de enzima (EDTA livre lava tampão; 0,1 mg/mL DNase I; colagenase 167 mg/mL) durante o segundo período de lavagem: adicione 9 mg de DNase eu e 15 mg de liofilizado colagenase a 90 mL de EDTA livre wash buffer. Armazene a solução à temperatura ambiente.</li>
	</ol></li>
	<li>Digeri a fração propria do lamina contida no filtro célula obter propria do lamina linfócitos (LPLs). Adicionar 10 mL da solução de enzima (o EDTA livre o tampão de lavagem; 0,1 mg/mL DNase I; 167 mg/mL de tampão de colagenase feitas na etapa 3.12.1 e armazenados à temperatura ambiente) para o filtro de célula e agite-a 800 rpm por 45 min em uma incubadora de 37 ° C. Nota: LPLs são liberados para a solução após a digestão enzimática.<ol>
<li>Recolher a solução de enzima que contém as células e filtrar através de um novo filtro de célula para um tubo cónico de 50 mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Adicione 20 mL de lavagem frio mídia (o HBSS; 1% CS; 1mM EDTA amortecedor feita na etapa 3.1.3 e armazenado no gelo na etapa 3.9.1) para as células filtradas para bloquear a atividade de colagenase na solução enzimática. Centrifugar o tubo a 700 x g, durante 6 min à temperatura ambiente. Desprezar o sobrenadante e ressuspender o precipitado contendo LPLs em 1 mL de tampão de FACS.</li>
	<li>Combine o IEL (da etapa 3.7.1) e as frações LPL (da etapa 3.14) e manchá-las com anticorpos conjugados fluorescentes para a análise do fluxo cytometric (Veja passo 5). Nota: IEL e LPL frações podem ser manchadas separadamente se desejar informações de compartimento.</li>
</ol>4. isolamento de linfócitos do baço
<ol><li>Prepare o tubo de coleta adicionando 500 µ l de tampão de FACS em um tubo de microcentrifugadora. Armazená-lo no gelo.</li>
	<li>Após a remoção do cólon (passo 3.4), colher o baço inteiro e coloque-o no tubo de coleta. Armazene o tecido no gelo.</li>
	<li>Usando um homogeneizador de elétrica, homogeneizar o baço em um tubo de microcentrifugadora de aproximadamente 1 min. centrifugar a amostra a 300 x g [micro centrífuga] durante 5 min à temperatura ambiente e Aspire fora o sobrenadante.</li>
	<li>Realizar a lise dos glóbulos vermelhos por resuspending a amostra em 500 µ l de tampão de lise de amónio-cloreto-potássio (ACK) para iniciar a morte celular por lise osmótica. Permitir que a amostra incubar 1-2 min à temperatura ambiente e então ele Resuspenda em 725 µ l de tampão de FACS.</li>
	<li>Centrifugar a amostra a 300 x g [micro centrífuga] durante 5 min à temperatura ambiente e Aspire fora o sobrenadante. Resuspenda o pellet em 500 µ l de tampão de FACS e filtrar através de um filtro de célula de 40 µm para um novo tubo de microcentrifugadora. Transferir toda a amostra para um tubo de microcentrifugadora novo e manchá-la com anticorpos conjugados fluorescentes para a análise do fluxo cytometric (Veja passo 5).</li>
</ol>5. identificação de Dendra-r+ citometria de fluxo utilizando células
<ol><li>Centrifugar as amostras IEL/LPL e baço a 300 x g [micro centrífuga] durante 5 min à temperatura ambiente e Aspire fora o sobrenadante.</li>
	<li>Resuspenda as pelotas em 100 µ l de anticorpo que mancha a mistura. Prepare o anticorpo que mancha a mistura adicionando 1 µ l de conjugado fluorescente anti-CD45 anticorpo a 100 µ l de tampão de FACS por amostra. Nota: É importante dosear os anticorpos usados para a citometria de fluxo antes do experimento para determinar a concentração ideal onde ocorre a saturação de vinculação.</li>
	<li>Incube as amostras para 35 min no gelo (em um local escuro).</li>
	<li>Resuspenda as amostras em 300 µ l de tampão de FACS e centrifugá-los a 300 x g [micro centrífuga] durante 5 min à temperatura ambiente. Aspirar o sobrenadante e ressuspender as amostras em 325 µ l de tampão de FACS. Analise as amostras em um citômetro de fluxo.</li>
</ol>

<ol><li>Maynard, C. L., Elson, C. O., Hatton, R. D., Weaver, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+interactions+of+the+intestinal+microbiota+and+immune+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reciprocal interactions of the intestinal microbiota and immune system.</a> Nature. 489, 231-241 (2012).</li>
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<li>Pham, A. H., McCaffery, J. M., Chan, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+lines+with+photo-activatable+mitochondria+to+study+mitochondrial+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Mouse lines with photo-activatable mitochondria to study mitochondrial dynamics.</a> Genesis. 50, 833-843 (2012).</li>
<li>Conway, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATG5+regulates+plasma+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">ATG5 regulates plasma cell differentiation.</a> Autophagy. 9, 528-537 (2013).</li>
<li>Buzoni-Gatel, D., Lepage, A. C., Dimier-Poisson, I. H., Bout, D. T., Kasper, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adoptive+transfer+of+gut+intraepithelial+lymphocytes+protects+against+murine+infection+with+Toxoplasma+gondii%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Adoptive transfer of gut intraepithelial lymphocytes protects against murine infection with Toxoplasma gondii.</a> Journal of Immunology. 158, 5883-5889 (1997).</li>
<li>Guo, X., Muite, K., Wroblewska, J., Fu, Y. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+and+Adoptive+Transfer+of+Group+3+Gut+Innate+Lymphoid+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Purification and Adoptive Transfer of Group 3 Gut Innate Lymphoid Cells.</a> Methods in Molecular Biology. 1422, 189-196 (2016).</li>
<li>Morton, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoscopic+photoconversion+reveals+unexpectedly+broad+leukocyte+trafficking+to+and+from+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Endoscopic photoconversion reveals unexpectedly broad leukocyte trafficking to and from the gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 6696-6701 (2014).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A identificação e caracterização de células que interagem com e são influenciados pela microbiota do cólon são importantes e devem facilitar a compreensão de como a informação do microambiente da mucosa é retransmitida para o resto do corpo. Um método para estudar a migração celular relacionados ao intestino requer o isolamento de células associada a barriga, seguido por uma transferência adotiva em camundongos destinatários para determinar os padrões de tecido-homing e funcionar12,<sup...

O trato gastrointestinal dos mamíferos abriga centenas de espécies de bactérias que podem existirem em uma relação simbiótica com o host1. As células do sistema imunológico presentes no meio local impor uma coexistência pacífica com estes micróbios e estabelecer uma barreira de proteção contra invasões de patógeno. Assim, bi-direcional interações entre as células do sistema imunológico e a microbiota são fundamentais para estabelecer uma comunidade comensal que educa o sistema imunológico do hospedeiro e define o limiar de reatividade imune a patógenos. Mudanças no microbiana composição, ou disbiose, pode perturbam a homeostase imune e perturbam circuitos regulamentares que conter inflamações intestinais, levando a imune-mediada doenças como a Diabetes tipo 1 e IBD2,3 .
O período imediatamente após o nascimento é uma única do desenvolvimento durante o qual as comunidades microbianas intestinais começam a estabelecer, ao mesmo tempo, o sistema imunológico amadurece4. A microbiota pós-Natal não é estável, com mudanças na composição da Comunidade ocorrendo naturalmente e frequentemente5. As células imunitárias que interagem com a microbiota residem em duas distintas anatômicas locais no intestino - a propria do lamina e o epitélio intestinal6. Vários tipos de células do sistema imunológico estão presentes no intestino, incluindo linfócitos (tais como as células T, células B e células linfoides inatas), bem como de células mieloides (que incluem os monócitos, macrófagos e células dendríticas). Estas células, também conhecido como células hematopoiéticas, executam uma variedade de funções que preservam a barreira intestinal e manter a homeostase.
Além de suas funções reguladoras locais intestinal, células do sistema imunológico da mucosa também podem efectuar microbianas mensagens aos sites extra intestinais para regular a imunidade sistêmica7,8,9. Esta é uma área de crescente interesse de pesquisa e destaca a necessidade de métodos para identificar as células imunes que migram fora tecidos intestinais, a fim de sondar a sua função. O protocolo relatado aqui utiliza um modelo de mouse disponíveis comercialmente em que uma proteína fluorescente photoconvertible é explorada para células de rótulo. PhAMextirpado ratos ubiquitously expressam uma proteína verde fluorescente Dendra2 que é irreversivelmente ligam para fluorescência vermelha após a ativação por ultravioleta (UV) luz10. Usando uma cânula de fibra óptica para fornecer luz de nm 405 no cólon de ratos recém-nascidos, demonstramos que photoconverted de células hematopoiéticas, que se originou em ou transitar através do cólon pode ser encontrado no baço.

<table><tbody><tr><td><forte>Laser</forte></td>Diodo Emissor de Luz (LED)THORLABS M405FP1 CUIDADO: este é um laser Classe <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>3b. Óculos de segurança devem ser usados ao usar o laser. Ele emite um comprimento de onda de 405 nm com uma corrente de 1400 mA. É acoplado a fibras. Aceita conector SMA. https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=M405FP1</td></tr><tr><td>driver de LED</td><td>THORLABS</td><td>LEDD1B</td><td>Aciona uma corrente constante de 1200 mA através do laser. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=2616</td></tr><tr><td>Cabo de interconexão optogenética</td><td>THORLABS</td><td>M87L01</td><td>Cabo de 1 m de comprimento com conector SMA. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=11405&pn=M87L01#11454</td></tr><tr><td>Cânula de fibra óptica</td><td>Lentes dóricas&nbsp;</td><td>MFC_480/500-0.5_5mm_ZF1.25_C45</td><td>Cânula de 5 mm de comprimento com diâmetro externo de 500 &micro; m e um diâmetro interno de 480 &micro;m. O valor de NA é 0,5. A ponteira é de zircônia, 1,25 mm OD. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=6036</td></tr><tr><td>Fonte de alimentação</td><td>THORLABS</td><td>KPS101</td><td>Fornece 15 V com uma corrente de 2,4 A https://www.thorlabs.com/search/thorsearch.cfm?search=KPS101</td></tr><tr><td>óculos de segurança a laser LG3&nbsp;</td><td>Lentes THORLABS</td><td>LG3</td><td>Laranja com 47% de transmissão de luz visível https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=762&pn=LG3#2523</td></tr><tr><td>Luz vermelha&nbsp;</td><td>Microscopia Eletrônica Sciences</td><td>74327-10</td><td>15 W lamp https://us.vwr.com/store/product/12360027/paterson-safelight-electron-microscopy-sciences</td></tr><tr><td>Isolamento de células intestinais</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-893-1389</td><td>CUIDADO: a inalação deste anestésico pode causar tontura, sonolência ou até mesmo inconsciência. Este anestésico deve ser usado em um capuz de Classe II.&nbsp; https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_762328?carouselPageNumber=3</td></tr><tr><td>1X HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025076</td><td>Ca / Mg Soro de</td></tr><tr><td>Bezerro</td> https://www.fishersci.com/shop/products/gibco-hbss-calcium-magnesium-no-phenol-red-4/14025076?searchHijack=true&searchTerm=14025076&searchType=RAPID&matchedCatNo=14025076 Livre <td>Hyclone AZM</td><td>197696</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575020</td><td>concentração de 0,5 M https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15575020?SID=srch-srp-15575020</td></tr><tr><td>TDT</td><td>Sigma</td><td>10197777001</td><td>CUIDADO: prejudicial se ingerido e causa irritação na pele. Concentração de 1 M https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/dttro?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630080</td><td>Concentração de 1 M https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15630080?SID=srch-hj-15630080</td></tr><tr><td>placa de Petri</td><td>Corning</td><td>353004</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-easy-grip-tissue-culture-dishes-2/08772f?searchHijack=true&searchTerm=08772F&searchType=RAPID&matchedCatNo=08772F</td></tr><tr><td>filtro de células de 70 mícrons</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087712</td></tr><tr><td>Barra de agitação micromagnética</td><td>Fisherbrand</td><td>1451364</td><td>Enxágue em etanol a 70% após cada uso. Enxágüe várias vezes em água destilada antes de cada uso. A barra tem 8 mm de comprimento com formato octogonal. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-octagonal-magnetic-stir-bars-12/1451364#?keyword=1451364</td></tr><tr><td>Agitadores magnéticos</td> do <td>laboratório de Corning</td> da placa da agitação <td>440826</td><td>https://www.coleparmer.com/i/corning-440826-nine-position-stirrer-120-vac-60-hz/8430420?PubID=UX&persist=true&ip=no&gclid=CjwKCAiAqbvTBRAPEiwANEkyCLPLrWABXmOUI0QE53NLV0Owxlcs2V1K6rWbRPOwlcVVDq000FBiQxoCqQAQAvD_BwE</td></tr><tr><td>Colagenase</td><td>Roche</td><td>5401020001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/05401020001?lang=en&region=US&gclid=CjwKCAiAjuPRBRBxEiwAeQ2QPhE44qlvxjmo1PYu3zCas3w-_d6P9gKjXW82-c1EOm6NjPHCc5WuixoC_0IQAvD_BwE</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma</td><td>10104159001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/roche/10104159001?lang=en&region=US</td></tr><tr><td>1X PBS</td><td>Gibco</td><td>20012-027</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/20012027?SID=srch-hj-20012-027</td></tr><tr><td>Pipeta auxiliar</td><td>Thermo Scientific</td><td>14387165</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/s1-pipette-fillers/14387165#?keyword=14387165</td></tr><tr><td>pipeta sorológica de 10 mL</td><td>Falcon</td><td>357530</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>Pipeta sorológica de 25 mL</td><td>Falcon</td><td>357515</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-serological-pipets-bulk-pack-5/p-163659</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga cônico de 15 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>339651</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga cônico de 50 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>339653</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650</td></tr><tr><td><forte>Suspensão de célula única</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubos Eppendorf</td><td>Seal-Rite</td><td>1615-5500</td><td>Suporta 1,5 mL. https://www.usascientific.com/Seal-Rite-1.5-ml-tube.aspx</td></tr><tr><td>Homogeneizador de tecidos&nbsp;</td><td>Kimble</td><td>K7495400000</td><td>Requer 2 pilhas AA. https://www.fishersci.com/shop/products/kontes-pellet-pestle-cordless-motor-cordless-motor/k7495400000</td></tr><tr><td>Pontas do homogeneizador&nbsp;</td><td>Kimble</td><td>7495210590</td><td>Plástico, pontas de 0,5 mL https://www.fishersci.com/shop/products/kimble-chase-kontes-pellet-pestle-14/k7495210590#?keyword=7495210590</td></tr><tr><td>tampão de lise ACK</td><td>Gibco</td><td>A10492-01</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1049201?SID=srch-hj-A10492-01</td></tr><tr><td>Filtro de célula de 40 mícrons</td><td>Falcon</td><td>08-771-1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/087711</td></tr><tr><td>Anticorpos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BV786 anti-mouse CD45&nbsp;</td><td>BD</td><td>564225</td><td>Clone 3O-F11 https://www.bdbiosciences.com/us/reagents/research/antibodies-buffers/immunology-reagents/anti-mouse-antibodies/cell-surface-antigens/bv786-rat-anti-mouse-cd45-30-f11/p/564225</td></tr><tr><td>Vivo/Morto</td><td>Invitrogen</td><td>L34962</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/L34962</td></tr><tr><td>Outro</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Razor lâminas</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Utilização para decapitação. https://us.vwr.com/store/product/4548306/vwr-razor-blades</td></tr></tbody></table>

na vivo photolabeling de células no cólon para avaliar o potencial migratória das células hematopoiéticas em camundongos neonatais

In Vivo Photolabeling of Cells in the Colon to Assess Migratory Potential of Hematopoietic Cells in Neonatal Mice

Comunidades de bactérias entéricas são estabelecidas no início da vida e influenciam a função e o desenvolvimento de células imunes. A microbiota neonatal é suscetível a inúmeras influências externas, incluindo o uso de antibióticos e dieta, que afeta a susceptibilidade a doenças auto-imunes e inflamatórias. Doenças como a doença intestinal inflamatória (IBD) caracterizam-se por um afluxo maciço de células do sistema imunológico para os intestinos. No entanto, células imunes, condicionadas pela microbiota podem adicionalmente emigrar fora os intestinos para influenciar as respostas imunes locais extra intestinal. Assim, há uma necessidade de identificar e caracterizar as células que podem transportar mensagens microbianas do intestino para sites distais. Aqui, descrevemos um método para células de rótulo no cólon de ratos recém-nascidos na vivo que permite a sua identificação nos sites extra intestinais após a migração.

Um cabo de fibra óptica foi usado para lançar 405 luz nm para os dois-pontos de 2 - velho dias PhAMextirpado ratos. Em experimentos anteriores, determinou-se uma exposição de 30 s para dar uma photoconversion máxima de células do cólon com mínima citotoxicidade (Figura 1A). Portanto, sequencial 30 exposições de s de diferentes segmentos do cólon foram realizadas conforme descrito no protocolo. Após a exposição do laser, os ratos fo...

O protocolo descrito aqui utiliza uma abordagem photolabeling em camundongos recém-nascidos para identificar especificamente as células do sistema imunológico que emigram do cólon para sites extra intestinais. Esta estratégia será útil para estudar interações do anfitrião-microbiome no início da vida.

Na Vivo Photolabeling de células no cólon para avaliar o potencial migratória das células hematopoiéticas em camundongos Neonatais

Enteric bacterial communities are established early in life and influence immune cell development and function. The neonatal microbiota is susceptible to ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da imunologia da mucosa em relação às interações do microbioma imunológico do hospedeiro neonatal, como as células carregam mensagens microbianas e, em caso afirmativo, quais células são? A principal vantagem desta técnica é que ela rotula de forma não específica e irreversível as células residentes no cólon em camundongos infantis, permitindo-nos determinar seus padrões de tráfego para locais extra-intestinais. Para montar o laser, conecte o diodo emissor de luz ou LED ao driver de LED por meio do cabo conector M8 de quatro pinos do LED e aperte cuidadosamente o parafuso para apertar a conexão.Segure a abertura do conector do LED contra a luz para garantir que não haja obstruções visíveis. Insira o cabo do patch optogenético na abertura. Insira a cânula em uma das extremidades da luva do conector.Em seguida, conecte a outra extremidade da luva do conector à extremidade do cabo de conexão, conectando a cânula de fibra óptica ao cabo de conexão de fibra óptica. Use o botão de ajuste contínuo para definir o driver de LED para o modo de onda contínua em zero e o limite de corrente definido para 1.2 amps. Quando o laser esti

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Medicine

Medicina

Este artigo descreve um método para a rotulagem de pele embrionária e vasos sanguíneos do timo.

Um método para Etiquetagem Vascularização no embrião do rato

O citomegalovírus (HCMV) A infecção humana de recém-nascidos representa uma importante causa de retardo mental, mas os eventos moleculares que levam à induzida por vírus patogênese ainda são pouco compreendidos. Para investigar a dinâmica da infecção cerebral, adaptamos...

Utilização de<em&gt; In vivo</em&gt; Imagem para monitorar a progressão da infecção pelo citomegalovírus Experimental Rato em recém-nascidos

Nós descrevemos um protocolo geral para no rastreamento de células in vivo utilizando ressonância magnética em um modelo de rato com ex vivo células marcadas. Um protocolo típico para a marcação de células, o processamento de aquisição de imagem e a quantificação é incluído.

In vivo 19 F MRI para Rastreamento celular

Combinatória 5 proteínas fluorescentes marcação de células-tronco e progenitoras hematopoiéticas permite in vivo de rastreamento via clonal confocal e microscopia de dois fótons, fornecendo insights sobre medula óssea hematopoiética arquitetura durante a regeneração. Este método permite o mapeamento destino não-invasivo de espectro codificados células hspCs derivados em tecidos intactos por longos períodos de tempo após o transplante.

In vivo Clonal Rastreamento de Stem hematopoiéticas e células progenitoras Marcado por cinco proteínas fluorescentes usando confocal e microscopia multifotônica

A natureza das interações entre células tronco e progenitoras hematopoéticas (hspCs) e nichos de medula óssea é pouco compreendido. Modificações de hardware personalizado e um protocolo de aquisição multi-passo permite o uso de dois fótons e microscopia confocal a imagem ex vivo hspCs rotulados hospedados dentro de áreas da medula óssea, as interações de rastreamento e movimento.

In Vivo Rastreamento 4-Dimensional de tronco hematopoéticas e células progenitoras em adultos mouse na calota craniana de Medula Óssea

Os monócitos são os principais reguladores da imunidade inata e desempenham um papel crítico na renovação do sistema fagocítico mononuclear periférico e em caso de inflamação. Este manuscrito descreve o procedimento de imagem em tempo real da medula óssea da calvária de camundongos para estudar o mecanismo de mobilização de monócitos.

Acompanhando Rato Medula Óssea monócitos<em&gt; In Vivo</em

Detalhamos um protocolo para monitorar o comportamento de neutrófilos e monócitos em veias mesentéricas em estado estacionário e condições inflamatórias usando microscopia confocal intravital em camundongos anestesiados.

Imagiologia neutrófilos e monócitos em Mesenteric Veins por Microscopia intravital em ratos anestesiados em Tempo Real

Os mecanismos que regulam a motilidade intersticial de células T efectoras CD4 em locais de inflamação são relativamente desconhecidos. Apresenta-se uma abordagem não invasiva para visualizar e manipular em células T CD4 + in vitro -primed na derme da orelha inflamado, permitindo o estudo do comportamento dinâmico destas células in situ.

Migração intersticial imagens de células CD4 T na derme inflamadas

Protocolos para avaliação quantitativa da quimiotaxia de linfócitos e migração são ferramentas importantes para pesquisa de Imunologia. Aqui, um protocolo em vitro é descrito que permite em tempo real, multiplexados avaliação da migração celular, bem como um complementares na vivo técnica permitindo rastreamento de células nativas para o baço.

Quantificar o humano Monocyte Chemotaxis In Vitro e linfócitos murino tráfico Vivo

Nós descrevemos um método para visualizar o IELS do ltγδ GFP-etiquetado usando a imagem latente intravital do intestino pequeno murino pela microscopia confocal invertida do disco de giro. Esta técnica permite o rastreamento de células ao vivo dentro da mucosa para até 4 h e pode ser usada para investigar uma variedade de interações imunológicas intestinais.

Imagem latente intravital de linfócitos intraepithelial no intestino pequeno murine

A migração de neutrófilos depende da remodelação rápida e contínua da membrana plasmática em resposta ao quimioatraente e suas interações com o microambiente extracelular. Descrito aqui é um procedimento baseado em Microscopia Subcelular Intravital para investigar a dinâmica de remodelação da membrana em neutrófilos injetados na orelha de camundongos anestesiados.

Imagem da migração de neutrófilos na pele de camundongos para investigar a remodelação da membrana subcelular em condições fisiológicas

Aprenda a técnica de fotomarcação in vivo em camundongos neonatais para rastrear células imunes do cólon até sítios extra-intestinais. Este método auxilia pesquisadores a estudar interações hospedeiro-microbioma na vida precoce.

Na Vivo Photolabeling de células no cólon para avaliar o potencial migratória das células hematopoiéticas em camundongos Neonatais (Vídeo) | JoVE Journal

Na Vivo Photolabeling de células no cólon para avaliar o potencial migratória das células hematopoiéticas em camundongos Neonatais

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