Ilhota pancreatic incorporação para cortes de parafina

Este método pode ajudar os cientistas a maximizar o uso produtivo de ilhotas pancreáticas para avaliar vários resultados em cada amostra em sua arquitetura de tecido nativo. A principal vantagem deste novo método de incorporação é que as ilhotas são distribuídas uniformemente por uma área bem definida, colocando muitas ilhotas no plano de seção, o que otimiza o rendimento experimental desse material de baixa abundância. Demonstrando o procedimento estará o Dr. Yahui Kong, um pesquisador associado em meu laboratório.

Para iniciar este procedimento, use uma ponta de pipeta p200 de baixa ligação e uma grade calibrada sob um microscópio estéreo para escolher manualmente 250 equivalentes de ilhotas. Transferindo-os para cada tubo de microfífugo de baixa ligação de 1,5 mililitro. Deixe as ilhotas assentarem no fundo do tubo de microcentrífugas.

Em seguida, use uma pipeta com uma ponta p200 nova para remover cuidadosamente a maior parte do sobrenadante. Certifique-se de não remover nenhuma ilhota. Adicione um mililitro de PBS e centrifugue em uma centrífuga de balde oscilante até que a velocidade atinja 200 vezes a gravidade e, em seguida, pare a centrifugação.

Remova o sobrenadante. Repita todo o processo de lavagem do PBS para um total de dois ciclos de lavagem. Em seguida, adicione 500 microlitros de solução de formalina a 10% ou paraformaldeído a 4% feito na hora.

Deixe a amostra fixar à temperatura ambiente por 30 minutos. Depois disso, use uma pipeta com ponta p200 para remover o fixador. Adicione um mililitro de PBS e centrifugue até que a velocidade atinja 200 vezes a gravidade e depois pare a centrifugação.

Remova o sobrenadante e repita todo o processo de lavagem PBS mais uma vez para um total de dois ciclos de lavagem. Prepare o gel desejado em tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro, conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, coloque esses tubos de microcentrífuga em um bloco de calor a 70 graus Celsius para aquecer o gel.

Use uma ponta de micropipeta cortada para transferir 10 microlitros de grânulos azuis de agarose por amostra para um tubo de microcentrífuga limpo de 1,5 mililitro. Adicione um mililitro de PBS aos grânulos e centrifugue a 800 vezes a gravidade por um minuto. Remova o PBS e repita esta lavagem mais uma vez.

Após a segunda lavagem, ressuspenda as esferas em uma quantidade adequada de PBS. Centrifugue os tubos que contêm as ilhotas até que a velocidade atinja 200 vezes a gravidade e depois pare a rotação. Remova a maior parte do sobrenadante.

Usando uma tesoura, corte a ponta de uma ponta de micropipeta de 10 microlitros para cada amostra. Adicione 10 microlitros de contas a cada tubo de ilhota usando uma ponta de corte limpa para cada amostra. Em seguida, centrifugue até que a velocidade atinja 200 vezes a gravidade.

Depois disso, use uma ponta de 200 microlitros sem cortes seguida de uma ponta de 10 microlitros para remover o máximo de PBS possível. Etiquete as lâminas do microscópio para identificação da amostra e coloque-as na bancada perto do bloco de calor com o gel aquecido. Usando uma tesoura, corte as pontas de algumas pontas de micropipeta de baixa ligação por amostra.

Usando uma micropipeta equipada com uma ponta cortada, adicione gel quente a um tubo contendo ilhotas e contas. Misture imediatamente, evitando a criação de bolhas. Aplique esta mistura a uma lâmina formando um disco perto da borda da lâmina, deixando espaço para o anel de gel externo.

Em seguida, bata suavemente no slide algumas vezes para assentar as ilhotas e contas. Adicione 20 microlitros de gel quente ao sample tubo e misture o novo gel com quaisquer ilhotas e contas restantes. Aplique esta mistura na mesma lâmina ao redor do disco original.

Repita conforme necessário usando pontas pré-cortadas novas para cada aplicação até que o disco tenha o tamanho e a espessura desejados. Certifique-se de preparar cada disco individualmente e acompanhar a ordem dos exemplos se colocar vários discos em cada lado. Em seguida, coloque os slides em uma superfície plana de gelo úmido e cubra-os.

Deixe as lâminas descansarem por 10 minutos ou até que o gel solidifique. Em seguida, remova as lâminas certificando-se de secar a parte de trás de cada uma. Rotule um de tecido de processamento e incorporação de biópsia para cada amostra.

Use a ponta cega de uma lâmina de barbear para empurrar suavemente o disco de cada direção para liberá-lo do vidro. Quando deslizar facilmente, empurre lentamente o disco para fora do slide e coloque-o com o lado plano voltado para baixo diretamente sobre o papel. Pode ser difícil manter os discos distintos intactos ao deslizá-los da lâmina de vidro para o papel.

Se ocorrer uma ruga no disco, deixe-o retornar à posição original, adicione mais gel e retorne ao gel da lâmina. Dobre o papel ao redor do disco para evitar movimento. Transfira-o para o e feche-o.

Mergulhe o em um béquer cheio de PBS. Neste estudo, um método de incorporação baseado em disco de gel modificado é usado para gerar eficientemente um alto rendimento de ilhotas por seção. A morfologia das ilhotas de roedores está visivelmente mais intacta após a recuperação pós-isolamento em meio de ilhotas, exibindo uma superfície lisa e arredondada e uma forma esférica compacta.

O fato de a morfologia das ilhotas humanas ser semelhante, independentemente de estar embutida no dia da chegada ou após a recuperação pós-embarque durante a noite, pode ser devido à recuperação das ilhotas do estresse de isolamento antes do embarque. Em comparação, as seções de parafina obtidas por meio da antiga técnica de microtubos têm uma área de seção transversal de tecido menor, com menos ilhotas por seção e com ilhotas e contas densamente compactadas. Como mostrado aqui, esta técnica é capaz de produzir cortes de ilhotas de alta qualidade para coloração histológica e de imunofluorescência.

A coloração de insulina e glucagon mostra a composição diversificada e a heterogeneidade da arquitetura das ilhotas, demonstrando diferenças de arquitetura conhecidas entre ilhotas humanas, de camundongos e de ratos. Essas imagens também representam seções seriais das mesmas ilhotas. Demonstrando que esta técnica é capaz de obter várias seções das mesmas ilhotas.

Uma vez dominada, essa técnica economiza tempo em relação à técnica de microcentrífuga. Formar o disco em uma superfície plana em vez de em um tubo facilita a transferência física do disco para o para processamento. Embora esse método possa fornecer informações sobre a biologia das ilhotas, ele também pode ser aplicado a outros blocos de células ou tecidos friáveis que são difíceis de seccionar.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar de usar um gel de pequeno volume para concentrar o tecido em uma pequena área e formar o disco em uma superfície plana. Também é fundamental usar tubos de microcentrífuga de baixa ligação e pontas de pipeta para melhorar o rendimento do tecido. Essa técnica abre caminho para pesquisadores no campo da biologia de ilhotas explorarem a composição e heterogeneidade do tipo celular, interação célula-célula e regulação gênica em ilhotas inteiras cultivadas em sua arquitetura nativa.

A capacidade de gerar 10 ou mais seções contendo muitas ilhotas a partir de uma única condição experimental permite a quantificação de vários resultados no mesmo material, melhorando a eficiência experimental. A aplicação dessa técnica a amostras de tecido de abundância limitada também pode oferecer benefícios para outros campos. Os elementos deste procedimento podem precisar ser modificados para atender às necessidades do usuário.

A intensidade da fixação e a divisão devem ser otimizadas. Discos mais espessos ou maiores podem ser gerados usando esta técnica. Etapas simples de processamento para incorporação podem precisar ser aninhadas e devem ser otimizadas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar um bloco de células de agarose de alta qualidade para seções de parafina de ilhotas pancreáticas inteiras cultivadas.