Name: Isolamento e análise de comunidades microbianas na rizosfera, solo e raízes em experiências de grama perene (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-24T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 31 s
Description: Aprenda métodos padronizados para isolar e analisar comunidades microbianas da rizosfera, solo e raízes em experimentos de campo com gramíneas perenes. Estas técnicas garantem resultados reproduzíveis em ecologia microbiana.

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O desenvolvimento deste manuscrito é suportado pelo National Science Foundation EPSCoR Center para a raiz e o prêmio de inovação Rhizobiome OIA-1557417. A coleta de dados foi apoiada por fundos da Universidade de Nebraska-Lincoln, pesquisa agrícola e desenvolvimento e por uma concessão de hachura do USDA. Também reconhecemos o apoio do USDA-ARS e apoio foi prestado pela agricultura e comida pesquisa iniciativa competitiva Grant no. 2011-68005-30411 do USDA, Instituto Nacional de alimentos e agricultura para estabelecer e gerenciar esses campos.

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Os métodos descritos neste manuscrito deverão permitir aos cientistas para facilmente entrar no campo de metagenômica de solo e planta. Ao longo dos anos, nós refinaram nossos métodos desde a realização do experimento descrito neste manuscrito. Uma mudança é que agora pre-rotulamos os tubos antes de sair para o campo de amostra. Nosso laboratório utiliza um sistema de código de barras e uma impressora de etiqueta. A impressora de etiqueta não só economiza tempo quando rotulagem tubos, mas também torna tudo mais fácil para controlar e identificar corretamente as amostras sem os caprichos da escrita de mão humana. Outro ponto crítico é que tentar processar o material depois de trazer de volta do campo logo que possível. Nosso objetivo é congelar o solo utilizado para análise de DNA, esterilizar e congelar as raízes e filtrar e congelar a rizosfera dentro de 12 a 36 horas depois de voltar do campo. Os procedimentos de extração de DNA são longos com muitos degraus, particularmente para o solo e da rizosfera, então nós compramos um robô (Kingfisher Flex, ThermoFisher) que minimiza as mãos na hora dos protocolos de extração de DNA, reduz o erro humano que pode ser introduzido, e melhora a consistência na maneira diferentes lotes de solo, raízes ou rizosfera são processados. Ao trabalhar com material vegetal é importante decidir sobre o tipo de raiz para ser estudado ou tomar uma variedade de tipos de raiz de uma "amostra representativa". Manutenção de raízes e folhas no estado congelado quando conduzir as extrações de DNA é importante, porque está assegurando que não haja nenhuma contaminação cruzada entre amostras ao encher-se placas de extração de DNA de 96 poços. Outro fator importante a considerar é o número de repetições deve ser usado quando projetar experimentos de campo e usando um completo randomizados projeto sempre que possível26. Devido à variabilidade de alto campo pode ser necessário ter um grande número de repetições para detectar pequenas diferenças. Finalmente, nossa experiência é essencial para certificar-se que os solos não são demasiado molhados quando escavando as raízes. Se os solos estão saturados de água não só é confuso para trabalhar com, mas também é muito difícil definir a rizosfera e remover o solo das raízes.
Uma modificação que foi feita logo no início durante o desenvolvimento desses métodos foi em vez de tremer os tubos à mão para liberar a rizosfera que nós atualizado para vortexers alimentado por um gerador a gás para facilitar o trabalho no campo e mais padronizada em termos de o tempo e a maneira que cada tubo foi agitado. Uma limitação da abordagem de sequenciamento de amplicon é que a resolução taxonômica dos resultados é muitas vezes limitada e OTUs muitos são conhecidos desconhecidos ou apenas no nível de família ou género. Neste campo de pesquisa está evoluindo rapidamente, por isso é importante estar ciente de abordagens novas e em desenvolvimento, particularmente para análise de dados, que podem melhorar a resolução dos resultados.
Esses protocolos são somente para estudar as bactérias e archaea, não de fungos. O uso de diferentes primers para amplificação permitirá o estudo das comunidades fúngicas, usando o mesmo DNA amostras27,28. Esses métodos não exigem a compra de grandes quantidades de equipamento porque os métodos podem ser simplificados. Os métodos que descrevemos aqui são principalmente para determinar "quem é", mas o campo está a evoluir rapidamente para perguntas importantes sobre a função, que pode ser resolvida usando métodos de sequenciamento de espingarda, isolamento e testar a funcionalidade do micróbios, ou toda microbiana genomas de sequenciamento.
Os resultados representativos destacam as diferenças em comunidades microbianas que podem ser identificadas usando os métodos descritos. Usando uma abordagem de beta-diversidade para a análise de dados22, diferenças de composição foram mostradas entre tipos de amostra. Essas diferença foram claramente observados na maioria dos outros estudos onde endosphere, rizosfera e solo contêm comunidades microbianas original3. O índice de diversidade de Shannon foi calculado para determinar a abundância e a uniformidade das espécies microbianas presentes dentro de cada espécie de planta no endosphere, rizosfera e solo. Como mostrado neste estudo e em muitos outros, diversidade alfa é mais alta no solo, diminuindo ligeiramente na rizosfera e em seguida diminuir significativamente no endosphere3,5,29. Estes resultados indicam que os métodos descritos aqui são adequados para identificar mudanças composicionais no endosphere, rizosfera e solo.
O domínio das proteobactérias é um achado comum em estudos de31,30,endosphere e solo32. Endosphere geralmente tem uma baixa diversidade de espécies microbianas com uma maior abundância relativa as proteobactérias. Este novo destaca que os resultados aqui são representativas de outros achados na literatura. Os efeitos de tratamento neste estudo não foram significativamente diferentes e dois motivos principais para isso podem ser que as diferenças impostas pelos tratamentos não eram grandes o suficiente para gerar variação suficiente para detectar e que esta amostragem foi feita no final da época, quando os campos podem ter tido tempo suficiente para sacar o nitrogênio para níveis semelhantes, que é o que foi medido no final da temporada de crescimento. Em outro estudo utilizando taxas semelhantes de fertilização por um longo período de tempo, apenas relativamente pequenas mudanças na composição da microbiome foram medidos33. Outros estudos mostraram alterações nas comunidades fúngicas e bacterianas devido ao nitrogênio fertilizante34,35.
Espécies de plantas são conhecidos por desempenhar papéis na determinação de suas microbiomes3,32,36 e até mesmo pequenas diferenças na variação de comunidade microbiana tem sido demonstradas entre genótipos de plantas diferentes dentro de um única espécie37. Neste estudo, verificou-se uma diferença significativa na composição da comunidade microbiana entre espécies de plantas. Em todos os tipos de amostra pareceu que switchgrass tinha a composição microbiana mais distinta, mas as diferenças entre as espécies apenas foram estatisticamente significativas no endosphere. Composição da comunidade de rizosfera pode ter se tornado significativa se mais repetições estavam disponíveis para análise.
O campo combinado, laboratório e protocolos analíticos, descritos aqui fornecem um método poderoso para estudar a influência de fatores diferentes como a composição de comunidades microbianas em solos, rizosfera e a endosphere de raízes36. Há uma grande quantidade de trabalho a ser feito na área de estudo microbiomes, particularmente em campos agrícolas. Questões importantes sobre como os rendimentos são alterados por microbiome o solo ainda tem que ser totalmente elucidado. Mesmo as perguntas mais básicas sobre como as rotações de culturas influenciam a microbiome solo, como o sincronismo altera a microbiome, estresse abiótico como altera a microbiome, como tipo de solo interage com estes fatores para alterar a microbiome e se existem micróbios universais em certas culturas ou regiões dos EUA são todas questões abertas. Esses métodos também será útil para estudos epidemiológicos identificar a presença e persistência de bactérias patogénicas e benéficas. Outro horizonte de futuro para esses métodos será para começar a integrar os métodos de DNA descritos aqui com planta e micróbio RNA e dados do metabólito. Melhoria adicional e teste de variáveis mais será importantes para otimização mais desses protocolos.

Microbiome pesquisa tem implicações importantes para a compreensão e manipulação de processos do ecossistema como nutriente ciclismo, volume de matéria orgânica e o desenvolvimento ou a inibição de patógenos de solo1,2. Esta área de investigação também possui grande potencial para a compreensão dos impactos de micróbios do solo sobre a produtividade de comunidades vegetais naturais e agroecossistemas. Embora existam muitos estudos que focaram a microbiome solo em ecossistemas naturais, menos têm incidido sobre os micróbios de rizosfera e endosphere de plantas em agroecossistemas3. Em Nebraska, agricultura domina a paisagem em grande parte do estado, que faz com que os estudos destes solos onde as culturas agronomicamente importantes são cultivadas um tema vital para a pesquisa. O objetivo deste trabalho de métodos é fornecer a pesquisadores com um conjunto padrão de protocolos para descrever os micróbios presentes nos agroecossistemas, para determinar como as raízes das plantas modificam as comunidades microbianas na rizosfera e endosphere e eventualmente compreende as funções que estes micróbios jogar em produtividade de saúde e a planta do solo.
O método aqui apresentado difere ligeiramente métodos usados por outros4,5 em que este papel destina-se a aprendizagem que micróbios são exclusivamente no interior da raiz e como eles diferem de micróbios imediatamente fora a raiz na rizosfera. A sequenciação de amplicons utilizada neste estudo identifica os microbianos táxons encontrados na amostra de DNA e permite que os investigadores determinar como as comunidades mudam dependendo do tipo de amostra ou tratamento. Uma das principais diferenças entre o presente protocolo e um protocolo muito semelhante usado por Lundberg et al . 6 é que em vez de sonication, este protocolo utiliza esterilização de superfície com água sanitária e álcool para remover a rizosfera das raízes. Outros também usaram superfície esterilização efetivamente7,8,9,10. Esses métodos não são mais vantajosos do que outros métodos, mas ligeiramente diferente. Esses métodos são particularmente adequados para experimentos de campo grande, porque é possível processar mais de 150 parcelas de campo por dia, que adiciona até aproximadamente 450 amostras quando particionado em endosphere, rizosfera e solo com bastante gente. Este manuscrito descreve detalhadamente os métodos usados no campo da amostra, processar o material no laboratório, extrair e sequenciar o DNA e fornece uma breve visão geral das etapas para analisar os dados resultantes de sequenciamento.

<table><tbody><tr><td>Dneasy PowerSoil HTP 96 Kit</td><td>Qiagen/MoBio</td><td>12955-4</td><td>Kit de extração para solo e rizosfera</td></tr><tr><td>Dneasy PowerPlant HTP 96 Kit</td><td>Qiagen/MoBio</td><td>13496-4</td><td>Kit de extração para raízes</td></tr><tr><td>D-Handle Pá de escavação, 101 cm L</td><td>Fiskars</td><td>9669</td><td></td></tr><tr><td>Rapid Tiller, 40 cm L</td><td>Truper</td><td>34316</td><td></td></tr><tr><td>Ziploc Bags, 17,7 cm x 19,5 cm</td><td>Ziploc</td><td>Cooler NA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Qualquer</td> panela de lavagem <td>NA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Qualquer</td><td></td> balde de plástico NA <td></td></tr><tr><td>Qualquer</td><td>Luvas</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>(trabalho e laboratório)</td> <td>Qualquer</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>20 cm de diâmetro Peneira de solo #8, 2360 &mu; m tamanho da malha</td><td>Dual Manufacturing Co., Chicago IL</td><td>US8-8FS</td><td></td></tr><tr><td>20 cm de diâmetro Peneira de Solo #4, 4750 &mu; m tamanho da malha</td><td>Dual Manufacturing Co., Chicago IL</td><td>Gerador portátil US8-4FS</td><td></td></tr><tr><td></td><td>A marca Honda funciona bem</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Filtros de células estéreis 100 &mu; m tamanho da malha</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-549</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4&middot; H2O</td><td>VWR</td><td>0823</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>VWR</td><td>0404</td><td></td></tr><tr><td>Silwet L-77</td><td>Lehman Seeds</td><td>VIS-30</td><td>Surfactante</td></tr><tr><td>Autoclaves</td><td>Qualquer</td> Forno <td>de</td> Secagem NA <td></td></tr><tr><td></td><td>Qualquer</td> Escala <td>NA</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Qualquer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alvejante</td><td>CLOROX - força doméstica</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Qualquer</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogênio</td> líquido <td>Qualquer</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Pellets de gelo seco</td><td>Qualquer</td><td>NA</td> Etanol Qualquer NA <td></td></tr><tr><td>Pinças de ponta fina de precisão</td><td></td><td></td> de 11 cm Fisher 17456209 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> 18 cm Pinça de amostra de ponta reta VWR <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>82027-436</td><td></td></tr><tr><td>Tesoura de poda de 13,5 cm</td><td>Fiskars</td><td>9921</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de 2 mL</td><td>Qualquer</td><td>tubo</td> cônico NA <td></td></tr><tr><td>15 mL PP</td><td>MIDSCI</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cônico PP de 50 mL</td><td>MIDSCI</td><td>C50B</td><td></td></tr><tr><td>Água ultrapura</td><td>Millipore-sigma</td><td>Milli-Q Integral, fluorômetro</td> Q-POD <td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>Kit de ensaio Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q32854</td><td>Para quantificação de DNA de amostras removidas</td></tr><tr><td>Sistema QuantiFluor dsDNA</td><td>Promega</td><td>E2670</td><td>Para quantificação</td></tr><tr><td>de DNA Preto de 96 poços com placas de fundo plano transparente</td><td>Corning</td><td>3631</td><td></td></tr><tr><td>pPNA PCR Blocker</td><td>PNA Bio</td><td>PP01-50</td><td></td></tr><tr><td>mPNA PCR Blocker</td><td>PNA Bio</td><td>MP01-50</td><td></td></tr><tr><td>DNA genômico da comunidade simulada microbiana B (mesmo baixa concentração) v5.1L, para sequenciamento de genes de rRNA de 16s</td><td>Recursos BEI</td><td>HM782D</td><td></td></tr><tr><td>Adesivo 8 tiras de poço para placas</td><td>VWR</td><td>89134-434</td><td></td></tr><tr><td>Contas de aço inoxidável, 3,2 mm de diâmetro</td><td>Next Advance</td><td>SSB32</td><td></td></tr><tr><td>Bloco de ensaio de 1 ml (placa de extração de DNA para o Qiagen/MoBio Dneasy Kit HTP PowerPlant)</td> <td>Funil</td> de pesagem de PP antiestático CoStar <td>3959</td><td></td></tr><tr><td>, tamanho pequeno para solo/rizosfera</td><td>TWD Tradewinds, Funil</td> de pesagem <td>de PP antiestático INC ASWF1SPK</td><td></td></tr>, <tr><td>tamanho x-pequeno para raiz/folha</td><td>TWD Tradewinds, INC</td><td>ASWFXSCS</td><td></td></tr><tr><td>Genie 2 Digital Vortex</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de vórtice para tubos de</td> <td>50 mLScientific Industries</td><td>SI-H506</td><td></td></tr><tr><td>Almofariz (100 mL) e pilão</td><td>Qualquer</td><td>NA</td><td></td></tr><tr><td>Microespátula metálica</td><td>VWR</td><td>80071-672</td><td></td></tr><tr><td>Microespátulas antiestáticas descartáveis</td><td>VWR</td><td>231-0106</td><td></td></tr><tr><td>Saco de papel castanho 2# (10,95 cm x 6,19 cm x 20 cm)</td><td>Duro</td><td>18402</td><td></td></tr><tr><td>5424 Centrífuga para tubo de 2 mL</td><td>Eppendorf</td><td>22620461</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga para placa de 96 poços</td><td>Sigma4-16S</td><td>81510</td><td></td></tr><tr><td>Rotor de centrífuga para tubos de 50 mL</td><td>Sigma4-16S</td><td>12269 - Biosafe</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi DNA polimerase</td><td>Kapa Biosystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolamento e análise de comunidades microbianas na rizosfera, solo e raízes em experiências de grama perene

Isolation and Analysis of Microbial Communities in Soil, Rhizosphere, and Roots in Perennial Grass Experiments

Planta e solo microbiome estudos estão se tornando cada vez mais importantes para compreender que os microorganismos papéis desempenhar na produtividade agrícola. O objetivo deste manuscrito é fornecer detalhes sobre como rapidamente rizosfera, solo e endosphere de ensaios de campo replicados da amostra e analisar as mudanças que podem ocorrer em comunidades microbianas devido ao tipo de amostra, tratamento e genótipo da planta. O experimento usou para demonstrar esses métodos consiste em parcelas de campo replicada contendo dois, puro, morno-estação gramíneas (Panicum virgatum e Andropogon gerardii) e uma mistura de grama baixa diversidade (a. gerardii, Sorghastrum nutans, e Bouteloua curtipendula). Resumidamente, as plantas são escavadas, uma variedade de raízes são cortados e colocados em tampão fosfato e em seguida agitado para coletar a rizosfera. As raízes são trazidas para o laboratório no gelo e superfície sterilized com descorante e etanol (EtOH). A rizosfera é filtrada e concentrada por centrifugação. Solo escavado de em torno da esfera de raiz é colocado em sacos de plástico e trouxe para o laboratório onde uma pequena quantidade de solo é levada para extrações de DNA. DNA é extraído da rizosfera, solo e raízes e então amplificado com os primers para a região de V4 do gene 16S rRNA. Amplicons são sequenciados e, em seguida, analisados com ferramentas de Bioinformática de acesso aberto. Estes métodos permitem aos pesquisadores testar como a diversidade da comunidade microbiana e composição varia devido ao tipo de amostra, tratamento e genótipo da planta. Usando estes métodos juntamente com modelos estatísticos, os resultados representativos demonstram que existem diferenças significativas nas comunidades microbianas de raízes, rizosfera e solo. Métodos aqui apresentados fornecem um conjunto completo de etapas sobre como coletar amostras de campo, isolar, extrair, quantificar, amplificar e sequenciar o DNA e analisam a diversidade da comunidade microbiana e composição em ensaios de campo replicadas.

Os resultados representativos apresentados neste manuscrito vêm de um site de campo estabelecido em 2012, na Universidade de Nebraska-Lincoln agricultura pesquisa divisão fazenda perto de Mead, NE. antes do experimento, o site tinha sido gerenciados como uma rotação milho-soja . O local de estudo foi localizado em três diferentes tipos de solos, mas os dados foram analisados, como se todas as alterações nas propriedades do solo medida deveram-se a tratamentos impostos.
O site de campo continha dois, puro, carrinhos de "switchgrass" (p. virgatum cv Liberty) e bluestem grande (a. gerardii), bem como uma mistura de grama baixa diversidade contendo bluestem grande, indiangrass (S. nutans) e 'Butte' sideoats grama ( B. curtipendula). As três parcelas de grama morno-estação foram em um design de bloco completo estudo randomizado que era replicado três vezes. Aninhado em três parcelas diferentes de grama foram dois tratamentos de fertilização de nitrogênio (N), que foram 56 (N1) e 112 (N2) kg N ha-1 de ureia aplicada. No momento da amostragem microbiome no final da estação de crescimento, o nitrato de ppm (média ± DP) de 8,0 ± 1,1 solo contido nas tramas fertilizados com 112 kg N ha-1 e 6,8 ± 0,7 (média + SD) nitrato ppm nas tramas fertilizados com 56 kg N ha-1. As parcelas tinham sido fertilizadas uma vez por ano. A grama de morno-estação parcelas foram designadas como as parcelas principais (8000 m2) e N tratamentos foram as parcelas de separação (4000 m2). Bluestem grande foi semeada como uma mistura de 50: 50 de 'Bonanza' e 'Mina de ouro' e Indiangrass foi semeada como uma mistura de 50: 50 de 'Scout' e 'Guerreiro'. As parcelas foram plantadas em 2012, e a primeira aplicação de N ocorreu na primavera de 2013.
O solo e a amostragem de raiz foi realizado em 15 de setembro de 2014. O trabalho descrito abaixo foi realizado em um campo que foi criado como um divisão de pontos casualizado com três repetições (Figura 1). A profundidade média de sequenciamento de todas as amostras para endosphere foram os seguintes: 4871 ± 5711 (média ± DP), rizosfera: 40726 ± 14684, solo: 38184 ± 9043. Uma das maiores fontes de variação nesses experimentos, usando os métodos descritos, é a diferença em comunidades microbianas encontradas entre tipos de amostra (Figura 2). Neste conjunto de dados representativos, a rizosfera e solo parecem ser mais similar em composição ao outro do que o endosphere (Figura 2A). No entanto, havia também altamente significativa (p = 0,001) diferenças na composição da comunidade microbiana entre rizosfera e solo (Figura 2B). A variação total contabilizada nesses experimentos analisados por tipo de amostra foi de 26%.
Diversidade alfa análise mostrou que as comunidades microbianas no endosphere foram menores na diversidade da amostra em relação ao solo e da rizosfera (Figura 3). As diferenças significativas apenas na diversidade entre as espécies de grama em qualquer compartimento estavam entre as amostras de endosphere do bluestem grande e switchgrass, com switchgrass tendo significativamente maior diversidade de espécies microbianas (Figura 3). A análise de abundância relativa (Figura 4) destaca o domínio de Proteobacteria seguido de Actinobacteria em todos os tipos de amostra. Solo e da rizosfera também são dominadas por Acidobacteria e Chloroflexi Considerando que o endosphere tinha uma maior abundância relativa de Bacteriodetes.
Neste experimento, as plantas foram cultivadas com duas diferentes quantidades de fertilizante N e, portanto, foram analisados os dados para determinar se houve efeitos do tratamento. Efeitos do tratamento foram responsáveis por 12% da variação total, mas não foram significativamente diferentes, embora a ordenação dos dois tratamentos olhem diferente (Figura 5). Isto ressalta a importância de análises estatísticas para estes conjuntos de dados ao invés de inspeção visual ou julgamentos qualitativos.
Planta-influenciado diferenças na microbiome de tecidos vegetais e solo foram visualizadas usando um método restrito de ordenação. Diferenças estatísticas foram determinadas utilizando uma análise de TÁXONS para testar se as variáveis específicas, tais como espécie, resultam na composição da comunidade microbiana significativamente diferente entre as amostras. Quando todos os tipos de amostra foram analisados em conjunto, uma diferença altamente significativa foi encontrada na composição da comunidade microbiana devido a espécies de plantas (Figura 6). Neste experimento, a quantidade de variação explicada por espécies vegetais foi de 6,7%. Finalmente, cada tipo de amostra foi analisado individualmente para determinar qual dos tipos de amostra pode estar dirigindo o efeito de espécies de plantas significativas. Só no endosphere estava lá uma diferença altamente significativa (p = 0,001) entre as composições de comunidade microbiana de diferentes espécies de plantas (Figura 7). Nos outros tipos de amostra, o efeito das espécies não foi significativo quando analisados individualmente. Na endosphere, a variação percentual devido a espécie era 27%, Considerando que foi menor na rizosfera (18%) e no solo (15%). Isto ainda mais destaca a importância de analisar cada tipo de tecido individualmente.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig1.jpg"> Figura 1: exemplo do campo experimental design. Projeto de campo experimental, ilustrando um design de bloco completo estudo randomizado em triplicado do campo site localizado na Universidade de Nebraska-Lincoln Oriental Nebraska centro de pesquisa e extensão perto Mead, NE. Para Descrição completa do site, consulte a seção de resultados. N1 é a baixa (56 kg N ha-1 ureia) e N2 (112 kg N ha-1 ureia) é a taxa mais elevada de nitrogênio que foi aplicada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig2.jpg"> Figura 2: análise de diversidade Beta comparando a composição microbiana em tipos diferentes de amostra incluindo endosphere, rizosfera e solo da amostragem de grama perene em 2014. A análise foi realizada usando um script Python em QIIME1.9.1 para produzir a matriz de dissimilaridade Bray-Curtis. Análise de coordenadas principais (PCoA) com base na matriz de dissimilaridade Bray-Curtis foi visualizado em RStudio. PCoA1 e PCoA2 indicam a primeira e segunda maior variância explicada pela análise PCoA. TÁXONS análise estatística foi realizada para determinar o significado entre tipos de amostra, e o valor de p é mostrado no canto superior direito. Cada símbolo nas figuras representam toda a comunidade microbiana para cada amostra. (A) tipos de amostra Endosphere, rizosfera e solo foram analisados em conjunto. Todos os 87 amostras foram escasseadas de 486 sequências por amostra. (B) amostras de rizosfera e solo foram analisadas em conjunto. Todas as 59 amostras foram escasseadas com 8231 sequências. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig3.jpg"> Figura 3: análise de diversidade alfa usando o índice de Shannon para cada espécie na rizosfera, solo e endosphere. A análise foi realizada utilizando um script Python no QIIME1.9.1. Rarefação foi feita para o endosphere, rizosfera e tipos de amostra de solo respectivamente com 486, 17154 e 8231 sequências por amostra. Caixas indicam os percentis 25 e 75 (primeiros e terceiros quartis). A linha horizontal dentro da caixa denota a mediana e o vermelho, além disso, mostra a média. Bigodes mostram o intervalo de dados excluindo valores atípicos (que são mostrados como pontos pretos) que caiu mais de 1,5 vezes o intervalo interquartil (n = 6 para cada amostra, exceto para sideoats grama combinação onde n = 5). O índice de Shannon de todas as cinco espécies no endosphere eram inferiores a rizosfera e o solo. Não-paramétrico Wilcoxon teste de classificação soma foi utilizada para determinar a significância entre as espécies e somente as diferenças significativas entre as espécies foram mostradas em cima das caixas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig4.jpg"> Figura 4: abundância relativa ao nível de filo no endosphere, rizosfera, solo e. As amostras foram analisadas para comparar a abundância dos filos microbianas entre tipos diferentes de amostras (n = 29 para cada tipo de amostra). A análise foi realizada utilizando um script Python no QIIME1.9.1 da tabela OTU. As cores diferentes dentro do gráfico de pizza denotam os filos. A porcentagem indica a abundância relativa de cada filo em cada tipo de amostra. As informações de filo foi anotadas usando o projeto de banco de dados Ribosomal classificador (RDP)25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig5.jpg"> Figura 5: análise usando o tratamento como fator de restrição entre todos os tipos de amostra. Realizou-se análise canônica da análise de coordenadas principal (CAP) para determinar se houve diferenças na composição da comunidade microbiana entre os tratamentos. Para cada tratamento de N, n = 42 para N1 (56 kg N ha-1) e n = 45 para N2 (112 kg N ha-1). A matriz de dissimilaridade Bray-Curtis foi gerada usando um script python no QIIME1.9.1. Análise de CAP com base na matriz de dissimilaridade Bray-Curtis foi feito por restringir o tratamento como o fator em RStudio. Análise de TÁXONS foi realizada para determinar se as diferenças de tratamento foram significativas, e o valor de p é mostrado no canto superior direito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig6.jpg"> Figura 6: análise utilizando espécies vegetais como fator de restrição entre todos os tipos de amostra. Análise foi realizada para determinar se houve diferenças na composição microbiana Comunidade entre espécies de plantas em todos os tipos de amostra. Ordenação de coordenadas principal e CAP análise de todos os tipos de amostra (endosphere, rizosfera e solo) foram feitos usando uma matriz de dissimilaridade Bray-Curtis. A matriz de dissimilaridade Bray-Curtis foi gerada usando o script Python no QIIME1.9.1. Análise de CAP com base na matriz de dissimilaridade Bray-Curtis foi feito por restringir as espécies de plantas como o fator em RStudio. TÁXONS análise estatística foi realizada para determinar o significado entre espécies de plantas, e o valor de P é mostrado no canto superior direito. Cada símbolo nas figuras representa toda a comunidade microbiana para aquela amostra. n = 18 para cada espécie de todos os tipos de amostra, exceto n = 15 para a mistura de grama de sideoats. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57932/57932fig7.jpg"> Figura 7: exemplo de análise de CAP usando espécies como fator de restrição para cada tipo de amostra individualmente. Ordenação de coordenadas principal e análise de CAP de cada tipo de amostra (endosphere, rizosfera e solo) usando a matriz de dissimilaridade Bray-Curtis. Cada tipo de amostra foi escasseado 486, 17154 e 8231 leituras por amostra, respectivamente, em endosphere, rizosfera e solo. Espécie foi usado como o fator para restringir a ordenação. TÁXONS análise estatística foi realizada para determinar o significado entre espécies de plantas em cada tipo de amostra, e o valor de p é mostrado no canto superior direito. Cada símbolo na figura representa toda a comunidade microbiana para cada amostra. Tamanho da amostra é n = 29 para cada tipo de amostra, n = 6 para cada espécie de planta em cada tipo de amostra, exceto para a mistura de grama de sideoats (n = 5). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57932/57932fig7large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

Escavação de raízes de plantas do campo, bem como processamento de amostras em endosphere, rizosfera e solo são descritas em detalhes, incluindo os métodos de análise de dados e extração de DNA. Este papel é projetado para permitir que outros laboratórios de usar essas técnicas para o estudo do solo, endosphere e microbiomes da rizosfera.

Isolamento e análise de comunidades microbianas na rizosfera, solo e raízes em experiências de grama perene

Plant and soil microbiome studies are becoming increasingly important for understanding the roles microorganisms play in agricultural productivity. The ...

Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo do microbioma do solo, rizosfera e endosfera radicular, como como a diversidade da comunidade microbiana muda em resposta ao tipo de amostra, tratamento e genótipo da planta. A principal vantagem dessa técnica é que ela é adequada para experimentos de campo que exigem grande número de amostras e replicação. Demonstrando o procedimento estaremos eu e Stephanie Futrell, uma estudante de pós-graduação e técnica de pesquisa do meu laboratório.Para iniciar o protocolo, rotule uma bandeja de lavagem e um balde com uma nota adesiva com detalhes da amostra da planta. Leve o balde rotulado para a parcela e deixe a bandeja na estação de trabalho estabelecida no campo. Escolha e colete aleatoriamente duas plantas por parcela de diferentes áreas dentro da parcela.Em seguida, perfure o solo com uma pá a uma profundidade de 30 centímetros para cortar qualquer uma das raízes laterais que prendem a planta no solo. Escave as raízes das plantas aproveitando a pá e coloque a raiz no balde rotulado. Traga a caçamba de volta para a estação de trabalho no campo.Agite as raízes e use uma pá ou leme de mão para remover o solo das raízes. Use luvas e coloque as raízes perto da estação de processamento. Depois de sacudir as raízes, misture o solo na assadeira e quebre os torrões de solo com um leme manual.Coloque uma amostra de solo livre de detritos em um saco de armazenamento com zíper rotulado de 17,7 por 19,5 centímetros e coloque-o no gelo. Esterilize a tesoura de poda em etanol 70%. Use a tesoura estéril para extirpar uma variedade de raízes, aproximadamente quatro a seis raízes por planta e cada raiz com cerca de nove a 12 centímetros de comprimento.Coloque as raízes excisadas em um tubo rotulado de 50 mililitros contendo 35 mililitros de tampão fosfato autoclavado com um surfactante como Silwet L-77. Agite os tubos por dois minutos para liberar a rizosfera da superfície das raízes. Melhore a agitação com um gerador e vórtice.Com uma pinça esterilizada em etanol a 70%, remova as raízes do tubo, seque-as brevemente em papel toalha e coloque-as em um novo tubo rotulado de 50 mililitros. Coloque o tubo que contém a rizosfera e o que contém as raízes no gelo. Adicione aproximadamente 35 mililitros de 50% de alvejante mais 0,01% Tween 20 aos tubos de 50 mililitros com raízes coletadas no campo.Vortex ou agite os tubos por 30 a 60 segundos. Despeje o alvejante, adicione 35 mililitros de etanol a 70% e vortex ou agite as raízes por mais 30 a 60 segundos. Após agitar, despeje o etanol 70% e adicione 35 mililitros de água estéril e ultrapura e vórtice ou agite a amostra por um minuto.Repita a etapa de enxágue com água mais duas vezes para que a raiz receba um total de três enxágues com água estéril e ultrapura. Seque as raízes em toalhas de papel limpas e secas e use uma toalha de papel limpa para cada amostra. Usando uma pinça estéril e uma tesoura de poda, corte as raízes em pedaços de aproximadamente cinco milímetros e coloque as raízes cortadas em um tubo cônico limpo e rotulado de 15 mililitros e, em seguida, armazene as amostras a 80 graus Celsius negativos até que sejam processadas posteriormente.Agite os tubos de 50 mililitros contendo amostras da rizosfera do campo por 20 a 30 segundos para ressuspender toda a amostra. Usando um filtro de célula de malha estéril de 100 mícrons, filtre a amostra ressuspensa em um novo tubo de 50 mililitros. Em seguida, centrifugue os tubos a 3.000 vezes g por cinco minutos à temperatura ambiente.Despeje imediatamente e descarte o sobrenadante. Coloque os pellets da rizosfera nos tubos de 50 mililitros no gelo. Em seguida, adicione 1,5 mililitros de tampão fosfato estéril sem surfactante aos pellets da rizosfera e os vortex para ressuspender a amostra.Pipete o líquido suspenso em um tubo de microcentrífuga limpo e rotulado de dois mililitros. Gire os tubos a 15.871 vezes g por dois minutos em temperatura ambiente. Despeje imediatamente o sobrenadante e drene os tubos em toalhas de papel limpas.Armazene os pellets a menos 20 graus Celsius até que sejam processados novamente. Usando uma espátula de metal estéril, encha um tubo limpo e rotulado de dois mililitros com aproximadamente três gramas de solo para extração de DNA e evite pequenos pedaços de raiz e detritos. Enxágue a espátula de metal em etanol a 70% entre cada amostra.Armazene esta amostra de solo a menos 20 graus Celsius. Em uma panela limpa, esvazie o saco de terra em peneiras empilhadas com a peneira maior em cima da peneira menor e peneire manualmente a terra em ambas as peneiras. Use uma escova para limpar cuidadosamente as peneiras entre as amostras.Separe de 100 a 125 gramas de solo peneirado em um saco com zíper de 17,7 por 19,5 centímetros para futuras análises físico-químicas e de textura do solo. Coloque os sacos de terra a quatro graus Celsius para armazenamento de curto prazo. Em seguida, despeje nitrogênio líquido em um copo de plástico com espátulas limpas e em um almofariz limpo.Coloque o tecido congelado no almofariz e triture-o com o pilão até formar um pó fino. Adicione continuamente nitrogênio líquido durante a moagem para manter as amostras congeladas. Use uma espátula para transferir o tecido moído em um tubo limpo e rotulado de dois mililitros e, em seguida, armazene o tecido a 80 graus Celsius negativos.Limpe a área de trabalho com 70% de etanol e 1% de alvejante doméstico. Remova as amostras de solo do armazenamento de -20 graus Celsius e descongele-as em um balde de gelo. Remova a tampa da esteira de vedação de uma placa de extração de 96 poços e coloque a tampa entre dois lenços de papel para mantê-la limpa enquanto não estiver em uso.Cubra as 12 colunas da placa com tiras adesivas de PCR de 8 poços para evitar contaminação. Tara um funil de pesagem estéril e pequeno em uma balança e pesa 200 a 250 miligramas de solo. Levante cuidadosamente a fita adesiva, coloque o gargalo do funil de pesagem cheio no poço apropriado e guie suavemente a amostra de solo para o poço apropriado.Substitua a fita adesiva para cobrir o poço. Repita esse processo para cada poço, usando um novo funil estéril para cada amostra. Recoloque a tampa da esteira de vedação na placa de extração e armazene a placa a menos 20 graus Celsius até que esteja pronta para a extração de DNA.Remova as amostras da rizosfera do armazenamento de 20 graus Celsius negativos e descongele em um balde de gelo. Prepare a placa de extração de DNA como feito na seção anterior. Coloque um lenço de papel limpo em uma balança e, em seguida, tara uma espátula de metal estéril na balança.Use a espátula para retirar cuidadosamente um pouco do pellet da rizosfera de um tubo de amostra. Pesar entre 200 e 250 miligramas da amostra da rizosfera. Levante cuidadosamente a fita adesiva para descobrir o primeiro poço da placa de extração.Incline a espátula cheia no poço e raspe o material da rizosfera no poço apropriado com um palito de dente estéril. Enxágue a espátula de metal em água seguida de etanol a 70% entre as amostras. Por fim, repita esse processo para cada poço da placa até que a placa esteja cheia, deixando um poço vazio como controle de extração.Neste conjunto de dados representativos, houve diferenças altamente significativas entre os tipos de amostra, e a rizosfera e o solo parecem ser mais semelhantes em composição entre si do que a raiz. Uma análise mais aprofundada mostra que também houve diferenças altamente significativas na composição da comunidade microbiana entre a rizosfera e o solo. A análise da diversidade alfa mostra que as comunidades microbianas na endosfera foram menores do que as comunidades no solo e na rizosfera.A única diferença significativa na diversidade entre as espécies de gramíneas foi entre as amostras da endosfera de grande caule azul e switchgrass. A análise de abundância relativa destaca a dominância de Proteobacteria seguidas por Actinobacteria em todos os tipos de amostra. O solo e a rizosfera são dominados por Acidobacteria e Chloroflexi, enquanto as raízes apresentaram maior abundância relativa de Bacteriodetes.A análise PERMANOVA de todos os tipos de amostra elucidou uma diferença altamente significativa na composição da comunidade microbiana devido às espécies de plantas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como executar uma série de etapas para usar no estudo dos microbiomas do solo, endosfera e rizosfera. Gostaríamos de agradecer ao Nebraska EPSCoR e à National Science Foundation EPSCoR Research Infrastructure Program Track 1 pelo financiamento parcial deste vídeo educacional.

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Ambiente

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Compreender o papel da heterogeneidade ambiental em coexistência espécie tem geralmente focada em tipos de heterogeneidade que são extrínsecos à composição de espécies da comunidade. Nós fornecemos novos métodos detalhados para a criação de tratamentos de heterogeneidade do solo utilizando solos sujeitos ao feedback condicionado planta-solo, ou heterogeneidade intrínseca à composição da comunidade.

Protocolo experimental para indução-Plant Manipulando heterogeneidade do solo

O artigo descreve um método que aumenta o rendimento enquanto equilibra esforço e precisão para a extração de lipídios das membranas celulares de microorganismos para uso na caracterização de lipídios totais e abundância relativa de lípidos indicadores para determinar a estrutura da comunidade microbiana do solo em estudos com muitas amostras.

Um método de extração e análise de lipídios para caracterizar micróbios de solo em experimentos com muitas amostras

Aqui, descrevemos um protocolo para obter dados de sequência de amplicons da rizosfera, solo e raiz endosphere microbiomes. Esta informação pode ser usada para investigar a composição e diversidade de comunidades microbianas associadas a planta e é apropriada para o uso com uma ampla gama de espécies de plantas.

Explorando o microbioma da raiz: extraindo dados da comunidade bacteriana do solo

Aqui nós descrevemos um ensaio hidropônico do crescimento de planta para quantificar a presença da espécie e para visualizar a distribuição espacial das bactérias durante a colonização inicial de raizes de planta e após sua transferência em ambientes diferentes do crescimento.

Monitoramento de colonização bacteriana e manutenção em raízes de Arabidopsis Arabidopsis thaliana em um sistema hidropônico flutuante

Descrevemos um protocolo para amostrar, preservar e seção de raízes intactas e o solo circundante da rizosfera de ambientes pantanosos usando arroz(Oryza sativa L.) como espécie modelo. Uma vez preservada, a amostra pode ser analisada utilizando técnicas de imagem elementar, como a fluorescência química de raios-X síncrotron (XRF).

Um método para preservar raízes úmidas e rizosferas para imagem elementar

Os produtos à base de glifosato (GBP) são os herbicidas de amplo espectro mais comuns em todo o mundo. Neste artigo, introduzimos diretrizes gerais para quantificar o efeito do GBP nos microbiomas, desde experimentos de campo até análises bioinformáticas.

Quantificação do impacto potencial dos produtos à base de glifosato em microbiomas

Colônias fúngicas entomopatômicas são isoladas de amostras de solo tropical usando isca tenebrio , isca de Galleria , bem como meio artificial seletivo, ou seja, ágar de dextrose de batata enriquecido com extrato de levedura suplementado com clorofenicol, tiaabzolendae e ciclohexmida (meio CTC).

Comparação de métodos para isolar fungos entomopatômicos de amostras de solo

Este protocolo apresenta um resumo detalhado das estratégias para inocular raízes vegetais com micróbios transportados pelo solo. Exemplificados para os fungos Verticillium longisporum e Verticillium dahliae, três diferentes sistemas de infecção radicular são descritos. Potenciais aplicações e possíveis análises a jusante são destacadas, e vantagens ou desvantagens são discutidas para cada sistema.

Estratégias de inoculação para infectar raízes vegetais com microrganismos transportados pelo solo

Um procedimento rápido e padronizado para estabelecer comunidades sinérgicas de biofilmes multiespécies de vários solos da rizosfera é apresentado aqui. É um protocolo único projetado para sondar e simular a complexa microbiota do solo da rizosfera.

Uma abordagem para a construção de comunidades de biofilme multiespécies a partir do solo da rizosfera

Aqui apresentamos um estudo estabelecido no iDiv Ecotron, câmaras de mesocosmo terrestre com condições ambientais controladas acima e abaixo do solo, para estudar os efeitos independentes e interativos da história da planta e da história do solo no funcionamento do ecossistema de comunidades de pastagens ao longo de um gradiente de diversidade de plantas.

JenaTron - Uma abordagem experimental para estudar os efeitos da história da planta e do solo no funcionamento do ecossistema de pastagens

Aprenda métodos padronizados para isolar e analisar comunidades microbianas da rizosfera, solo e raízes em experimentos de campo com gramíneas perenes. Estas técnicas garantem resultados reproduzíveis em ecologia microbiana.

Isolamento e análise de comunidades microbianas na rizosfera, solo e raízes em experiências de grama perene

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