Isolamento de arteríolas retina para estudos de fisiologia celular Ex Vivo

Este manuscrito descreve um protocolo simples para o isolamento de arteríolas da retina rato que podem ser usados em, cálcio imaging e pressão miografia Estudos eletrofisiológicos.

Compreender como o fluxo sanguíneo é controlado na retina é um objetivo importante, pois o fluxo sanguíneo anormal tem sido implicado no desenvolvimento de uma variedade de doenças retinianas que ameaçam a visão, como retinopatia diabética, glaucoma e oclusões de veias ramificadas. As arteríolas retinianas desempenham um papel fundamental na regulação do fluxo sanguíneo na retina, dilatando e contraindo seu diâmetro luminal, mediado por alterações na contratilidade das células musculares lisas que circundam esses vasos. Compreender os mecanismos moleculares subjacentes à regulação da perfusão retiniana, portanto, requer preparações onde as células do músculo liso arteriolar da retina possam ser acessadas e estudadas em condições o mais próximas possível do fisiológico.

Neste vídeo, demonstramos um protocolo simples para o isolamento de arteríolas da retina de ratos que pode ser usado em estudos de patch clamp, imagens de cálcio e miografia de pressão. Nos últimos anos, esta preparação tem sido usada para fornecer mais informações sobre a regulação da contratilidade do músculo liso vascular e do fluxo sanguíneo na retina, tanto na saúde quanto na doença. Faça uma solução de um litro de baixo teor de cálcio contendo Hanks'or LCH, conforme mostrado na tabela de materiais.

Monte o equipamento de isolamento antes da coleta de tecido. A pipeta de vidro Pasteur deve ser polida com fogo para alisar, mas não estreitar a ponta. Apare uma pipeta de plástico em uma abertura de aproximadamente cinco a sete milímetros.

Coloque os olhos na placa de dissecação, imersos em solução LCH. Use um conjunto de pinças para ancorar o olho ao prato, segurando os anexos do músculo orbital ou o nervo óptico. Certifique-se de que o ponto de ancoragem esteja o mais próximo possível da esclera para estabilizar o olho.

Usando a lâmina, corte a córnea ao longo da ora serrata e remova a lente pressionando suavemente a esclera com uma pinça. A pequena região circular que vemos na parte de trás do olho nesta imagem é o nervo óptico. Usando a lâmina, corte a ocular ao meio simetricamente através do disco óptico.

Usando uma pinça fechada, escove suavemente as retinas das duas metades da ocular, tomando cuidado para remover quaisquer anexos restantes no disco óptico. Repita o processo com o segundo olho e transfira as retinas dissecadas para o tubo de ensaio usando a pipeta de plástico e uma pequena gota de meio LCH. Usando a pipeta de plástico, encha o tubo de ensaio com LCH até aproximadamente cinco mililitros e permita que as retinas se depositem no fundo do tubo.

Lave o tecido aproximadamente três vezes, removendo aproximadamente quatro mililitros de solução do tubo e adicionando LCH fresco usando a pipeta de plástico. Quando necessário, o tecido estranho deve ser removido. Lave o interior da pipeta Pasteur de vidro com ponta polida com LCH para evitar que o tecido grude na pipeta.

Usando a mesma pipeta, remova aproximadamente quatro mililitros de solução do tubo de ensaio e adicione aproximadamente dois mililitros de LCH fresco. Dissocie suavemente as retinas puxando o tecido através da ponta da pipeta de vidro lentamente e expulse o conteúdo para o tubo de ensaio. Tente não introduzir bolhas nesta fase e repita o processo até que as retinas estejam quebradas até o tamanho de aproximadamente dois a três milímetros quadrados.

Lave o interior da pipeta com aproximadamente dois mililitros de LCH e expulse-o para o tubo de ensaio. Deixe o conteúdo assentar no fundo por cinco a 10 minutos. Repita o processo de trituração conforme descrito anteriormente com um pouco mais de força até que os pedaços de tecido tenham aproximadamente um milímetro quadrado de tamanho.

Deixe o tecido assentar e repita mais uma vez com ainda mais força até que o conteúdo esteja totalmente homogeneizado e nenhum pedaço de retina permaneça. A solução nesta fase deve parecer leitosa na aparência. Esta técnica produzirá até oito segmentos de arteríola por isolamento, medindo de 200 a 2.500 micrômetros de comprimento.

A canulação de uma extremidade da arteríola com oclusão da extremidade oposta permite a medição da vasoconstrição induzida por pressão, também conhecida como resposta miogênica. A miografia de pressão arteriolar é realizada da seguinte forma. Uma alíquota de homogeneizado de retina é transferida para uma câmara de registro fisiológico montada no estágio de um microscópio invertido.

Deixar o homogeneizado assentar no fundo da câmara durante, pelo menos, cinco minutos. Examine visualmente a câmara de registro para identificar arteríolas com mais de 200 micrômetros de comprimento e que possuam uma extremidade aberta através da qual o vaso possa ser canulado. Ancore em uma extremidade da embarcação usando uma pinça fina e uma pequena tira de fio de tungstênio colocada sobre a embarcação.

Usando as extremidades sobrepostas do fio de tungstênio, manobre o vaso para correr horizontalmente pelo banho, de modo que a extremidade aberta fique alinhada com a cânula de pressurização. Perfundir a câmara com zero cálcio Hanks'at 37 graus Celsius. As canulações são realizadas com pipetas de vidro.

A cânula é posicionada na extremidade aberta do vaso usando um micromanipulador fino. A ponta é posicionada imediatamente adjacente à abertura, conforme avaliado ajustando o plano de foco no microscópio, de modo que tanto a extremidade do vaso quanto a ponta da cânula estejam em foco ao mesmo tempo e a cânula de pressurização avance para a abertura do vaso. Uma pipeta auxiliar é necessária para auxiliar no processo de canulação e é usada para conter suavemente a arteríola e guiar a parede arteriolar sobre a cânula de pressurização ao mesmo tempo em que a cânula avança para o lúmen do vaso.

Este procedimento requer movimento simultâneo e controlado de ambos os manipuladores e prática extensiva para alcançar uma alta taxa de sucesso. Após um minuto de registro a zero milímetros de mercúrio, a pressão intraluminal é aumentada para 40 milímetros de mercúrio, e o vaso deve dilatar rapidamente, confirmando o sucesso da canulação. A vasoconstrição induzida por pressão, ou seja, a resposta miogênica, se desenvolverá posteriormente em um período de aproximadamente 15 minutos.

O registro de patch clamp de células musculares lisas vasculares da retina permite a investigação das correntes iônicas da membrana plasmática que regulam o cálcio intracelular e, portanto, a contratilidade celular. A gravação de células inteiras e de canal único é possível a partir de células musculares lisas individuais ainda incorporadas em suas arteríolas parentais da seguinte forma. As arteríolas da retina são isoladas e ancoradas na câmara de registro com deslizamentos de fio de tungstênio.

A lâmina basal precisa ser digerida para permitir que uma vedação de alta resistência seja formada entre a pipeta de remendo e a membrana celular do músculo liso arteriolar. As arteríolas são superfundidas com uma série sequencial de soluções enzimáticas a 37 graus Celsius, o que também resulta no desacoplamento elétrico das células adjacentes, conforme indicado pelas setas na imagem. O nível de digestão é inicialmente avaliado na separação visual das camadas endotelial e muscular lisa durante a etapa de colagenase.

A remoção de quaisquer fitas remanescentes da lâmina basal e/ou neurópilo periférico é obtida varrendo cuidadosamente as pontas fechadas da pinça fina ao longo da superfície do vaso. Para o clampeamento do remendo, a ponta da pipeta de adesivo é posicionada verticalmente sobre a célula de interesse e abaixada gradualmente usando o movimento fino e lento do micromanipulador para fazer contato com a membrana do músculo liso arteriolar. Isso é julgado pelo movimento celular e uma mudança na resistência da pipeta, medida usando um protocolo de teste de vedação celular no software de aquisição.

À medida que a pipeta é abaixada na célula, a resistência da vedação aumenta aproximadamente cinco vezes. A pressão negativa é aplicada transitoriamente na parte traseira da pipeta e um gigaseal é formado gradualmente. Isso requer aplicações repetidas de pressão negativa ao longo de um a cinco minutos.

Para gravação de células inteiras, o método de patch-clamp perfurado é predominantemente usado. Um gigaseal é formado, conforme descrito anteriormente, com uma pipeta contendo solução intracelular e anfotericina B. A resistência de acesso é monitorada usando o protocolo de teste de membrana no software de aquisição. Uma vez que a resistência de acesso cai para menos de 15 megaohms, a compensação da resistência em série é realizada.

Normalmente, é possível compensar a resistência em série em aproximadamente 75% no modo de remendo perfurado. Passos de tensão ou protocolos de rampa podem então ser usados para medir correntes de células inteiras. Após a dissociação da retina, as arteríolas primárias, secundárias e pré-capilares podem ser identificadas com base em seu calibre e no arranjo das células musculares lisas vasculares.

As arteríolas de primeira e segunda ordem parecem visualmente semelhantes à microscopia de campo claro, mas podem ser distinguidas com base em seu tamanho. As arteríolas pré-capilares são os menores vasos arteriais na preparação e são facilmente reconhecíveis devido ao arranjo intermitente das células musculares lisas vasculares. As arteríolas isoladas podem ser claramente diferenciadas dos capilares e vênulas dentro do isolamento.

Os capilares são aparentes como uma malha de vasos de pequeno calibre com aproximadamente quatro a 10 micrômetros de diâmetro, enquanto as vênulas são de paredes finas e carecem de cobertura de células musculares lisas. As arteríolas primárias, secundárias e pré-capilares são adequadas para miografia de pressão, imagens de cálcio e estudos de patch-clamp. Usando arteríolas pressurizadas, investigamos os mecanismos moleculares envolvidos na geração da resposta miogênica.

As fotomicrografias nesta imagem mostram uma arteríola retiniana de rato em vários pontos de tempo durante o curso de um experimento de miografia de pressão. O gráfico de curso de tempo abaixo mostra as mudanças no diâmetro do vaso durante todo o curso do experimento. Imediatamente após a pressurização, o vaso se dilata, seguido por uma constrição miogênica ativa que atinge um nível de estado estacionário após 15 minutos.

A adição de wortmannin em uma solução de Hanks com zero cálcio no final do experimento dilata o vaso até seu diâmetro passivo para fins de normalização. Este slide mostra um exemplo de uma gravação de patch-clamp de canal único de uma célula muscular lisa da arteríola da retina antes e depois do estiramento da membrana. Este adesivo on-cell contém dois canais TRPV2 ativados por estiramento, cuja atividade aumenta com a aplicação de pressão negativa na pipeta de patch.

Os protocolos descritos aqui exigem prática, mas devem ser alcançados com o mínimo de solução de problemas. Recomendamos o uso das arteríolas isoladas no mesmo dia do isolamento. O método é otimizado para arteríolas retinianas de ratos, mas pode ser usado em retinas de camundongos.

Agora, usamos essa preparação extensivamente, mas, sempre que possível, também tentamos validar nossas principais descobertas usando montagens inteiras de retina ex vivo e medições in vivo do diâmetro dos vasos sanguíneos e do fluxo sanguíneo.