Caracterização de subconjuntos de monócitos humanos por sangue total Flow Cytometry Analysis

Essa técnica pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da imunologia. Como, determinando como as proporções de subconjuntos de monócito, ou expressão de diferentes marcadores, são alteradas em estados de doença. A principal vantagem dessa técnica é que as células estão próximas ao seu estado natal, e que instruções claras e justificativas são usadas, para fornecer um método padronizado de gating.

Geralmente, indivíduos novos nesse método podem ter dificuldades, pois muitos artigos não dão instruções claras sobre como a gating das células foi realizada. Inicie este protocolo com coleta de amostras de sangue e determinação da contagem de glóbulos brancos, conforme detalhado no protocolo de texto. Diluir o sangue com soro fisiológico tamponado com fosfato, para ajustar a concentração a aproximadamente 5 milhões de glóbulos brancos por mililitro.

Prepare mistura mestre suficiente para o número de tubos combinando sangue, anti CD14-V450, anti CD16-APC e anti HLA-DR-PerCP. Vórtice e pipeta 51,9 microliters de mistura em cada tubo. Adicione anticorpos marcadores M1 e M2 rotulados pe e M2, bem como marcadores para células T, células B, neutrófilos e células assassinas naturais em seus tubos correspondentes.

Vórtice e incubar por 30 minutos a quatro graus celsius no escuro. Agora, adicione 250 microliters de lise de glóbulos vermelhos combinados e solução de fixação de glóbulos brancos, e imediatamente vórtice da mistura, suavemente. Incubar a mistura vórtice por 10 minutos no escuro, a quatro graus celsius.

Após 10 minutos, adicione 250 microliters de PBS e gire as células a 260g, por 10 minutos em temperatura ambiente. Remova o supernascer e resuspenja as células em 300 microliters de 1%formaldeído. Armazene as células a quatro graus celsius, protegidas da luz até que a análise seja realizada.

A citometria de fluxo deve ser feita dentro de 48 horas após a preparação da amostra. Para começar, verifique o registro do citômetro de fluxo para garantir que a equipe da instalação tenha realizado verificações de controle de qualidade. Para configurar o experimento de citometria de fluxo, clique em novo experimento, seguido de novo espécime e novo tubo, para adicionar tubos.

Selecione os plots bivariados, clicando no ícone e use os menus suspensos, para selecionar os parâmetros de acesso. Garanta a inclusão de um lote CD16/CD14 e um gráfico exibindo um detector ao lado do tempo, para monitorar a aquisição. Insira o tubo e clique, adquira.

Verifique as configurações de tensão do instrumento, garantindo que os sinais do detector não estejam fora de escala. Observe células caindo no portão de monócito da trama CD14/CD16. Defina o limite de gravação para 5.000 eventos para o portão clássico de monócitos, e clique no registro.

Continue registrando dados para os tubos restantes. Após o registro dos dados de todos os tubos, exporte os dados de fluxo como arquivos fcs para análise. Para executar o gating de monócitos, abra arquivos no software de análise, clique duas vezes no nome do tubo e selecione parâmetros nos menus suspensos para visualizar as células em uma área de dispersão para a frente versus gráfico de altura de dispersão para a frente.

Crie um portão de exclusão de doublet, clicando no ícone da ferramenta do portão do polígono e envolvendo as células. Selecione as células fechadas clicando duas vezes na região fechada. Na nova caixa de exibição, ajuste os parâmetros do menu suspenso para exibir as células em uma área de dispersão para a frente versus o enredo da área de dispersão lateral.

Clique no ícone do portão retangular e selecione generosamente a população de monócitos, com base em propriedades de dispersão para a frente e para o lado, para excluir a maioria dos linfócitos, células assassinas naturais e granulócitos. Selecione as células fechadas e reexibida em um plot CD14/CD16, selecionando os parâmetros usando os menus suspensos. Clique no portão do polígono, para selecionar monócitos com base em sua forma l invertida característica.

Se a população não clássica não é distinta das células à esquerda, então a contaminação é provável e deve ser investigada. Selecione as células fechadas e exiba os monócitos em um plot CD/16 HLA-DR, usando os menus suspensos para selecionar parâmetros. Clique no portão do polígono para selecionar as células positivas HLA-DR e exclua quaisquer células assassinas naturais restantes e neutrófilos.

Selecione as células fechadas e exiba as células positivas HLA-DR em um plot CD14/HLA-DR usando menus suspensos para selecionar parâmetros. Clique no portão do polígono e desenhe um portão para excluir as células B altas/CD14 baixas do HLA-DR. Selecione as células fechadas e use os menus suspensos para exibi-las em um plot CD16/CD14.

A partir de opções de enredo, selecione o enredo de zebra, que permitirá que portões de subconjuntos de monócitos sejam desenhados, para determinar proporções subconjuntos. Agora, clique no ícone do portão retangular e selecione os monócitos clássicos desenhando um portão retangular aproximado ao redor do CD14 alta/CD16 baixa população de monócitos clássicos. Em exibição, selecione, mostre medianas, para exibir a intensidade mediana da fluorescência para monócitos clássicos.

Ajuste o portão de tal forma que a população tenha uma distribuição igual da mediana à esquerda e à direita, e está abrangendo todas as células à esquerda. Selecione a população intermediária desenhando um portão retangular que engloba as células à direita do portão clássico. Ajuste a parte inferior do portão para excluir as células não clássicas, alinhando o portão com a parte inferior dos círculos concêntricos, que estão completamente dentro do portão clássico de monócito.

Gate o subconjunto não clássico, desenhando uma caixa retangular para baixo da borda inferior do subconjunto intermediário, selecionando todas as células para o fundo da população. Em exibição, selecione, mostre as frequências do portão, para determinar a porcentagem de cada subconjunto de monócito. Finalmente, selecione células de cada subconjunto de monócitos.

Altere os parâmetros suspensos para criar um histograma para cada subconjunto de monócito, exibindo cada marcador. Em seguida, calcule o grau de expressão, utilizando média mediana ou geométrica, conforme descrito no protocolo de texto. Populações de monócitos fechados com sucesso são mostradas aqui.

E as proporções estão em consonância com as da literatura. As proporções dessa amostra foram calculadas como 88,1% clássicas, 4,33% intermediárias e 7,49% não clássicas. Ao avaliar a posição relativa de outras populações, fica claro que as células T e os neutrófilos mostrados aqui em azul, seguem bem fora do monócito, forma l invertida, em um enredo CD16/CD14.

No entanto, tanto as células assassinas naturais quanto as populações de células B, mostradas aqui em azul, se sobrepuseram com a população não clássica de monócitos. Mapas de calor confirmando que os tipos de células contaminantes foram removidos, são mostrados aqui. As células assassinas naturais foram fechadas pela etapa HLA-DR CD16, enquanto as células B foram fechadas pela etapa HLA-DR CD/14.

A expressão dos marcadores M1 e M2 em azul, em relação aos seus controles isótipos em vermelho, são mostrados aqui. CD120b um marcador M1, mostra uma mudança clara acima de seu controle isótipo, para todos os subconjuntos monocitos. É o caso também do marcador CD93 a M2, com expressão sendo maior em clássico, moderado em intermediários e baixo em não-clássico.

Ao tentar este procedimento, é importante lembrar para garantir que as células contaminantes sejam fechadas, pois de outra forma podem contribuir para a expressão quantificada. Após este procedimento, outros marcadores podem ser examinados. Para responder a perguntas adicionais, como, como a expressão do marcador de monócito muda na doença.

Não se esqueça que trabalhar com sangue humano e formaldeído pode ser perigoso, e por isso precauções como, equipamentos de proteção individual, e usando um capuz de risco biológico, devem ser sempre tomadas ao realizar este procedimento.