Diferença de potencial nasal para quantificar o transporte do íon Trans-epitelial em ratos
4 de julho de 2018
Aqui, apresentamos um protocolo para medir a diferença de potencial nasal em ratos. O teste quantifica a função de transportadores transmembrana de íons como o regulador de condutância transmembranar de fibrose cística e o canal de sódio epitelial. É valioso para avaliar a eficácia de novas terapias para a fibrose cística.
A diferença de potencial nasal é um método valioso para caracterizar o fenótipo de camundongos transgênicos modelando fibrose cística. Permite a investigação da eficácia de novos tipos de terapias para a fibrose cística. As principais vantagens da técnica são que ela fornece medições confiáveis em camundongos reprodutores contínuos.
Reduz a mortalidade relacionada e permite repetir o teste no mesmo animal. Para preparar o cateter nasal de duplo lúmen, mantenha o meio de um tubo de polietileno de 20 centímetros de comprimento na chama por cerca de 10 a 15 segundos até que esteja macio o suficiente para puxar. Em seguida, afaste as duas extremidades para obter um tubo capilar muito fino de cerca de 15 centímetros de comprimento e um diâmetro externo de 0,1 milímetros para a sonda nasal.
Em seguida, limpe e desengordure os dois capilares com etanol puro. Junte-os com fita adesiva e cole-os com cola de cianoacrilato. Corte o excesso de comprimento das sondas com uma lâmina de barbear para obter o cateter de duplo lúmen de cerca de oito centímetros de comprimento.
Em seguida, injete água através de ambos os lúmens para verificar se eles são permeáveis e faça uma marca a uma distância de cinco milímetros da ponta. Em seguida, prepare uma mistura de creme misturando o creme eletrolítico e a solução saturada de potássio de três molares na proporção de um para um, evitando a formação de pequenas bolhas de ar. Para a configuração experimental, para evitar hipotermia durante e após o teste, use duas almofadas de aquecimento, uma para a configuração de medição e outra para a caixa em que o animal será colocado para recuperação no final do teste.
Ligue o computador, que está conectado à memória de dados de alta impedância de entrada e voltímetro de alta resolução. Em seguida, abra o software para captura de dados. Conecte os eletrodos ao voltímetro.
Mergulhe a ponta dos eletrodos juntos na mistura de creme. Verifique o valor inicial do deslocamento do eletrodo e rejeite os eletrodos se o valor for maior que mais ou menos dois milivolts. Em seguida, ligue a bomba peristáltica e insira o tubo da bomba no lúmen de perfusão do cateter nasal.
Encha um lúmen do cateter nasal com mistura de creme eletrolítico através de uma ponta de pipeta de 10 microlitros. Adapte o cateter a um conector de tubo de silicone e encha o conector com a mistura de creme. Em seguida, insira o eletrodo positivo no conector.
Verifique o valor de deslocamento da ponte do eletrodo de medição e rejeite as pontes se o valor for maior que mais ou menos dois milivolts. Em seguida, conecte a saída proximal do tubo da bomba ao frasco contendo a solução selecionada para perfusão nasal. Em seguida, conecte a saída distal do tubo da bomba ao lúmen de perfusão do cateter nasal.
Em seguida, preencha o segundo lúmen do cateter nasal com solução nova A1. Mergulhe a ponta do cateter nasal no frasco para injetáveis que contém a solução A. Inverta a direção da bomba peristáltica para preencher o comprimento do cateter nasal correspondente a 10 segundos de perfusão. Em seguida, dobre uma folha de tecido absorvente para fazer um travesseiro de três centímetros de largura que será usado como suporte para a cabeça do rato. Cubra a almofada de aquecimento com a folha de tecido absorvente.
Em seguida, coloque o mouse de costas na almofada de aquecimento e prenda os membros e a cauda na almofada. Em seguida, insira o cateter intravenoso de referência no espaço subcutâneo de um membro posterior. Remova a agulha e adapte-se ao conector do tubo de silicone.
Encha o cateter e o conector com a mistura de creme. Em seguida, conecte o eletrodo de medição positivo ao cateter nasal e o eletrodo de referência negativo ao cateter inserido no espaço subcutâneo no membro posterior do animal. Em seguida, fixe o cateter e o eletrodo com fita adesiva conforme necessário para evitar qualquer deslocamento.
Depois de colocar o eletrodo de referência e as pontes, verifique o valor de deslocamento da ponte do eletrodo de medição novamente mergulhando a ponta do cateter nasal na mistura de creme de eletrodo dentro do conector do cateter IV. Registre o valor de deslocamento final estável. Agora, fixe as orelhas do rato com fita adesiva na almofada de aquecimento em um espaço livre entre os dois pedaços de tecido absorvente.
Fixe a vibração sem tocar nos olhos. Para absorver o fluido da cavidade oral, mova a língua para o lado e insira um pavio pontiagudo de papel de filtro cerca de um centímetro na boca. Para absorver o fluido que sai da narina perfundida, coloque um segundo pedaço de papel de filtro no toi do nariz.
Verifique o valor de controle positivo do potencial epitelial colocando a ponta do cateter nasal na parte interna da boca. Segurando-o com uma pinça fina e sob boa iluminação direta, introduza delicadamente o cateter nasal em uma narina, até quatro a seis milímetros da ponta do nariz. Cinco minutos após injetar os anestésicos, incline suavemente a almofada de aquecimento em cerca de 30 graus com a cabeça do animal para baixo.
Monitore o valor máximo de PD basal. Quando estiver estável por mais de 30 segundos, comece a perfundir a mucosa nasal a 10 microlitros por minuto com as quatro soluções tamponadas em sucessão. Perfunda a primeira solução por 10 segundos e cada solução seguinte por cinco minutos ou até que uma tensão estável seja atingida.
Pare de perfundir Forskolin quando a resposta transitória de Forskolin começar a diminuir. Após a avaliação, solte o mouse da almofada de aquecimento. Administre-o com a mistura de antagonistas anestésicos e transfira-o para a caixa de recuperação com almofada de aquecimento até a recuperação total.
Aqui estão os traçados representativos da DP nasal de um camundongo homozigoto normal e um homozigoto de camundongo para a mutação CFTR de deleção F508, juntamente com os valores individuais obtidos para os parâmetros de DP nasal. A resposta amilorida é a diferença entre os valores de DP nasal no final e no início da perfusão da mucosa nasal com solução salina tamponada basal contendo amilorida. A resposta livre de cloreto é a diferença entre os valores de DP nasal no final e no início da perfusão da mucosa nasal com solução salina tamponada sem cloreto, mais amilorida.
A resposta da forscolina é a diferença entre os valores da DP nasal no final e no início da perfusão da mucosa nasal com solução salina tamponada livre de cloreto, mais forscolina e amilorida. A resposta total ao cloreto é a soma dos dois últimos parâmetros obtidos sob perfusão zero de cloreto. O projeto pode ser usado para explorar, fornecer os desertores de transporte no camundongo, mas também no pirralho, no grande e no modelo de fibrose cística do furão.
E desertores de transporte de sódio no modelo de camundongo eunuco. Todos os transportadores podem ser estudados adotando o protocolo. Trabalhar na cavidade nasal de roedores é extremamente delicado devido à parede essencial de entradas sensoriais da região facial nasal.
A morte adequada da anestesia é particularmente desafiadora ao operar na cavidade nasal do camundongo.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para medir a diferença de potencial nasal em camundongos, que quantifica a função dos transportadores iônicos transmembrana. O método é particularmente útil para avaliar terapias inovadoras para a fibrose cística.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia
- Modelos Transgênicos
Contexto
- A diferença de potencial nasal é um método para caracterizar camundongos transgênicos.
- É útil para avaliar a eficácia de novas terapias para fibrose cística.
- A técnica é vantajosa para camundongos em reprodução contínua.
- Minimiza a mortalidade associada e permite testes repetidos no mesmo animal.
Objetivo do Estudo
- Medir a diferença de potencial nasal em camundongos.
- Avaliar a função de transportadores iônicos como CFTR e ENaC.
- Avaliar a eficácia de novos tratamentos para fibrose cística.
Métodos Utilizados
- Preparação de um cateter nasal de duplo lúmen.
- Medição da diferença de potencial nasal em camundongos transgênicos.
- Avaliação da função do transportador iônico.
- Avaliação da eficácia da terapia.
Resultados Principais
- Medições confiáveis obtidas de camundongos com reprodução contínua.
- Redução da mortalidade relacionada aos procedimentos de teste.
- Capacidade de repetir testes no mesmo animal.
- Compreensão da eficácia de novas terapias para fibrose cística.
Conclusões
- A diferença de potencial nasal é um método valioso para a pesquisa da fibrose cística.
- O protocolo aumenta a confiabilidade das medições em modelos de camundongos.
- Essa técnica auxilia no desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
A medição da diferença de potencial nasal (DPN) em camundongos fornece uma leitura funcional do transporte iônico transepitelial, permitindo a avaliação pré-clínica de terapias para fibrose cística (FC). Ao quantificar a atividade de CFTR e ENaC in vivo, o método auxilia na validação de alvos e na redução de riscos mecanicistas na fase inicial de descoberta. A realização de testes repetidos no mesmo animal reduz a variabilidade e melhora a confiança preditiva para decisões de avanço ou interrupção no desenvolvimento de terapias para FC.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêutica
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Valor Científico: Analisa hipóteses terapêuticas mediante a medição do transporte funcional de cloreto e sódio em modelos de camundongos com fibrose cística.
- Valor Operacional: Permite a desmistificação biológica de moduladores do CFTR por meio do fenotipagem direta do transporte iônico.
- Valor Científico: Apoia a confiança preditiva ao discriminar fenótipos de fibrose cística de fenótipos selvagens por meio das respostas à amilorida, ausência de cloreto e forskolina.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Valor Científico: Prepara sistemas biológicos validados para padronização de ensaios utilizando cateteres nasais de duplo lúmen e perfusão controlada.
- Valor Operacional: Garante reprodutibilidade por meio da verificação estável do deslocamento do eletrodo e protocolos consistentes de perfusão de soluções.
- Valor Científico: Permite avaliação confiável de compostos mediante a medição das respostas dos transportadores iônicos a soluções de amilorida, sem cloro e com forskolina.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Valor Científico: Mantém a relevância para a doença ao quantificar defeitos funcionais nos transportadores CFTR e ENaC em camundongos que respiram espontaneamente.
- Valor Operacional: Apoia a continuidade translacional ao permitir múltiplos testes por animal, reduzindo a variabilidade entre animais.
- Valor Científico: Informa decisões de avanço ajustadas ao risco ao fornecer traçados farmacodinâmicos quantitativos que se correlacionam com o genótipo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
O método NPD se integra ao continuum de descoberta, desde a validação do alvo até a avaliação pré-clínica, fornecendo dados funcionais de transporte iônico que orientam as avaliações de eficácia terapêutica.
- Biologia da Descoberta: Apoia a verificação de hipóteses mediante a medição de diferenças potenciais nasais basais e estimuladas em camundongos transgênicos.
- Triagem: Garante prontidão para ensaios por meio da perfusão padronizada de soluções tamponadas e leituras estáveis de voltagem.
- Análises: Gera medições quantitativas de variáveis dependentes (resposta à amilorida, resposta sem cloreto, resposta à forskolina, resposta total de cloreto) para comparação entre condições.
- Pesquisa Translacional: Conecta-se à continuidade pré-clínica ao permitir testes repetidos no mesmo animal para monitorar efeitos terapêuticos longitudinais.
- Reutilização Corporativa: Funciona como uma capacidade reutilizável para a caracterização de modelos de FC em múltiplas iterações terapêuticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Confiança preditiva na validação de alvos por meio do fenotipagem quantitativa do transporte iônico.
- Valor Operacional: Padronização e reprodutibilidade por meio da preparação do cateter, calibração do eletrodo e controles de perfusão.
- Valor Estratégico: Tomadas de decisão mais precisas sobre avançar ou não avançar, reduzindo a ambiguidade mecanicista na eficácia de moduladores de CFTR e ENaC.
- Impacto no Portfólio: Priorização ajustada ao risco com base na correção funcional de defeitos de transporte em modelos pré-clínicos.
Considerações de Implementação
- Experiência no manejo da anestesia em roedores e nas técnicas de cateterização nasal.
- Instrumentação incluindo voltímetro de alta impedância, bomba peristáltica e placas aquecidas com controle de temperatura.
- Padronização entre equipes na preparação de soluções, verificação do deslocamento do eletrodo e no tempo de perfusão.
- Considerações sobre adaptações para diferentes linhagens de roedores e modelos de mutação do CFTR.
- Limitações práticas incluem a delicadeza cirúrgica necessária para o acesso à cavidade nasal e a otimização da profundidade da anestesia para prevenir broncoaspiração.
