Name: Diferença de potencial nasal para quantificar o transporte do íon Trans-epitelial em ratos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Aprenda a medir a diferença de potencial nasal em camundongos transgênicos para avaliar o transporte de íons CFTR e ENaC. Este método reduz a mortalidade e permite testes repetidos no mesmo animal.

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Os autores Agradecemos a Prof J. Lebacq edição criticamente o manuscrito. CFTRtm1Eur (homozigotos ratos F508del-CFTR (FVB/129) foram desenvolvidos por Erasmus MC, Rotterdam, Países Baixos, com o apoio da Comunidade Económica Europeia acção de Coordenação Europeia para a investigação no 6º PQ UE de fibrose cística LHHM-CT-2005-018932.

Os estudos e procedimentos foram aprovados pelo Comitê de ética para pesquisas com animais da UCL (2017/UCL/MD/015) e de acordo com as normas da Comunidade Europeia para uso de animais na pesquisa (CEE n º 86/609). Os investigadores estão qualificados para a experimentação animal, seguindo a Directiva 2010/63/UE do Parlamento Europeu e do Conselho, de 22 de setembro de 2010, relativa à protecção dos animais utilizados para fins científicos.
1. pré-teste de avaliação e gestão
<ol><li>Prepare o cateter nasal de duplo lúmen. Nota: Um cateter nasal é feito como um tubo de duplo lúmen capilar, um lúmen sendo usado para a perfusão contínua de soluções, e o outro como uma medida do canal.<ol>
<li>Aquecer a seção central de uma parte, cerca de 20 cm de comprimento, de tubo de polietileno (2,0 mm de diâmetro interno; 3,0 mm de diâmetro externo; Figura 1 uma) na chama de um queimador de gás até que é macio o suficiente para puxar (10-15 s).</li>
		<li>Separe as duas extremidades para obter um tubo capilar fino de comprimento adequado (~ 15 cm) e (~0.1 mm) de diâmetro externo para a sonda nasal (Figura 1b).</li>
		<li>Limpar e desengordurar dois tais capilares com etanol puro, juntá-los com fita (Figura 1c) e cola-los juntos usando cola de cianoacrilato.</li>
		<li>Corte o excesso de comprimento das sondas com uma lâmina de barbear ou um bisturi para obter um comprimento ideal do cateter de lúmen duplo de cerca de 8 cm (Figura 1d).</li>
		<li>Injete água através de ambos os lúmens para verificar se eles são permeáveis.</li>
		<li>Aplica uma marca a uma distância de 5 mm da ponta. Nota: A sonda é introduzida até a marca na narina, para que todas as medições são feitas no mesmo local no interior da cavidade nasal.</li>
		<li>Armazene o cateter de lúmen duplo em uma caixa seca. Nota: Pode ser usado de 6 - 10 vezes se adequadamente limpa imediatamente após o teste.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prepare a mistura de creme.<ol>
<li>Misture suavemente o creme do eletrólito e 3M KCl solução saturada em uma proporção de 1:1 (volumétrica), evitando a formação de pequenas bolhas de ar. Nota: A mistura de creme é usada para construir as pontes do eletrodo para a medição e a referência Ag/AgCl eletrodos, conforme ilustrado na Figura 1.</li>
	</ol>
</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig1.jpg"> Figura 1 : Sondas com eletrodos e pontes. A figura ilustra o tubo de polietileno, antes (a) e após o aquecimento e puxando (b), a fita se juntar as duas partes capilares (c) do cateter de duplo lúmen (d), os conectores de tubo de silicone (e) e os eletrodos (f). Para clareza de imagem, os conectores não foram preenchidos com a mistura de creme. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig1large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Rótulo de solução</td>
			<td>Descrição da solução</td>
		</tr>
<tr>
<td>A</td>
			<td>Solução salina tamponada basal</td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>Livre de cloreto de sal solução tampão</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>Solução-mãe de amilorida 10-2 M</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>Solução 10-3 M forskolina</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Solução de estoque para o teste de PD nasal em ratos.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Sal</td>
			<td>mM</td>
			<td>Peso molecular</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloreto de sódio (NaCl)</td>
			<td>135</td>
			<td>58.44</td>
			<td>7.889</td>
		</tr>
<tr>
<td>Cloreto de cálcio dihidratado (CaCl2.2h2O)</td>
			<td>2.25</td>
			<td>147</td>
			<td>0.331</td>
		</tr>
<tr>
<td>Hexaidrato do cloreto de magnésio (MgCl2.6h2O)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>203.3</td>
			<td>0.244</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fosfato dipotássico (K2HPO4)</td>
			<td>2.4</td>
			<td>174.2</td>
			<td>0.418</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fosfato monopotássico (KH2PO4)</td>
			<td>0.4</td>
			<td>136,1</td>
			<td>0.054</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Composição de basal em buffer solução salina (solução estoque A).
<ol start="3"><li>Prepare as soluções.<ol>
<li>Prepare as quatro soluções estoque necessárias para o protocolo experimental (tabela 1).<ol>
<li>Preparar a solução tamponada basal (solução A; Tabela 2) e a cloreto livre solução tamponada (solução B; Tabela 3) misturando os sais na água pura, à temperatura ambiente. Ajuste o pH para 7,4 (gama 7,0-7,6) usando 1 N NaOH para elevar o pH, 1 N HCl para pH inferior. Verifique a osmolaridade da solução (275 mOsm/L).</li>
			<li>Armazene em garrafas de vidro rotulado a 4 ° C por até 3 meses ou congelados em garrafas de plástico por até 6 meses.</li>
			<li>Prepare a solução de amilorida 10-2 M (solução C) adicionando 26,6 mg de cloridrato de amilorida a 10 mL de água pura. Aquecer a mistura durante 5 a 10 minutos a 70 ° C. Como amilorida é sensível à luz, manter a solução C em um recipiente escuro. Rotular o recipiente e armazenar em 4 ° C por até 3 meses.</li>
			<li>Prepare a solução de forskolina 10-3 M (solução estoque D) pela adição de 10 mg de forskolina 24,36 ml de água pura. Rotular a alíquotas de 0,1 mL da solução-mãe forskolin e armazenar a-20 ° C por até 6 meses.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Preparar soluções novas, A1, B1 e B2 (tabela 4).<ol>
<li>Preparar a solução fresca A1 (solução salina tamponada basal além de 10-4 M amilorida) obtendo 10 mL da solução de sal basal (solução estoque A) e adicionar 0,1 mL de solução de amilorida 10-2 M (solução C). Rotular o recipiente e usar dentro de 24 horas de preparação.</li>
		<li>Preparar a solução fresca B1 (cloreto de tampão solução além de 10-4 M amilorida) obtendo 10 mL de solução salina tamponada cloreto livre (solução B) e adicionar 0,1 mL de solução de amilorida 10-2 M (solução C). Rotular o recipiente e usar dentro de 24 horas de preparação.</li>
		<li>Preparar a solução fresca B2 (solução salina tamponada cloreto livre além de 10-4 M amilorida e 10-5 M forskolina) obtendo 10 mL de solução salina tamponada cloreto livre (solução B) e adição de 0,1 mL de 10-2 M solução de amilorida (solução C) e 0,1 mL de solução de forskolina 10-3 M (solução estoque D). Rotular o recipiente e usar dentro de 2 horas de preparação.</li>
	</ol>
</li>
</ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Sal</td>
			<td>mM</td>
			<td>Peso molecular</td>
			<td>g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gluconato de sódio (sal monossódico)</td>
			<td>135</td>
			<td>218,1</td>
			<td>29.444</td>
		</tr>
<tr>
<td>Gluconato de cálcio (pó anidro)</td>
			<td>2.2</td>
			<td>430.4</td>
			<td>0,947</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sulfato de magnésio hepta-hidratado (MgCl2.6h2O)</td>
			<td>1.2</td>
			<td>246.5</td>
			<td>0,296</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fosfato dipotássico (K2HPO4)</td>
			<td>2.4</td>
			<td>174.2</td>
			<td>0.418</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fosfato monopotássico (KH2PO4)</td>
			<td>0.4</td>
			<td>136,1</td>
			<td>0.054</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 3: Composição de cloreto livre solução (solução B) tampão.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig2.jpg"> Figura 2 : Posição do mouse durante a perfusão da mucosa nasal. A figura ilustra a almofada de aquecimento (a), o voltímetro (b), o eletrodo de referência inserido no espaço subcutâneo em um membro posterior (c), o proximal (d) e a distal (e) da bomba peristáltica, o travesseiro (f), e a cama da folha (g). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
2. avaliação e gestão durante o teste
<ol><li>Prepare a instalação experimental.<ol>
<li>Para evitar a hipotermia durante e após o teste, use duas almofadas de aquecimento, mantidas em temperaturas fisiológicas, um para a instalação de medição (18,8 x 37.5 cm; Figura 2 um) e o outro (15,5 x 15,5 cm) para a caixa em que o animal será colocado para recuperação no final do teste.</li>
		<li>Ligue o computador carregado com o software de captura de dados conectado a impedância de entrada alta com memória de dados (&gt; 1012Ω) e alta resolução (0.1 mV) voltímetro (Figura 2b).</li>
		<li>Conecte os eletrodos para o voltímetro. Conecte o eletrodo positivo de medição para o cateter nasal e o eletrodo de referência negativa ao cateter inserido no espaço subcutâneo em um membro posterior, conforme mostrado na Figura 2c.</li>
		<li>Mergulhe as pontas dos eletrodos juntos no mix creme. Verifique o valor de deslocamento inicial do eletrodo. Rejeitar os eletrodos se o valor for maior que (±) 2 mV (idealmente 0 mV).</li>
		<li>Ligue a bomba peristáltica e introduza o tubo de bomba na posição, conforme ilustrado na Figura 2.</li>
		<li>Conecte a saída de proximal do tubo da bomba para o frasco contendo a solução selecionada por perfusão nasal (Figura 2d). Conecte a saída de distal do tubo da bomba ao lúmen do cateter nasal (Figura 2e) de perfusão.</li>
		<li>Preencha um lúmen do cateter nasal com a mistura de creme de eletrólito através de uma ponta de pipeta de 10 µ l. Adaptar o cateter a um conector de tubo de silicone (Figura 1e), preencher o conector com a mistura de creme e inserir o eletrodo positivo no conector (Figura 1f). Verifique o valor de deslocamento de ponte medição eletrodo. Rejeitar as pontes, se o valor for maior que (±) 2 mV (idealmente 0 mV).</li>
		<li>Encha o segundo lúmen do cateter nasal com a solução fresca A1. Mergulhe a ponta do cateter nasal no frasco contendo solução r. inverter a direção da bomba peristáltica para preencher um comprimento do cateter nasal correspondente a 10 s de perfusão. Nota: Isto permite gravar valores basais de PD para 10 s antes de aplicar a amilorida. Mergulhe a ponta do cateter nasal no mix creme dentro do conector do eléctrodo de referência (Figura 1).</li>
	</ol></li>
	<li>Começa a lidar com o mouse.<ol>
<li>Registro do peso do mouse para calcular a dose exata de anestésicos a ser injetada por via intraperitoneal (ip)17.</li>
		<li>Usando uma agulha 26G (0.45 x 10 mm), injetar pré-medicação intraperitonealmente para promover a indução da anestesia: uma dose fixa de 50 µ l de midazolam 5mg/mL. Espere por 5 min.</li>
		<li>Preparar a mistura anestésica (fentanil, medetomidina, droperidol em concentrações finais de 0.05 0.40 e 20 mg/kg peso corporal respectivamente e Clonidina na dose fixa de 0,375 µ g) permitindo profundidade ideal e estável da anestesia (estágio III, avião 2)17 . Injetar o volume da mistura anestésica intraperitonealmente e em seguida, injetar o volume de Clonidina. Nota: Depois de 15 min, o mouse deve estar dormindo e a anestesia pode durar pelo menos 30 min.</li>
		<li>Dobre uma folha de tecido para fazer um 3 cm Largura 'almofada' (Figura 2f) que irá cobrir a parte superior da almofada do aquecimento (Figura 2um) como apoio para a cabeça de rato de absorção.</li>
		<li>Cobrir a compressa com uma folha de absorver o tecido ('lençol'; Figura 2 g). colocar o mouse sobre as costas da almofada de aquecimento. Fita para fora os membros e a cauda (Figura 2).</li>
		<li>Inserir o cateter intravenoso de referência (Figura 1g) no espaço subcutâneo de um membro posterior. Retire a agulha e adaptar o conector do tubo de silicone (Figura 1e, 2C).</li>
		<li>Encha o cateter e o conector com creme misturar e inserir o elétrodo negativo do conector (Figura 1f).</li>
		<li>Fixe o cateter e o eletrodo com fita conforme o necessário para impedir qualquer deslocamento. Após a colocação do eletrodo de referência e pontes, verifique se o valor de deslocamento de ponte medição eletrodo novamente mergulhando a ponta do cateter nasal no mix creme eletrodo dentro do conector do cateter IV. Registre o valor de deslocamento final estável (idealmente menos (±) 2 mV).</li>
		<li>Ajeite o mouse orelhas com fita "suave" na plataforma de aquecimento em um espaço livre entre as duas peças do absorvente de tecido ('almofada' (Figura 2f) e 'lençol'; (Figura 2g)). Corrigi o vibrissae (os pelos rígidos crescendo perto das narinas) sem tocar os olhos.</li>
		<li>Para absorver o líquido da cavidade oral, mover a língua para os lados (Figura 3uma) e insira um pavio aguçado de papel de filtro (o ' pipe'; Figura 3 b) cerca de 1 cm na boca. Para absorver fluido esgotar a narina perfundida, coloque um segundo pedaço de papel de filtro (o ' lenço'; Figura 3 c) realizada na ponta do nariz.</li>
		<li>Verificar um valor de controle positivo do potencial epitelial, colocando a ponta do cateter nasal, em contacto com o interior da boca. Nota: A leitura deve ser estável e intervalo entre -10 mV e -20 mV.</li>
		<li>Segurando-o com a pinça fina e sob boa iluminação direta, delicadamente Introduza o cateter nasal em uma das narinas até 4 - 6 mm do nariz de ponta. Nota: O cateter nasal de PD situa-se na concha nasal média na posição que dá a linha de base estável máxima PD valor17,20.</li>
		<li>5 min após a injeção de drogas anestésicas, inclinar suavemente a bolsa de água quente por cerca de 30° com a cabeça do animal para baixo. Monitore o máximo valor basal do PD.</li>
		<li>Quando é estável durante um período de cerca de 30 s, iniciar perfusing a mucosa nasal, a uma taxa constante de 10 µ l / min, com as 4 soluções tamponadas (A, A1, B1, B2) em sucessão. Perfundir a primeira solução (etapa 1.3.1.1) por 10 s e cada solução seguinte (etapa 1.4) por 5 min ou até que se chegou a um valor estável. Pare perfusing forskolin (B2) quando a resposta transiente forskolin começa a descer.</li>
		<li>Selecione um 1 intervalo de s para gravação de dados. Inicie a gravação de dados no momento do início da perfusão. Exibir dados em função do tempo na tela do computador.</li>
		<li>Captura de dados parar ao final da perfusão com solução de B2. Salve os dados como um arquivo de planilha.</li>
		<li>Dados corretos, subtraindo o valor de deslocamento final.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57934/57934fig3.jpg"> Figura 3 : Posição do mouse sobre a almofada de aquecimento com o cateter nasal e os papéis de filtro no local. A figura ilustra a língua colocar lateral (a), a tubulação (b) e o lenço (c). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57934/57934fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
3. pós-teste de avaliação e gestão
<ol><li>Solte o mouse do aquecimento pad.</li>
	<li>Limpar o nariz do mouse com o 'lençol' (Figura 2g).</li>
	<li>Injete intraperitonealmente mistura anestésica antagonista composta por uma dose fixa (4 µ g) de naloxona, um antagonista competitivo morfina e atipamezole, um antídoto específico medetomidina (2 mg/kg de peso corporal).</li>
	<li>Coloque o mouse sobre a almofada de aquecimento menor na caixa de recuperação até a recuperação completa, que normalmente é observada após 1 a 2 h. Nota: O laboratório UCL, cerca de 10% mortalidade, principalmente relacionada à bronchoaspiration de soluções perfundido na cavidade nasal durante o teste, observa-se independentemente do gênero ou genótipo.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

O objetivo deste trabalho é descrever um protocolo adequado para medição PD nasal sob perfusão contínua de soluções em espontaneamente ratos de respirar por um período de tempo necessário para testar a integridade dos transportadores de íons, principalmente CFTR e ENaC. Todas as etapas do protocolo foram cuidadosamente otimizadas para garantir a recuperação completa de animais e de boa qualidade e de dados podem ser reproduzidos. Em particulares, a críticos passos são avaliação de anestesia e de gestão e posição adequada...

Há quase três décadas, utilizaram-se medições elétricas de diferença (PD) potencial para avaliar o estado funcional de transportadores de íons transmembrana expressado na mucosa nasal, como representante das vias aéreas distais1. Como uma dinâmica multipasso teste2,3, nasal PD permite funcional dissecação de fibrose cística regulador de condutância transmembrana (CFTR) e atividade de sódio epitelial canal (ENaC), ambos localizados na membrana apical as células epiteliais e exercendo cargos críticos na superfície hidratação das vias aéreas. A principal aplicação clínica do teste PD nasal é auxiliar no diagnóstico da CF, a doença genética fatal mais comum em populações caucasianas com uma incidência média de 1 de 2.500 nascidos vivos em países europeus. O teste de tempo revelou-se útil no diagnóstico das formas oligo - ou mono-sintomática atenuada, da CF, geralmente diagnosticados mais tarde na vida e de distúrbios relacionados com a CF, tais como ausência bilateral congênita de deferente, pancreatite crónica idiopática, alérgica aspergilose broncopulmonar e bronquiectasias4. Mais recentemente, clinometric avaliação de modulação terapêutica do CFTR básico defeito5,6,7,8,9,10,11 ,12,13,14,15,16 tem feito uso do PD nasal em ensaios clínicos de novas terapias de CF. Na configuração de pré-clínicos, o teste foi adaptado para o rato17 para permitir a investigação da Bioatividade da nova CF terapias alvo18,19,20,21. Em camundongos, a técnica é delicada, com base em espécies relacionadas com diferenças anatômicas no tamanho da região nasal entre roedores e seres humanos e principalmente sobre o papel essencial de entradas sensoriais da região nasofacial em roedores. Requer operadores treinados e qualificados, equipamentos e suprimentos.
CF é uma desordem sistêmica múltipla das glândulas exócrinas, na qual doença respiratória crônica domina o quadro clínico. A doença é causada por mutações no gene da codificação do adenosina monofosfato cíclica (cAMP)-regulamentado CFTR cloreto canal22. Até à data, mais de 2.000 mutações CFTR foram identificados23. O mais comum mutação24,25, encontrado em quase 90% dos alelos CF, corresponde a uma exclusão da fenilalanina na posição 508 da corrente do polypeptide da proteína (F508del-CFTR). A proteína CFTR é um canal de cloreto puramente ôhmica da condutibilidade. Também há evidência considerável que CFTR regula outros mecanismos de transporte, em particular, ENaC26,27. Transporte de eletrólito defeituosos, incluindo a condutância de cloreto CFTR-dependente reduzida e maior condutância de sódio ENaC-dependente, é uma característica dos epitélios CF. O antigo defeito é refletido por uma repolarização reduzida ou abolida em resposta a um eletroquímico efluxo favorecendo gradiente de cloreto e a adição de isoproterenol (β-adrenérgico agonista que aumenta cAMP intracelular) ou forskolin (um adenilato ciclase agonista, não aprovada para uso clínico). O último defeito é refletido por uma hiperpolarização basal da mucosa nasal (um PD mais negativa) e uma resposta aumentada a amilorida, um medicamento diurético que bloqueia ENaC28.
Modelos de rato CF têm sido frequentemente utilizados na investigação de CF e tem sido inestimáveis em dissecando patologia CF. Hoje em dia, pelo menos quinze modelos têm sido descritos29, três dos quais são homozigotos para a mutação F508del mais clinicamente relevantes30,31,32. Dentre estes três estirpes30, desenvolvido na Universidade de Erasmus em Roterdão, tem sido usado por quase 20 anos no laboratório Université catholique de Louvain (UCL). O modelo detm1Eur de Cftr30 provou para ser muito útil para estudar a dysregulation fisiopatologia da doença CF e para testar a eficácia de novas estratégias terapêuticas18,19,20, 21. Inúmeros problemas podem ocorrer durante ou início após (< 24h) o teste de PD nasal em ratos. Neste trabalho, são descritos a profundidade adequada de anestesia necessária para manter um cateter nasal em situ para perfusão contínua e medidas para evitar Bronco-aspiração de soluções perfundidos no nariz. O cuidado animal no final do teste também é descrito, incluindo a administração de uma combinação de antídotos de drogas anestésicas, levando a inverter rapidamente a anestesia com completa recuperação dos animais. No total, estes procedimentos permitem medições correctas em ratos de respirar espontaneamente, reduzida mortalidade relacionados ao teste e repetir o teste no mesmo animal. Obtidos a partir do teste de PD nasal em um CF e em um rato selvagem-tipo de dados representativos são mostrados e discutidos.
O protocolo de teste PD nasal murino é relatado em três sessões: avaliação e gestão antes, durante e depois do teste. No pré-teste avaliação e gestão, o protocolo de preparação do cateter de lúmen duplo nasal e de soluções usadas para perfusão nasal contínua é descrito em detalhes. Durante a avaliação e gestão porções do teste, a instalação experimental e a manipulação do mouse é minuciosamente dissecado. Finalmente, a gestão do animal no final do teste é descrito para melhorar a recuperação total de animais.

<table><tbody><tr><td>Tubo de polietileno Portex&nbsp;</td><td>Smiths Medical, Hythe, Kent, Inglaterra CT21 6JL</td><td>Portex 800/100/500; 2,0 mm de diâmetro, 3,0 mmOD</td><td>para preparar tubos capilares para sonda nasal</td></tr><tr><td>Creme de eletrodo</td><td>Parker, Fairfield, NJ, EUA</td><td>Creme Redux</td><td>para construir pontes de eletrodos</td></tr><tr><td>Eletrodos Ag/AgCl</td><td>Biomedical, Clinton Township, MI, EUA</td><td>JNS BNT131-1,0</td><td>eletrodos de medição e referência</td></tr><tr><td>cloridrato de amilorida</td><td>Sigma, St Louis, MI, EUA</td><td>A7410</td><td>para preparar soluções</td></tr> <tr>de perfusão<td>forskolin</td><td>Sigma, St Louis, MI, EUA</td><td>F6886</td><td>para preparar soluções de perfusão</td></tr><tr><td>Voltímetro Knick Portamess</td><td>Elektronisch Me&beta; ger&auml; te, Berlim, Alemanha</td><td>Portavo 904 pH</td><td>para medir a diferença de potencial</td></tr><tr><td>Paraly SW 112 Software&nbsp;</td><td>Elektronisch Me&beta; ger&auml; te, Berlim, Alemanha</td><td>Software Paraly SW112</td><td>para capturar dados de diferença potencial</td></tr><tr><td>midazolam&nbsp;</td><td>Mylan, Hoeilaart, Bélgica</td><td>Dormicum 15mg/3ml</td><td>para servir como anestésico pré-medicação</td></tr><tr><td>fentanil</td><td>Janssen Cilag, Berchem, Bélgica</td><td>Fentanyl-Janssen 0,05 mg/ml</td><td>para servir como medicação anestésica</td></tr><tr><td>medetomidina</td><td>Orion Pharma, Espoo, Finlândia</td><td>Domitor 1 mg/ml</td><td>para servir como medicação anestésica</td></tr><tr><td>droperidol&nbsp;</td><td>Janssen&nbsp; Cilag, Berchem, Bélgica</td><td>Dehidrobenzperidol 2,5 mg/ml</td><td>para servir como medicamento anestésico</td></tr><tr><td>clonidina&nbsp;</td><td>Boehringer Ingelheim Pharma KG, Ingelheim am Rhein, Alemanha</td><td>Catapressan 0.15 mg/ml,</td> <td>para servir como medicamento anestésico</td></tr><tr><td>encaminhamento cateter IV</td><td>Becton Dickinson, Sandy, UT, EUA</td><td>24 GA x 0.75 IN, BD Insyte-W</td><td>para construir pontes de eletrodos</td></tr><tr><td>fórceps&nbsp;</td><td>Ferramentas de ciência fina, Heidelberg, Alemanha</td><td>Dumont #5, Ferramentas de ciência fina</td><td>para colocar o cateter nasal</td></tr><tr><td>naloxona&nbsp;</td><td>Braun Medical, Bruxelas, Bélgica</td><td>Narcan, 0,4 mg/ml</td><td>para servir como antagonista anestésico</td></tr><tr><td>atipamezol&nbsp;</td><td>Zoetis, Bloomberg, Bélgica</td><td>Antisedan, 5 mg/ml</td><td>para servir como antídoto específico para medetomedina</td></tr><tr><td>Almofadas de aquecimento&nbsp;</td><td>Harvard Apparatus, Holliston, MA, EUA</td><td>18,8x37,5 cm; 15,5x15,5 cm</td><td>para evitar hipotermia durante e após o teste</td></tr><tr><td>Bomba peristáltica P1</td><td>GE Life Sciences, Uppsala, Suécia</td><td>18111091</td><td>para perfundir soluções na</td></tr><tr><td>cola de cianoacrilato</td> de nariz de camundongo <td>Loctite, Henkel, D&uuml; sseldorf, Alemanha&nbsp;</td><td>super cola 3</td><td>para unir dois tubos capilares&nbsp; para sonda nasal</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma, St Louis, MI, EUA</td><td>RES0926S-A7</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>M7304</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>1551128</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>1551139</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>Na gluconato</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>S2054</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>Ca gluconato</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>C8231</td><td>Pharma-Grade, USP</td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Sigma, St Louis, MI, USA</td><td>RES0089M-A7</td><td>Pharma-Grade,</td></tr><tr><td>USP BD needle&nbsp;</td><td>Becton Dickinson, Franklin Lakes, EUA</td><td>BD 26G (0,45x10 mm)</td> <td>injeção intraperitoneal</td></tr></tbody></table>

diferença de potencial nasal para quantificar o transporte do íon trans-epitelial em ratos

Nasal Potential Difference to Quantify Trans-epithelial Ion Transport in Mice

O teste de diferença de potencial nasal tem sido usado por quase três décadas para auxiliar no diagnóstico de fibrose cística (CF). Provou ser útil em casos de atenuado, oligo - ou mono-sintomática formas de CF geralmente diagnosticados mais tarde na vida e de distúrbios relacionados com a CF, tais como ausência bilateral congênita de deferente, pancreatite crónica idiopática, alérgica aspergilose broncopulmonar e bronquiectasias. Em contextos clínicos e pré-clínicos, o teste tem sido utilizado como um biomarcador para quantificar respostas para estratégias terapêuticas específicas para adaptação cf. o teste de um rato é um desafio e pode acarretar uma mortalidade associada. Este paper descreve a profundidade adequada de anestesia necessária para manter um cateter nasal em situ para perfusão contínua. Ele enumera as medidas para evitar Bronco-aspiração de soluções perfundidos no nariz. Ele também descreve o cuidado animal no final do teste, incluindo a administração de uma combinação de antídotos das drogas anestésicas, levando a inverter rapidamente a anestesia com recuperação total dos animais. Dados representativos obtidos de um CF e um rato selvagem-tipo mostram que o teste discrimina entre CF e não-CF. No total, o protocolo descrito aqui permite medições correctas do estatuto funcional de trans-epitelial transportadores de cloreto e sódio em ratos de respirar espontaneamente, bem como vários testes no mesmo animal reduzindo relacionados ao teste mortalidade.

A fim de ilustrar as anomalias de transporte do íon característico em CF, foram realizadas medidas de PD nasais seguindo o protocolo descrito acima em um rato F508del-CF e um controle do tipo selvagem do fundo genético FVB/129 da colônia de Bruxelas CFTRtm1Eur ratos30. Este modelo clinicamente relevante, abrigando um dos mais graves F508del-CFTR mutação23,24,25e...

Aqui, apresentamos um protocolo para medir a diferença de potencial nasal em ratos. O teste quantifica a função de transportadores transmembrana de íons como o regulador de condutância transmembranar de fibrose cística e o canal de sódio epitelial. É valioso para avaliar a eficácia de novas terapias para a fibrose cística.

Diferença de potencial nasal para quantificar o transporte do íon Trans-epitelial em ratos

The nasal potential difference test has been used for almost three decades to assist in the diagnosis of cystic fibrosis (CF). It has proven to be helpful ...

A diferença de potencial nasal é um método valioso para caracterizar o fenótipo de camundongos transgênicos modelando fibrose cística. Permite a investigação da eficácia de novos tipos de terapias para a fibrose cística. As principais vantagens da técnica são que ela fornece medições confiáveis em camundongos reprodutores contínuos.Reduz a mortalidade relacionada e permite repetir o teste no mesmo animal. Para preparar o cateter nasal de duplo lúmen, mantenha o meio de um tubo de polietileno de 20 centímetros de comprimento na chama por cerca de 10 a 15 segundos até que esteja macio o suficiente para puxar. Em seguida, afaste as duas extremidades para obter um tubo capilar muito fino de cerca de 15 centímetros de comprimento e um diâmetro externo de 0,1 milímetros para a sonda nasal.Em seguida, limpe e desengordure os dois capilares com etanol puro. Junte-os com fita adesiva e cole-os com cola de cianoacrilato. Corte o excesso de comprimento das sondas com uma lâmina de barbear para obter o cateter de duplo lúmen de cerca de oito centímetros de comprimento.Em seguida, injete água através de ambos os lúmens para verificar se eles são permeáveis e faça uma marca a uma distância de ci

nasal-potential-difference-to-quantify-trans-epithelial-ion-transport

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

O electroolfactogram gravação (EOG) é uma maneira informativa de fácil condução e confiável de avaliação da função olfativa ao nível do epitélio olfativo. Este protocolo descreve uma configuração de gravação, de preparação dos tecidos mouse, coleta de dados e análise de dados básicos.

Respostas análise de rato Olfactory neurônios sensoriais Usando a gravação Electroolfactogram Air fase

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Registro perfurado de neurônios sensoriais olfativos em camundongos

Um método eficaz para Desossa manual Prepare Intacto Rato tecido nasal com organização anatômica preservada

A análise das propriedades fisiológicas dos neurônios sensoriais olfativos ainda enfrenta limitações técnicas. Aqui, nós os registramos por meio de patch-clamp perfurado em uma preparação intacta do epitélio olfatório em camundongos direcionados ao gene. Esta técnica permite a caracterização das propriedades da membrana e respostas a ligantes específicos de neurônios que expressam receptores olfativos definidos.

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Aqui, descrevemos uma abordagem fisiológica que permite a identificação e análise aprofundada de uma população definida de neurônios sensoriais em fatias agudas de tecido coronal do órgão vomeronasal de camundongo usando gravações de patch-clamp de células inteiras.

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Este manuscrito descreve as aplicações dos eletrodos seletivos-próton e patch aperto métodos para medir a atividade dos sistemas de transporte de prótons. Esses métodos de superar algumas limitações das técnicas comumente utilizadas para estudar a actividade de transporte de prótons, como sensibilidade moderada, resolução de tempo e controle do meio intracelular insuficiente.

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Aqui, apresentamos um protocolo padronizado para medir a diferença de potencial nasal (NPD). Regulador de condutância transmembranar de fibrose cística (CFTR) e de sódio epitelial (ENaC) de canal função são avaliados pela mudança na tensão entre o epitélio nasal após superfusion de soluções que modificam a atividade do canal de íon, fornecendo um medida de resultado.

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Aqui descrevemos o isolamento, amplificação e diferenciação das células epiteliais nasais primárias (HNE) na interface ar-líquido e um protocolo de biobanco permitindo congelar com sucesso e, em seguida, descongelar HNE amplificada. O protocolo analisa propriedades eletrofisiológicas de células HNE diferenciadas e correção de secreção de cloreto relacionada ao CFTR em diferentes tratamentos moduladores.

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Aprenda a medir a diferença de potencial nasal em camundongos transgênicos para avaliar o transporte de íons CFTR e ENaC. Este método reduz a mortalidade e permite testes repetidos no mesmo animal.

Diferença de potencial nasal para quantificar o transporte do íon Trans-epitelial em ratos

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