Name: Isolamento de arteríolas retina para estudos de fisiologia celular Ex Vivo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 42 s
Description: Aprenda a isolar arteríolas da retina de ratos para estudos de fisiologia vascular ex vivo. Este método permite investigar a contratilidade do músculo liso e a regulação do fluxo sanguíneo retiniano em doenças oculares.

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Desenvolvimento dos protocolos descritos neste trabalho foi apoiado por bolsas de agências de fomento seguintes: BBSRC (BB/I026359/1), luta para vista (1429 e 1822), a Fundação de pesquisa de Diabetes juvenil (2-2003-525), Wellcome Trust (074648/Z/04), Fundação britânica do coração (PG/11/94/29169), HSC R & D Division (STL/4748/13) e MRC (MC_PC_15026).

<ol><li>Kohner, E. M., Patel, V., Rassam, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+blood+flow+and+impaired+autoregulation+in+the+pathogenesis+of+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Role of blood flow and impaired autoregulation in the pathogenesis of diabetic retinopathy.</a> Diabetes. 44, 603-607 (1995).</li>
<li>Hafez, A. S., Bizzarro, R. L., Lesk, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+optic+nerve+head+and+peripapillary+retinal+blood+flow+in+glaucoma+patients%2C+ocular+hypertensives%2C+and+normal+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Evaluation of optic nerve head and peripapillary retinal blood flow in glaucoma patients, ocular hypertensives, and normal subjects.</a> American Journal of Ophthalmology. 136, 1022-1031 (2003).</li>
<li>Curtis, T. M., Gardiner, T. A., Stitt, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvascular+lesions+of+diabetic+retinopathy%3A+clues+towards+understanding+pathogenesis%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28London%29%22%5BJournal%5D)">Microvascular lesions of diabetic retinopathy: clues towards understanding pathogenesis?</a> Eye (London). 23, 1496-1508 (2009).</li>
<li>Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+retinal+blood+flow+in+health+and+disease%29%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of retinal blood flow in health and disease).</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27, 284-330 (2008).</li>
<li>Kuwabara, T., Cogan, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+retinal+vascular+patterns.+I.+Normal+architecture%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture.</a> Archives of Ophthalmology. 64, 904-911 (1960).</li>
<li>Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+physiology+of+retinal+and+choroidal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells.</a> Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).</li>
<li>Puro, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinovascular+physiology+and+pathophysiology%3A+new+experimental+approach%2Fnew+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 258-270 (2012).</li>
<li>Kur, J., Newman, E. A., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+physiological+mechanisms+underlying+blood+flow+regulation+in+the+retina+and+choroid+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular and physiological mechanisms underlying blood flow regulation in the retina and choroid in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 31 (5), 377-406 (2012).</li>
<li>Delaey, C., Van de Voorde, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+Mechanisms+in+the+Retinal+and+Choroidal+Circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmic+Research%22%5BJournal%5D)">Regulatory Mechanisms in the Retinal and Choroidal Circulation.</a> Ophthalmic Research. 32 (6), 249-256 (2000).</li>
<li>Metea, M. R., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glial+cells+dilate+and+constrict+blood+vessels%3A+a+mechanism+of+neurovascular+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glial cells dilate and constrict blood vessels: a mechanism of neurovascular coupling.</a> Journal of Neuroscience. 26, 2862-2870 (2006).</li>
<li>Pournaras, C. J., Rungger-Brändle, E., Riva, C. E., Hardarson, S. H., Stefansson, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+retinal+blood+flow+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Retinal+and+Eye+Research%22%5BJournal%5D)">Regulation of retinal blood flow in health and disease.</a> Progress in Retinal and Eye Research. 27 (3), 284-330 (2008).</li>
<li>Hughes, S., Chan-Ling, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+smooth+muscle+cell+and+pericyte+differentiation+in+the+rat+retina+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Characterization of smooth muscle cell and pericyte differentiation in the rat retina in vivo.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (8), 2795-2806 (2004).</li>
<li>Shepro, D., Morel, N. M. <a target="_blank" href="https://www.fasebj.org/doi/abs/10.1096/fasebj.7.11.8370472">Pericyte physiology.</a> The FASEB Journal. 7 (11), 1031-1038 (1993).</li>
<li>Kornfield, T. E., Newman, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+Blood+Flow+in+the+Retinal+Trilaminar+Vascular+Network%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Regulation of Blood Flow in the Retinal Trilaminar Vascular Network.</a> Journal of Neuroscience. 34 (34), 11504-11513 (2014).</li>
<li>Matsushita, K., Puro, D. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1779733/">Topographical heterogeneity of KIR currents in pericyte-containing microvessels of the rat retina: effect of diabetes.</a> Journal of Physiology. 573, 483-495 (2006).</li>
<li>Needham, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+K%2B+and+Cl-+channels+in+the+regulation+of+retinal+arteriolar+tone+and+blood+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">The role of K+ and Cl- channels in the regulation of retinal arteriolar tone and blood flow.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (4), 2157-2165 (2014).</li>
<li>Hessellund, A., Jeppesen, P., Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+vasomotion+in+porcine+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologicaogica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Characterization of vasomotion in porcine retinal arterioles.</a> Acta Ophthalmologicaogica Scandinavica. 81, 278-282 (2003).</li>
<li>Delaey, C., Van de Voord, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pressure-induced+myogenic+responses+in+isolated+bovine+retinal+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Pressure-induced myogenic responses in isolated bovine retinal arteries.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 1871-1875 (2000).</li>
<li>Kur, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ion+channels+and+subcellular+Ca2%2B+signaling+in+arachidonic+acid-induced+dilation+of+pressurized+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Role of ion channels and subcellular Ca2+ signaling in arachidonic acid-induced dilation of pressurized retinal arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (5), 2893-2902 (2014).</li>
<li>Kur, J., Bankhead, P., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+sparks+promote+myogenic+tone+in+retinal+arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) sparks promote myogenic tone in retinal arterioles.</a> British Journal of Pharmacology. 168 (7), 1675-1686 (2013).</li>
<li>Fernández, J. A., McGahon, M. K., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CaV3.1+T-Type+Ca2%2B+Channels+Contribute+to+Myogenic+Signaling+in+Rat+Retinal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">CaV3.1 T-Type Ca2+ Channels Contribute to Myogenic Signaling in Rat Retinal Arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 56 (9), 5125-5132 (2015).</li>
<li>McGahon, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV2+Channels+Contribute+to+Stretch-Activated+Cation+Currents+and+Myogenic+Constriction+in+Retinal+Arterioles%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">TRPV2 Channels Contribute to Stretch-Activated Cation Currents and Myogenic Constriction in Retinal Arterioles.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 57 (13), 5637-5647 (2016).</li>
<li>Guidoboni, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraocular+Pressure%2C+Blood+Pressure%2C+and+Retinal+Blood+Flow+Autoregulation%3A+A+Mathematical+Model+to+Clarify+Their+Relationship+and+Clinical+Relevance%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Intraocular Pressure, Blood Pressure, and Retinal Blood Flow Autoregulation: A Mathematical Model to Clarify Their Relationship and Clinical Relevance.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 55 (7), 4105-4118 (2014).</li>
<li>Scholfield, C. N., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+cytosolic+calcium+regulation+among+different+microvascular+smooth+muscle+cells+of+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Microvascular+Research%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in cytosolic calcium regulation among different microvascular smooth muscle cells of the rat retina.</a> Microvascular Research. 59 (2), 233-242 (2000).</li>
<li>Grynkiewicz, G., Poenie, M., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+generation+of+Ca2%2B+indicators+with+greatly+improved+fluorescence+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties.</a> Journal of Biological Chemistry. 260, 3440-3450 (1985).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single+Channel+Recording%2C+Second+Edition%22">Single Channel Recording, Second Edition</a>. , Plenum Press. New York. 53-90 (1995).</li>
<li>Fernández, J. A., Bankhead, P., Zhou, H., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+detection+and+measurement+of+isolated+retinal+arterioles+by+a+combination+of+edge+enhancement+and+cost+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Automated detection and measurement of isolated retinal arterioles by a combination of edge enhancement and cost analysis.</a> PLoS One. 9, e91791(2014).</li>
<li>McGahon, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diabetes+downregulates+large-conductance+Ca2%2B-activated+potassium+beta+1+channel+subunit+in+retinal+arteriolar+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Diabetes downregulates large-conductance Ca2+-activated potassium beta 1 channel subunit in retinal arteriolar smooth muscle.</a> Circulation Research. 100 (5), 703-711 (2007).</li>
<li>Curtis, T. M., Scholfield, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nifedipine+blocks+Ca2%2B+store+refilling+through+a+pathway+not+involving+L-type+Ca2%2B+channels+in+rabbit+arteriolar+smooth+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nifedipine blocks Ca2+ store refilling through a pathway not involving L-type Ca2+ channels in rabbit arteriolar smooth muscle.</a> Journal of Physiology. 532 (3), 609-623 (2001).</li>
<li>Tumelty, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelin+1+stimulates+Ca2%2B-sparks+and+oscillations+in+retinal+arteriolar+myocytes+via+IP3R+and+RyR-dependent+Ca2%2B+release%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">Endothelin 1 stimulates Ca2+-sparks and oscillations in retinal arteriolar myocytes via IP3R and RyR-dependent Ca2+ release.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 52 (6), 3874-3879 (2011).</li>
<li>Huynh, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insight+into+the+assembly+of+TRPV+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural insight into the assembly of TRPV channels.</a> Structure. 22 (2), 260-268 (2014).</li>
<li>McGahon, M. K., Dawicki, J. M., Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A-type+potassium+current+in+retinal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">A-type potassium current in retinal arteriolar smooth muscle cells.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 46 (9), 3281-3287 (2005).</li>
<li>McGahon, M. K., Zhang, X., Scholfield, C. N., Curtis, T. M., McGeown, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+downregulation+of+the+BKbeta1+subunit+in+diabetic+arteriolar+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Channels+%28Austin%29%22%5BJournal%5D)">Selective downregulation of the BKbeta1 subunit in diabetic arteriolar myocytes.</a> Channels (Austin). 1 (3), 141-143 (2007).</li>
<li>Ljubimov, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basement+membrane+abnormalities+in+human+eyes+with+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Basement membrane abnormalities in human eyes with diabetic retinopathy.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 44, 1469-1479 (1996).</li>
<li>Roy, S., Maiello, M., Lorenzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+expression+of+basement+membrane+collagen+in+human+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Increased expression of basement membrane collagen in human diabetic retinopathy.</a> Journal of Clinical Investigation. 93, 438-442 (1994).</li>
<li>Scholfield, C. N., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+physiology+of+retinal+and+choroidal+arteriolar+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Microcirculation%22%5BJournal%5D)">Cellular physiology of retinal and choroidal arteriolar smooth muscle cells.</a> Microcirculation. 14 (1), 11-24 (2007).</li>
<li>Hinds, K., Monaghan, K. P., Frølund, B., McGeown, J. G., Curtis, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GABAergic+control+of+arteriolar+diameter+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Investigative+Ophthalmology+%26+Visual+Science%22%5BJournal%5D)">GABAergic control of arteriolar diameter in the rat retina.</a> Investigative Ophthalmology & Visual Science. 54 (10), 6798-6805 (2013).</li>
<li>Torring, M. S., Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constriction+of+porcine+retinal+arterioles+induced+by+endothelin-1+and+the+thromboxane+analogue+U46619+in+vitro+decreases+with+increasing+vascular+branching+level%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">Constriction of porcine retinal arterioles induced by endothelin-1 and the thromboxane analogue U46619 in vitro decreases with increasing vascular branching level.</a> Acta Ophthalmologica. 92 (3), 232-237 (2014).</li>
<li>P, S. kov J. ensen, S, M. etz M. ariendal P. edersen, Aalkjaer, C., Bek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+vasodilating+effects+of+insulin+and+lactate+are+increased+in+precapillary+arterioles+in+the+porcine+retina+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Ophthalmologica%22%5BJournal%5D)">The vasodilating effects of insulin and lactate are increased in precapillary arterioles in the porcine retina ex vivo.</a> Acta Ophthalmologica. 94 (5), 454-462 (2016).</li>
</ol>

Dr. Joanna Kur agora é funcionária da Medtronic (Twin-Cities, Minnesota, EUA), o presente trabalho não conflite com isso aqui apresentados.

Os protocolos descritos acima requerem prática, mas devem ser alcançáveis com mínimo de solução de problemas. Em um dia médio nós obter arteríolas utilizáveis de 6-8 do isolamento e alcançar experiências bem sucedidas de 3-4. Se forem encontrados problemas, no entanto, existem algumas etapas que podem ser tomadas para ajudar a melhorar as taxas de sucesso. Ocasionalmente encontramos, particularmente quando usando ratos mais jovens (< 8 semanas), que o rendimento das arteríolas pode ser baixo. Para contornar este problema, sugerimos que a centrifugação o tecido da retina (s 10-30 a 500 x g) entre cada um da trituração passos em passos 1.12-1.14. Isso geralmente ajuda a melhorar o rendimento dos navios, mas também aumentará a quantidade de detritos de célula dentro da preparação.
Quando a canulação de vasos para estudos miografia de pressão é importante verificar as arteríolas cuidadosamente para qualquer lado-filiais que podem ter sido clivadas próximo ao local de bifurcação. Isto representa uma causa comum de vazamento e perda de pressão durante a experimentação. O principal problema que pode surgir com os [Ca2 +]eu protocolos é o nível de carregamento de corante. Carregamento de tintura pobre leva a baixos índices de sinal-ruído, enquanto sobrecarga resulta na interrupção da normal Ca2 + homeostase. Para reduzir a probabilidade de qualquer destas questões, uma pequena alíquota do homogenate retinal pode ser removida, e vasos isolados verificada periodicamente durante o protocolo de carregamento. Quando a empresa remendo-braçadeira experimentos, a taxa de sucesso de formação gigaseal é altamente dependente de como bem a lâmina basal tem sido digerida. Quando inicialmente testando este protocolo ou usando novos lotes de enzimas pode ser necessário ajustar a concentração/duração da digestão enzimática. Monitorar cuidadosamente a separação das camadas endoteliais e musculares lisas garantirá a digestão suficiente para remover suficiente basal laminais para obter acesso. Cuidadoso monitoramento também é necessário evitar excesso de digestão, que pode se manifestar como o navio começa a constrição. Se isso ocorrer, as células de músculo liso são muitas vezes demasiado frágil para gravação de braçadeira do remendo. Quando a aplicação de enzimas, é importante incluir DNAse I para assegurar a remoção dos filamentos de DNA libertados de células danificadas durante o processo de isolamento. Fragmentos de DNA são pegajosos e causar o fórceps a aderir a arteríola durante os estágios finais do processo de limpeza (etapa 4.4), muitas vezes resultando em perda de navio. Limpeza dos vasos é tecnicamente difícil e é melhor executada em alta ampliação (20 X) com suaves movimentos arrebatadoras de pinça fechada do diâmetro da ponta possível melhor. Entre varreduras, limpe a pinça com rolo de laboratório.
Como destacado anteriormente, uma chave motivação por trás do desenvolvimento dos protocolos descritos neste manuscrito foi entender melhor por que o fluxo sanguíneo é interrompido durante doenças vasculares da retina. A maioria do nosso trabalho para data centrou-se na doença de olho diabético28,33. As arteríolas podem ser isoladas de retinas de modelos experimentais de roedores de diabetes usando os métodos descritos na secção 1. Quando experimentando em arteríolas retina isoladas de animais diabéticos, é importante tentar intimamente replicar as condições hiperglicêmicos experimentadas pelo vasos na vivo. Por esta razão, nós normalmente aumentaria os níveis de D-glicose em nosso isolamento e soluções experimentais de 25 mM. Espessamento das membranas vasculares do porão é um fenômeno bem reconhecido nos vasos da retina durante a diabetes34,35. Ao utilizar animais com diabetes prolongada (> 1 meses de duração doença), concentrações de enzima aumentada ou tempos de digestão são muitas vezes necessários para permitir a aplicação dos métodos de gravação de remendo-braçadeira.
Uma limitação importante do uso de ex vivo isolado da retina arteríolas para estudar fisiologia vascular da retina e fisiopatologia é a perda do neuropile circundante da retina. Embora a remoção das células neuronais e gliais da retina permite o acesso fácil às células da retina músculo liso vascular para estudos de fisiologia celular, a resposta dos vasos para os mediadores vasoativas pode mudar dramaticamente na ausência e presença de retina tecido. As ações de adenosina tri-fosfato (ATP), por exemplo, fornecem uma boa ilustração desse ponto. Em isolado rato arteríolas retina, adição de ATP disparadores uma robusta constrição dos vasos36, enquanto na presença de um neuropile intacta, os vasos dilatam37. Portanto, sempre que possível, geralmente tentamos validar as principais conclusões de nossos preparativos arteríola isolado usando ex vivo retinal todo-montagens e medições em vivo do navio diâmetro e sangue fluxo16,37 . Digno de nota, novos métodos surgiram recentemente para estudar pequenas arteríolas e capilares na retina porcina toda perfundidos ex vivo38,39. Tais preparações são susceptíveis de melhorar significativamente a nossa compreensão de como a retina neuropile regula Tom arteriolar e capilar da retina e como alterações na hemodinâmica da retina modulam a atividade neuronal na retina.
Embora os procedimentos descritos neste artigo concentram-se na utilização de arteríolas retina de rato isolado de fisiologia de célula compreensão arteriolar músculo liso, estamos atualmente desenvolvendo protocolos para habilitar também o estudo da função da célula endotelial em estes vasos. No trabalho preliminar, temos sido bem sucedidos em modificar a digestão enzimática dos segmentos arteriolar retiniano para produzir tubos de células endoteliais viáveis que são passíveis de Ca2 + imagens e patchclamp estudos de gravação. Canulação das arteríolas isoladas em ambas as extremidades, permitindo intraluminal entrega de drogas, no futuro poderia também habilitar endotélio-dependente respostas vasodilatadoras para ser investigado destes vasos.

Compreensão de como o fluxo sanguíneo é controlado na retina é uma meta importante, desde que o fluxo sanguíneo anormal tem sido implicado na patogênese de uma variedade de vista-ameaçando doenças da retina1,2,3, 4. A circulação da retina, que abastece o interior da retina neurônios e células gliais, tem um arranjo de artéria de final, com todo o sangue das artérias da retina e arteríolas passando através dos capilares para as vênulas da retina e, finalmente, veias5. Fluxo sanguíneo na retina é regulado pelo tom da artéria da retina e arteríolas, bem como a atividade contrátil dos pericitos localizados nas paredes dos vasos capilares da retina e vênulas pós-capilares6,7, 8. o controle do tônus vascular da retina é complexo e é modulado por uma série de entradas do sistema circulatório e tecido circundante da retina, incluindo os gáses de sangue, circulam moléculas e hormonas, e substâncias vasoativas libertado o retiniana vascular endotélio e macroglia9,10,11. As arteríolas da retina são os pequenos ramos arteriais da retina e são compostas de uma única camada de células de músculo liso vascular e um revestimento interno de dispostas longitudinalmente células endoteliais12,13, 14. estes vasos formam o site principal da resistência vascular dentro da circulação da retina e, portanto, desempenhar um papel importante no controle local do fluxo sanguíneo da retina. Arteríolas retina regulam o fluxo de sangue capilar na retina por dilatação ou constrição seu diâmetro luminal, mediado por alterações na contratilidade de músculo liso vascular10,15,16. Compreender os mecanismos moleculares através da qual retinal arteríolas regulam perfusão da retina, portanto, requer preparações onde as células arteriolar músculo liso podem ser acessadas e estudou em condições fisiológicas como possível tão perto.
Ex vivo preparações das embarcações de sangue retinais isoladas fornecem acesso para as células de músculo liso vascular, mantendo ainda sua funcionalidade e interconectividade com o endotélio subjacente. A maioria dos estudos até à data de utilização dos recipientes isolados têm-se centrado na grandes bovina ou suínos vasos arteriais (60-150 µm). Estas podem ser montadas no fio comercialmente disponível ou sistemas de myograph de pressão para permitir o interrogatório farmacológico de células de músculo liso vascular mecanismos contráteis17,18. Tais preparações contribuíram grandemente para o nosso conhecimento da fisiologia vascular da retina, em condições normais. Alguns estudos utilizaram arteríolas retina isoladas de animais de laboratório pequeno como o seu diâmetro menor (~ 8-45 µm) impede a sua utilização em sistemas convencionais miografia19,20,21,22. Uma vantagem importante, no entanto, da utilização de embarcações de animais de laboratório pequeno é a ampla disponibilidade de modelos de doenças geneticamente modificados, transgênicos e da retina. Animais de laboratório pequeno também estão mais receptivos para estudos de intervenção na vivo .
Aqui descrevemos simples protocolos para isolar e canulação arteríolas da retina de ratos para experimentos miografia de pressão. CA2 + imagem e Eletrofisiologia protocolos utilizando estes vasos também são detalhados. Estes podem fornecer mais insights sobre a regulação da contratilidade do músculo liso vascular e fluxo sanguíneo na retina.

<table><tbody><tr><td>Copos</td><td>Fisherbrand</td><td>15409083</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Tesoura Curvada</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-109-3542</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Pipeta/ transferência de plástico descartável</td><td>Sarstedt</td><td>86.1174</td><td>6mL é o melhor, mas outros tamanhos são aceitáveis; remova a ponta para ampliar a abertura</td></tr><tr><td>Microscópio de dissecação</td><td>Brunel Microscopes LTD</td><td></td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>Dumont #5 14095</td><td>Qualquer pinça fina equivalente</td></tr><tr><td>Pipeta Pasteur</td><td>Fisherbrand</td><td>11546963</td><td>Fogo polido para reduzir o atrito, mas não o suficiente para estreitar a ponta</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7741</td><td>Ou qualquer produto equivalente de 10cm</td></tr><tr><td>Pipeta tetina</td><td>Fisherbrand</td><td>12426180</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Abastecimento de água purificada</td><td>Sistema</td> de <td>Purificação de Água Integral Merek Milli-Q</td><td>Ou qualquer sistema equivalente</td></tr><tr><td>Tubo de ensaio de fundo redondo</td><td>Fisherbrand</td><td>14-958-10 B</td><td>5 mL; qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Pinça Seratted</td><td>Fisher Scientific</td><td>17-467-230</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Lâminas de borda única</td><td>Agar Scientific</td><td>T585</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>184</td><td>Ou qualquer superfície flexível&nbsp;</td></tr><tr><td>Suporte para tubos de ensaio</td><td>Fisherbrand Derlin</td><td>10257963</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Manipulador mecânico de 3 eixos por miografia</td><td></td><td></td><td></td>de pressão</tr><tr><td></td><td>Scientifica</td><td>LBM-7&nbsp;</td><td>x2 (ou qualquer produto equivalente)</td></tr><tr><td>Torneiras de 3 vias</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Mesa de ar</td><td>Technical Manufacturing Corporation&nbsp;</td><td>Bancada limpa</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Software de análise&nbsp;</td><td>Imagem J</td><td>https://downloads.imagej.net/fiji/</td> <td>Software de imagem gratuito</td></tr><tr><td>Plugin de análise</td><td>Myotraker&nbsp;</td><td>https://doi.org/10.1371/journal.pone.0091791.s002</td><td>Plugin personalizado para imageJ Disponível gratuitamente para download</td></tr><tr><td>Pipeta de canulação de vidro</td><td>Mundo Percision instrumentos</td><td>TW150F-4</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Computador</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Termômetro digital</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Fluo-4-AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F14201</td><td>Faça 1 mM de estoque em DMSO</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>Dumont #7 14097</td><td>Qualquer fórceps fino equivalente</td></tr><tr><td>Fura-2-AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F1221</td><td>Faça 1 mM de estoque em DMSO</td></tr><tr><td>Câmara de gravação com fundo de vidro</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Copo</td> <td>de pipeta auxiliarInstrumentos</td><td>IB150F-3</td> de Percision do mundo <td>Ou todo</td></tr><tr><td>o calefator em linha</td> equivalente do produto <td>Equilavent comercial feito-à-medida SH-27B Solução In-Line calefator do instrumento de Harvard</td><td></td> Microscópio invertido Nikon Eclypse TE 300 Ou todo o produto equivalente Manômetro Riester LF1459 Ou todo o produto equivalente Extrator do microelectrodo <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Instrumentos Sutter</td><td>P97</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Microforge +&nbsp; Microscópio Olympus CX 31</td><td>Glassworks</td><td>Fine Point F-550</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Instrumentos Sutter</td><td>MP-285</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Manifold de entrega multicanal&nbsp;</td><td>Lápis de</td><td>Perfusão</td> Científica <td>Automatizado Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Enchimento de pipetas&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>1mL</td><td>Seringa aquecida e puxada para o diâmetro interno da pipeta</td></tr><tr><td>Suporte de pipeta</td><td>Dispositivos Moleculares</td><td>1-HL-U</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Bomba de sucção</td><td>Interpet</td><td>AP1</td><td>Bomba de aeração convertida por fole reversível</td></tr><tr><td>Seringa</td><td>BD Plastipak</td><td>20mL Luer-lok</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Fio de tungstênio</td><td>Advento</td><td>W558818</td><td>75&mu; m de diâmetro</td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>VWR</td><td>diversos tamanhos</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Câmera USB</td><td>&nbsp; A Logitech&nbsp;</td><td>HD Pro Webcam C920</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Software de captura de vídeo</td><td>Hypercam</td><td>versão 2.28.01</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Banho maria</td><td>Grant</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>lente x20</td><td>Nikon</td><td>20x/0.40 WD 3.8, &infin;/0.17</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>lente x4</td><td>Nikon</td><td>4x/0.10, WD 30, &infin;/-</td><td>Ou qualquer Conectores</td></tr><tr><td>Y de produtos equivalentes</td><td>World Percision Instruments</td><td>14012</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Patch clamping</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>torneiras de 3 vias</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>Ou qualquer manipulador</td></tr><tr><td>mecânico de 3 eixos</td> de produtos <td>equivalentes Scientifica</td><td>LBM-7&nbsp;</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Mesa de ar</td><td>Technical Manufacturing Corporation&nbsp;</td><td>Bancada Limpa</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Anfotericina B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2411</td><td>3 mg dissolvido diariamente em 50 &mu; L de DMSO (sonicado para dissolver)</td></tr><tr><td>Amplificador</td><td>Molecular Devices</td><td>Axopatch 200a</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Conversor digital analógico</td><td>Axon</td><td>Digidata 1440A</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Colagenase Tipo 1A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9891&nbsp;</td><td>0,1 mg / mL em LCH</td></tr><tr><td>Computador</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Termômetro Digital</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Millipore</td><td>260913</td><td>Estoque de trabalho 1 MU mL-1 (10 MU diluído em 10 mL LCH)&nbsp;</td></tr><tr><td>Gaiola de Faraday</td><td>Feito-à-medida</td><td></td><td>Algum produto comercial equivalente</td></tr><tr><td>Pinça fina</td><td>Dumont</td><td>No. 7</td><td>Qualquer pinça superfina</td></tr><tr><td>Câmara de gravação com fundo de vidro</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Headstage</td><td>Molecular</td><td>Devices CV203BU</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Aquecedor em linha</td><td>Feito sob medida</td><td></td><td>Solução equivalente comercial SH-27B Aquecedor em linha do aparelho Harvard</td></tr><tr><td>Microscópio invertido</td><td>Nikon</td><td>Eclypse TE 300</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Extrator de microeletrodos</td><td>Instrumentos</td><td>Sutter P97</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Microforge +&nbsp; Microscópio Olympus CX 31</td><td>Glassworks</td><td>Fine Point F-550</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Micromanipulador</td><td>Instrumentos Sutter</td><td>MP-285</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Manifold de entrega multicanal&nbsp;</td><td>Automatize o Lápis</td> de <td>Perfusão</td><td>Científica Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Software de Patching</td><td>Molecular Devices</td><td>Pclamp v10.2</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Enchimento de pipetas&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>1mL</td><td>Seringa aquecida e puxada para o diâmetro interno da pipeta</td></tr><tr><td>Suporte de pipeta</td><td>Dispositivos Moleculares</td><td>1-HL-U</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Protease Tipo XIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5147&nbsp;</td><td>0,01 mg / mL em LCH</td></tr><tr><td>Pipeta de vidro de canal único</td><td>Instrumentos de precisão mundial</td><td>IB150F-3</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Bomba de sucção</td><td>Interpet</td><td>AP1</td><td>Bomba de aeração convertida por fole reverso</td></tr><tr><td>Seringa</td><td>BD Plastipak</td><td>20mL Luer-lok</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Fio de tungstênio</td><td>Advento</td><td>W557418</td><td>50&mu; m de diâmetro</td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>VWR</td><td>diversos tamanhos</td><td>Qualquer produto equivalente para se ajustar à</td></tr><tr><td>câmera USB</td><td>&nbsp; A Logitech&nbsp;</td><td>HD Pro Webcam C920</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Grant</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Vidro de pipeta de célula inteira</td><td>Warner Instruments</td><td>GC150TF-7.5</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>lente x20</td><td>Nikon</td><td>20x/0.40 WD 3.8, &infin;/0.17</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>lente x4</td><td>Nikon</td><td>4x/0.10, WD 30, &infin;/-</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>lente x40</td><td>Nikon</td><td>40x / 0.55, WD 2.1, Y / 1.2</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Y - conectores World</td><td>Percision Instruments</td><td>14012</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Ca2 + imaging</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 vias torneiras</td><td>Cole-Parmer</td><td>UY-30600-02</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>3 eixos manipulador mecânico</td><td>Scientifica</td><td>LBM-7&nbsp;</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Software de aquisição&nbsp;</td><td>Cairn Pesquisa Ltda.</td><td>Motor de Aquisição V1.1.5</td><td>Ou qualquer produto equivalente; microfluorimetria</td></tr><tr><td>Air table</td><td>Technical Manufacturing Corporation&nbsp;</td><td>Bancada Limpa</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Software de análise para imagem confocal</td><td>Imagem J</td><td>https://downloads.imagej.net/fiji/</td> <td>Software de imagem gratuito</td></tr><tr><td>Computador</td><td>Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Microscópio confocal</td><td>Leica Geosystems</td><td>SP5&nbsp;</td><td>Ou algum produto equivalente; confocal</td></tr><tr><td>Termômetro digital</td><td>RS</td><td>206-3722</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Pinça fina</td><td>Dumont</td><td>No. 7</td><td>Qualquer pinça superfina</td></tr><tr><td>Câmara de gravação com fundo de vidro</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0759</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Aquecedor em linha</td> Aquecedor comercial SH-27B <td>feito sob medida</td><td></td><td>Aquecedor em linha do aparelho de Harvard</td></tr><tr><td>invertido microscópio</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE2000</td><td>Ou qualquer produto equivalente; microfluorimetria</td></tr><tr><td>Monocromador&nbsp;</td><td>Cairn Pesquisa Ltda.</td><td>Optoscan</td><td>Ou qualquer produto equivalente; microfluorimetria</td></tr><tr><td>Manifold de entrega multicanal&nbsp;</td><td>Lápis de</td><td>Perfusão</td> Científica <td>Automatizado Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Enchimento de pipetas&nbsp;</td><td>BD Plastipak</td><td>1mL</td><td>Seringa aquecida e puxada para o diâmetro interno da pipeta</td></tr><tr><td>Software para microscópio confocal</td><td>Leica Geosystems</td><td>LAS-AF versão 3.3.</td><td>Ou algum produto equivalente; confocal</td></tr><tr><td>Bomba de sucção</td><td>Interpet</td><td>AP1</td><td>Bomba de aeração convertida por fole reverso</td></tr><tr><td>Seringa</td><td>BD Plastipak</td><td>20mL Luer-lok</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Fio de tungstênio</td><td></td><td>Advent W557418</td><td>50&mu; m diâmetro</td></tr><tr><td>Tygon Tubing</td><td>VWR</td><td>diversos tamanhos</td><td>Qualquer produto equivalente para caber</td></tr> em <tr><td>banho-maria</td><td>Grant</td><td>Sub Aqua 12 Plus</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr> lente <tr><td>x100</td><td>Nikon</td><td>x100 N.A. 1.3 óleo</td><td>Ou qualquer produto equivalente; microfluorimetria</td></tr><tr><td>x20 lente</td><td>Nikon</td><td>20x/0.40 WD 3.8, &infin;/0.17</td><td>Ou qualquer produto equivalente; microfluorimetria</td></tr><tr><td>lente x20</td><td>Leica Geosystems</td><td>HCX PL FLUOTAR, 20x/0.50, &infin;/0.17/D</td><td>Ou qualquer produto equivalente; lente confocal</td></tr><tr><td>x4</td><td>Nikon</td><td>4x/0.10, WD 30, &infin;/-</td><td>Ou qualquer produto equivalente; lente de microfluorimetria</td></tr><tr><td>x63</td><td>Leica Geosystems</td><td>HCX PL APO, 63x/1.40 - 0.60 OIL CS &infin;/0.17/E</td><td>Ou qualquer produto equivalente; conectores Y confocais</td></tr><tr><td></td><td>World Percision Instrumentos</td><td>14012</td><td>Ou qualquer produto equivalente</td></tr><tr><td>Pipetas<</td><td></td><td></td><td>strong>Especificações e configurações para fabricação de pipetas para experimentação</td></tr><tr><td>Helper pipeta</td><td>World Percision instruments</td><td>IB150F-3</td><td>Diâmetro interno: 0,86 mm Rampa: 261 Pressão: 300 Calor: 280 Puxar : 0 Velocidade: 56 Tempo: 250 Nº de ciclos: 4 Diâmetro da ponta: 0,5-2 &mu; m Polimento: sim Resistência Final: >10 M&Omega;</td></tr><tr><td>Pipeta de canulação</td><td>Instrumentos World Percision</td><td>TW150F-4</td><td>Diâmetro interno: 1,17 mm Rampa: 290 Pressão: 300 Calor: 280 Tração: 0 Velocidade: 58 Tempo: 150 Nº de ciclos: 4 Diâmetro da ponta: 3-10 &mu; m Polimento: no Resistência Final: < 1 M&Omega;</td></tr><tr><td>Instrumentos de remendo na célula</td><td>World Percision</td><td>IB150F-3</td><td>Diâmetro interno: 0,86 mm Rampa: 261 Pressão: 300 Calor: 280 Tração: 0 Velocidade: 56 Tempo: 250 Nº de ciclos: 4 Diâmetro da ponta: 0,5-2 &mu; m Polimento: sim Resistência Final: >5 M&Omega;</td></tr><tr><td>Patch de célula inteira</td><td>Warner Instruments</td><td>GC150TF-7.5</td><td>Diâmetro interno: 1,17 mm Rampa: 296 Pressão: 200 Calor: 287 Tração: 0 Velocidade: 50 Tempo: 250 Número de ciclos: 4 Diâmetro da ponta: 2-3 &mu; m Polimento: útil mas não necessário Resistência Final: 1-2 M&Omega;</td></tr></tbody></table>

isolamento de arteríolas retina para estudos de fisiologia celular ex vivo

Isolation of Retinal Arterioles for Ex Vivo Cell Physiology Studies

A retina é um tecido altamente metabolicamente ativo que requer uma fonte substancial de sangue. A circulação da retina suporta a retina interior, enquanto os vasos da coroide fornecem os fotorreceptores. Alterações na perfusão retiniana contribuam para inúmeros transtornos visão em risco, incluindo retinopatia diabética, glaucoma e retina ramo veia oclusões. Compreender os mecanismos moleculares envolvidos no controle do fluxo de sangue através da retina e como estas são alteradas durante a doença ocular pode levar à identificação de novos alvos para o tratamento dessas condições. Arteríolas retina são os vasos de resistência principal da retina e, por conseguinte, um papel fundamental na regulação da retina hemodinâmica através de alterações no diâmetro luminal. Nos últimos anos, desenvolvemos métodos para isolar arteríolas da retina rato que são adequadas para uma ampla gama de aplicações, incluindo estudos de fisiologia celular. Esta preparação já começou a produzir novos insights sobre como o fluxo sanguíneo é controlado na retina e nos permitiu identificar algumas das principais mudanças que ocorrem durante a doença ocular. Neste artigo, descrevemos os métodos para o isolamento de arteríolas da retina de ratos e incluem protocolos para a sua utilização em eletrofisiologia remendo-braçadeira, imagem latente de cálcio e estudos miografia de pressão. Estes vasos também são favoráveis para uso em PCR-, ocidental mancha e imuno-histoquímica-com base em estudos.

Este manuscrito descreve um protocolo simples para o isolamento de arteríolas da retina rato que podem ser usados em, cálcio imaging e pressão miografia Estudos eletrofisiológicos.

Isolamento de arteríolas retina para estudos de fisiologia celular Ex Vivo

The retina is a highly metabolically active tissue that requires a substantial blood supply. The retinal circulation supports the inner retina, while the ...

Compreender como o fluxo sanguíneo é controlado na retina é um objetivo importante, pois o fluxo sanguíneo anormal tem sido implicado no desenvolvimento de uma variedade de doenças retinianas que ameaçam a visão, como retinopatia diabética, glaucoma e oclusões de veias ramificadas. As arteríolas retinianas desempenham um papel fundamental na regulação do fluxo sanguíneo na retina, dilatando e contraindo seu diâmetro luminal, mediado por alterações na contratilidade das células musculares lisas que circundam esses vasos. Compreender os mecanismos moleculares subjacentes à regulação da perfusão retiniana, portanto, requer preparações onde as células do músculo liso arteriolar da retina possam ser acessadas e estudadas em condições o mais próximas possível do fisiológico.Neste vídeo, demonstramos um protocolo simples para o isolamento de arteríolas da retina de ratos que pode ser usado em estudos de patch clamp, imagens de cálcio e miografia de pressão. Nos últimos anos, esta preparação tem sido usada para fornecer mais informações sobre a regulação da contratilidade do músculo liso vascular e do fluxo sanguíneo na retina, tanto na saúde quanto na doença. Faça uma solução de um litro de baixo teor de cálcio contendo Hanks'or LCH, conforme mostrado na tabela de materiais.Monte o equipamento de isolamento antes da coleta de tecido. A pipeta de vidro Pasteur deve ser polida com fogo para alisar, mas não estreitar a ponta. Apare uma pipeta de plástico em uma abertura de aproximadamente cinco a sete milímetros.Coloque os olhos na placa de dissecação, imersos em solução LCH. Use um conjunto de pinças para ancorar o olho ao prato, segurando os anexos do músculo orbital ou o nervo óptico. Certifique-se de que o ponto de ancoragem esteja o mais próximo possível da esclera para estabilizar o olho.Usando a lâmina, corte a córnea ao longo da ora serrata e remova a lente pressionando suavemente a esclera com uma pinça. A pequena região circular que vemos na parte de trás do olho nesta imagem é o nervo óptico. Usando a lâmina, corte a ocular ao meio simetricamente através do disco óptico.Usando uma pinça fechada, escove suavemente as retinas das duas metades da ocular, tomando cuidado para remover quaisquer anexos restantes no disco óptico. Repita o processo com o segundo olho e transfira as retinas dissecadas para o tubo de ensaio usando a pipeta de plástico e uma pequena gota de meio LCH. Usando a pipeta de plástico, encha o tubo de ensaio com LCH até aproximadamente cinco mililitros e permita que as retinas se depositem no fundo do tubo.Lave o tecido aproximadamente três vezes, removendo aproximadamente quatro mililitros de solução do tubo e adicionando LCH fresco usando a pipeta de plástico. Quando necessário, o tecido estranho deve ser removido. Lave o interior da pipeta Pasteur de vidro com ponta polida com LCH para evitar que o tecido grude na pipeta.Usando a mesma pipeta, remova aproximadamente quatro mililitros de solução do tubo de ensaio e adicione aproximadamente dois mililitros de LCH fresco. Dissocie suavemente as retinas puxando o tecido através da ponta da pipeta de vidro lentamente e expulse o conteúdo para o tubo de ensaio. Tente não introduzir bolhas nesta fase e repita o processo até que as retinas estejam quebradas até o tamanho de aproximadamente dois a três milímetros quadrados.Lave o interior da pipeta com aproximadamente dois mililitros de LCH e expulse-o para o tubo de ensaio. Deixe o conteúdo assentar no fundo por cinco a 10 minutos. Repita o processo de trituração conforme descrito anteriormente com um pouco mais de força até que os pedaços de tecido tenham aproximadamente um milímetro quadrado de tamanho.Deixe o tecido assentar e repita mais uma vez com ainda mais força até que o conteúdo esteja totalmente homogeneizado e nenhum pedaço de retina permaneça. A solução nesta fase deve parecer leitosa na aparência. Esta técnica produzirá até oito segmentos de arteríola por isolamento, medindo de 200 a 2.500 micrômetros de comprimento.A canulação de uma extremidade da arteríola com oclusão da extremidade oposta permite a medição da vasoconstrição induzida por pressão, também conhecida como resposta miogênica. A miografia de pressão arteriolar é realizada da seguinte forma. Uma alíquota de homogeneizado de retina é transferida para uma câmara de registro fisiológico montada no estágio de um microscópio invertido.Deixar o homogeneizado assentar no fundo da câmara durante, pelo menos, cinco minutos. Examine visualmente a câmara de registro para identificar arteríolas com mais de 200 micrômetros de comprimento e que possuam uma extremidade aberta através da qual o vaso possa ser canulado. Ancore em uma extremidade da embarcação usando uma pinça fina e uma pequena tira de fio de tungstênio colocada sobre a embarcação.Usando as extremidades sobrepostas do fio de tungstênio, manobre o vaso para correr horizontalmente pelo banho, de modo que a extremidade aberta fique alinhada com a cânula de pressurização. Perfundir a câmara com zero cálcio Hanks'at 37 graus Celsius. As canulações são realizadas com pipetas de vidro.A cânula é posicionada na extremidade aberta do vaso usando um micromanipulador fino. A ponta é posicionada imediatamente adjacente à abertura, conforme avaliado ajustando o plano de foco no microscópio, de modo que tanto a extremidade do vaso quanto a ponta da cânula estejam em foco ao mesmo tempo e a cânula de pressurização avance para a abertura do vaso. Uma pipeta auxiliar é necessária para auxiliar no processo de canulação e é usada para conter suavemente a arteríola e guiar a parede arteriolar sobre a cânula de pressurização ao mesmo tempo em que a cânula avança para o lúmen do vaso.Este procedimento requer movimento simultâneo e controlado de ambos os manipuladores e prática extensiva para alcançar uma alta taxa de sucesso. Após um minuto de registro a zero milímetros de mercúrio, a pressão intraluminal é aumentada para 40 milímetros de mercúrio, e o vaso deve dilatar rapidamente, confirmando o sucesso da canulação. A vasoconstrição induzida por pressão, ou seja, a resposta miogênica, se desenvolverá posteriormente em um período de aproximadamente 15 minutos.O registro de patch clamp de células musculares lisas vasculares da retina permite a investigação das correntes iônicas da membrana plasmática que regulam o cálcio intracelular e, portanto, a contratilidade celular. A gravação de células inteiras e de canal único é possível a partir de células musculares lisas individuais ainda incorporadas em suas arteríolas parentais da seguinte forma. As arteríolas da retina são isoladas e ancoradas na câmara de registro com deslizamentos de fio de tungstênio.A lâmina basal precisa ser digerida para permitir que uma vedação de alta resistência seja formada entre a pipeta de remendo e a membrana celular do músculo liso arteriolar. As arteríolas são superfundidas com uma série sequencial de soluções enzimáticas a 37 graus Celsius, o que também resulta no desacoplamento elétrico das células adjacentes, conforme indicado pelas setas na imagem. O nível de digestão é inicialmente avaliado na separação visual das camadas endotelial e muscular lisa durante a etapa de colagenase.A remoção de quaisquer fitas remanescentes da lâmina basal e/ou neurópilo periférico é obtida varrendo cuidadosamente as pontas fechadas da pinça fina ao longo da superfície do vaso. Para o clampeamento do remendo, a ponta da pipeta de adesivo é posicionada verticalmente sobre a célula de interesse e abaixada gradualmente usando o movimento fino e lento do micromanipulador para fazer contato com a membrana do músculo liso arteriolar. Isso é julgado pelo movimento celular e uma mudança na resistência da pipeta, medida usando um protocolo de teste de vedação celular no software de aquisição.À medida que a pipeta é abaixada na célula, a resistência da vedação aumenta aproximadamente cinco vezes. A pressão negativa é aplicada transitoriamente na parte traseira da pipeta e um gigaseal é formado gradualmente. Isso requer aplicações repetidas de pressão negativa ao longo de um a cinco minutos.Para gravação de células inteiras, o método de patch-clamp perfurado é predominantemente usado. Um gigaseal é formado, conforme descrito anteriormente, com uma pipeta contendo solução intracelular e anfotericina B. A resistência de acesso é monitorada usando o protocolo de teste de membrana no software de aquisição. Uma vez que a resistência de acesso cai para menos de 15 megaohms, a compensação da resistência em série é realizada.Normalmente, é possível compensar a resistência em série em aproximadamente 75% no modo de remendo perfurado. Passos de tensão ou protocolos de rampa podem então ser usados para medir correntes de células inteiras. Após a dissociação da retina, as arteríolas primárias, secundárias e pré-capilares podem ser identificadas com base em seu calibre e no arranjo das células musculares lisas vasculares.As arteríolas de primeira e segunda ordem parecem visualmente semelhantes à microscopia de campo claro, mas podem ser distinguidas com base em seu tamanho. As arteríolas pré-capilares são os menores vasos arteriais na preparação e são facilmente reconhecíveis devido ao arranjo intermitente das células musculares lisas vasculares. As arteríolas isoladas podem ser claramente diferenciadas dos capilares e vênulas dentro do isolamento.Os capilares são aparentes como uma malha de vasos de pequeno calibre com aproximadamente quatro a 10 micrômetros de diâmetro, enquanto as vênulas são de paredes finas e carecem de cobertura de células musculares lisas. As arteríolas primárias, secundárias e pré-capilares são adequadas para miografia de pressão, imagens de cálcio e estudos de patch-clamp. Usando arteríolas pressurizadas, investigamos os mecanismos moleculares envolvidos na geração da resposta miogênica.As fotomicrografias nesta imagem mostram uma arteríola retiniana de rato em vários pontos de tempo durante o curso de um experimento de miografia de pressão. O gráfico de curso de tempo abaixo mostra as mudanças no diâmetro do vaso durante todo o curso do experimento. Imediatamente após a pressurização, o vaso se dilata, seguido por uma constrição miogênica ativa que atinge um nível de estado estacionário após 15 minutos.A adição de wortmannin em uma solução de Hanks com zero cálcio no final do experimento dilata o vaso até seu diâmetro passivo para fins de normalização. Este slide mostra um exemplo de uma gravação de patch-clamp de canal único de uma célula muscular lisa da arteríola da retina antes e depois do estiramento da membrana. Este adesivo on-cell contém dois canais TRPV2 ativados por estiramento, cuja atividade aumenta com a aplicação de pressão negativa na pipeta de patch.Os protocolos descritos aqui exigem prática, mas devem ser alcançados com o mínimo de solução de problemas. Recomendamos o uso das arteríolas isoladas no mesmo dia do isolamento. O método é otimizado para arteríolas retinianas de ratos, mas pode ser usado em retinas de camundongos.Agora, usamos essa preparação extensivamente, mas, sempre que possível, também tentamos validar nossas principais descobertas usando montagens inteiras de retina ex vivo e medições in vivo do diâmetro dos vasos sanguíneos e do fluxo sanguíneo.

isolation-of-retinal-arterioles-for-ex-vivo-cell-physiology-studies

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ex vivo O ERG pode ser usado para registrar a atividade elétrica das células da retina diretamente de retinas intactas isoladas de animais ou humanos. Demonstramos aqui como os sistemas ERG in vivo comuns podem ser adaptados para gravações de ERG ex vivo, a fim de dissecar a atividade elétrica das células da retina.

Simultâneo<em&gt; Ex vivo</em&gt; Teste Funcional de Dois retinas por<em&gt; In vivo</em&gt; Sistema Eletrorretinograma

Muitas doenças oculares visão em risco estão associadas com microvessels da retina disfuncional. Portanto, a medição das respostas arteríola retinal é importante para investigar os mecanismos fisiopatológicos subjacentes. Este artigo descreve um protocolo detalhado para isolamento de rato arteríola retinal e preparação para avaliar os efeitos de substâncias vasoativas no diâmetro vascular.

Etapas de preparação para medição de reatividade no Mouse arteríolas retina Ex Vivo

Vamos demonstrar três técnicas de preparação de tecidos diferentes para visualização de imuno-histoquímica de pericitos microvascular da retina do rato, ou seja, crio-seções, todo-montagens e hipotônica isolamento da rede vascular.

Cryo-seções da retina, todo-montagens e hipotônica vasculatura isolada preparações para visualização de imuno-histoquímica de pericitos Microvascular

O protocolo descreve explanações organotípicas daretina neurodo camundongo, cultivadas juntamente com seu epitélio pigmento retiniano (RPE), em meio definido r16, livre de soro e antibióticos. Este método é relativamente simples de executar, menos caro e demorado quando comparado com experimentos in vivo, e pode ser adaptado a inúmeras aplicações experimentais.

Cultivo de longo prazo, sem soro de explantes de retina de rato organotipo com epitélio pigmento de retina intacto

Este artigo descreve um ensaio bem estabelecido e reprodutível de manchas de lectina para toda a preparação da retina do montagem e os protocolos necessários para a medição quantitativa dos parâmetros vasculares frequentemente alterados em retinopatias proliferativas e não proliferativas.

Quantificação de Parâmetros Vasculares em Retinas inteiras de Camundongos com Retinopatias Não Proliferativas e Proliferativas

Este protocolo descreve um método para o isolamento de células endoteliais da retina pós-natais murinas otimizado para o rendimento, pureza e viabilidade celular. Essas células são adequadas para abordagens de sequenciamento de próxima geração.

Isolamento de células endoteliais da retina murinas para sequenciamento de próxima geração

A preparação intensiva de "tubos" endoteliais cerebrais intactos de arteriolas parenchímicas cerebrais é ilustrada para o estudo da regulação do fluxo sanguíneo cerebral. Além disso, demonstramos os pontos fortes experimentais deste modelo de estudo endotelial para a medição de imagens de fluorescência e eletrofisiologia das principais vias de sinalização celular, incluindo alterações no potencial intracelular [Ca2+] e membrana.

Isolamento e Análise Funcional do Endotélio Arteriolar do Cérebro do Rato Parenchyma

Este manuscrito descreve um protocolo simplificado para o isolamento de células de epitélio pigmentado da retina (RPE) a partir de olhos de rato de forma stepwise. O protocolo inclui a enucleação e dissecação dos olhos do rato, seguido pelo isolamento, semeadura e cultivo de células RPE.

Isolamento das células epitélio pigmentadas do rato primário

Este protocolo apresenta e descreve as etapas para o isolamento, dissecção, cultivo e coloração de explantes de retina obtidos de um camundongo adulto. Este método é benéfico como um modelo ex vivo para o estudo de diferentes doenças neurovasculares da retina, como a retinopatia diabética.

Explante Retiniano da Retina de Rato Adulto como Modelo Ex Vivo para o Estudo de Doenças Neurovasculares da Retina

Um ensaio de proteção foi desenvolvido para monitorar a resiliência da vasculatura retiniana à morte por diabetes/insultos relacionados à retinopatia diabética, como estresse oxidativo e citocinas.

Um ensaio para detectar a proteção da vasculatura retiniana contra a morte relacionada ao diabetes em camundongos

Aqui, fornecemos uma metodologia detalhada para isolar a retina do olho do camundongo para experimentação ex vivo estendida. Este protocolo enfatiza tornar essa abordagem tecnicamente exigente acessível para pesquisadores que gostariam de aproveitar os caminhos de pesquisa oferecidos pela manutenção da glia retiniana in situ em tecido vivo.

Um modelo de explante ex vivo para estudar interações gliais na retina de camundongos

Aprenda a isolar arteríolas da retina de ratos para estudos de fisiologia vascular ex vivo. Este método permite investigar a contratilidade do músculo liso e a regulação do fluxo sanguíneo retiniano em doenças oculares.

Isolamento de arteríolas retina para estudos de fisiologia celular Ex Vivo

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