Avaliação de saúde de peixes selvagens baseada em necropsia

A avaliação da saúde dos peixes baseada em necropsia é usada para avaliar a saúde de peixes selvagens para monitoramento de rotina, estudos específicos comparando locais e como base para coleta de tecidos para análises mais aprofundadas. Os peixes são constantemente expostos a uma combinação de estressores, como misturas complexas de produtos químicos, patógenos e parasitas. Essas combinações de estressores podem levar a efeitos adversos, como redução da resistência a doenças, câncer e falha reprodutiva.

As técnicas demonstradas permitem uma avaliação padronizada de anormalidades visíveis e a coleta de sangue e tecidos para histopatologia, otólitos para idade e tecidos para outras análises a jusante. Primeiro, demonstraremos a avaliação de rotina baseada em necropsia com coleta de sangue, otólito e tecido para histopatologia usando um peixe. A coleta de rim anterior para ensaios de função imunológica e fígado ou outro tecido para expressão gênica são adições a este método que também demonstraremos.

É importante coletar tecidos o mais rápido possível para evitar alterações post mortem. Portanto, geralmente temos um processo de linha de montagem com duas a três pessoas coletando tecidos e alguém registrando os dados. Heather Walsh e Cheyenne Smith, estudantes de doutorado da West Virginia University e Ryan Braham, um recém-formado em doutorado, demonstrarão as várias etapas do processo.

Depois de coletar e sacrificar os peixes de acordo com as diretrizes institucionais, pesar e medir os peixes e obter uma amostra de sangue. Em seguida, meça o comprimento total do peixe da ponta do focinho até o final da cauda. Insira uma seringa de três CC com uma agulha de calibre 22 ou 23, previamente revestida com heparina, anterior à área caudal abaixo da linha lateral.

Incline a necessidade para cima até atingir a coluna e retire-a ligeiramente para obter uma amostra de sangue. Antes de transferir a amostra de sangue para um tubo de coleta, remova a agulha e coloque-a em uma lixeira para objetos cortantes. Para viagens de um dia, o sangue pode ser mantido em gelo úmido até o retorno ao laboratório.

Em seguida, é centrifugado para remover o plasma que foi armazenado a 80 graus Celsius negativos até ser analisado. Se não retornar ao laboratório todos os dias, é necessária uma centrífuga e armazenamento de gelo seco. Em seguida, documente quaisquer anormalidades ou lesões externas no corpo, barbatanas, olhos e brânquias dos peixes.

Inspecione os peixes em busca de parasitas externos, como sanguessugas, larvas, cistos metacercariais de trematódeos e parasitas branquiais. Em seguida, use uma tesoura para abrir a cavidade abdominal da região anal até o opérculo. Remova a aba do músculo para expor os órgãos internos.

Examine os órgãos internos e documente descolorações gerais e focais, presença de áreas elevadas, cistos, parasitas e anormalidades de tamanho. Em seguida, para remover o fígado, corte a artéria hepática e o tecido conjuntivo da extremidade anterior. Levante suavemente o fígado da carcaça e apare todas as aderências e conexões com os intestinos e a gordura adiposa, tomando cuidado para não perfurar a vesícula biliar.

Pese o fígado. Em seguida, obtenha o índice hepatossomático conforme descrito no protocolo de texto. Em seguida, remova as gônadas e pese-as.

Com cuidado, sem puxar, corte pequenas amostras de tecido. Coloque as amostras de tecido de um peixe no mesmo recipiente. Em seguida, corte pelo menos cinco, três a quatro milímetros de espessura de várias regiões do fígado e coloque-os no recipiente fixador.

Dependendo do tamanho, coloque uma gônada inteira ou pedaços de uma gônada no recipiente fixador. Em seguida, coloque órgãos inteiros menores e pedaços de outros órgãos maiores no recipiente fixador. Se forem observados tecidos anormais, preserve um pedaço adjacente adicional de tecido normal.

Numerosas estruturas, como escamas, raios de barbatana e otólitos, podem ser usadas para envelhecer peixes. Aqui estamos usando otólitos, pois são os mais precisos. Primeiro, corte o istmo branquial e dobre a cabeça para trás.

Em seguida, para localizar a bula proótica, retire os tecidos conjuntivo e muscular ao redor das porções inferiores do neurocrânio. Use um cortador de ossos para quebrar a bolha proótica e expor os otólitos. Os otólitos devem ser visíveis a olho nu.

Coloque os otólitos em um frasco rotulado e sem tampa e armazene-os em temperatura ambiente até que a análise da idade possa ser realizada. A exposição a vários produtos químicos e outros estressores ambientais pode causar imunossupressão. Linfócitos, macrófagos e granulócitos podem ser isolados desse tecido e em laboratório sua capacidade de matar patógenos, produzir anticorpos, responder a células tumorais e outras funções podem ser medidas.

Usando tesoura estéril, bisturi e fórceps removem o tecido renal anterior. Coloque a amostra do rim anterior no meio apropriado para manter as células vivas. Use um moedor de lenços de papel portátil estéril para homogeneizar a amostra em suspensões de célula única.

E segure as amostras em gelo úmido. Para preservação do RNA, coloque dois a três pequenos pedaços de fígado no conservante apropriado em uma proporção de 10 para um de conservante para tecido. Neste estudo, os sugadores brancos foram coletados em três áreas de preocupação dos Grandes Lagos, ou AOCs, e no local de referência do rio Kewanee.

A porcentagem de peixes com tumores externos variou de 15,5% no AOC de St.Louis a 58% no AOC de Milwaukee. Vários tipos de lesões externas foram observados, incluindo manchas brancas discretas, lesões mucoides levemente elevadas e grandes lesões papilomatosas. Muitas das manchas brancas discretas e lesões mucoides observadas neste estudo, particularmente no sítio de referência de Kewanee, eram lesões hiperplásicas em oposição à neoplasia.

A análise histopatológica também identificou tumores hepáticos que não eram identificáveis com a observação visual. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 15 a 20 minutos por peixe, se for executada corretamente. Ao tentar este procedimento, é importante saber o que é normal para sua espécie em particular e ser o mais consistente e preciso possível na descrição de anormalidades.

Inclua tamanho, cor, textura e localização. A documentação fotográfica é útil. Essa técnica pode ser usada para qualquer espécie de peixe e é útil para documentar a saúde dos peixes tanto espacial quanto temporalmente para entender melhor os efeitos adversos dos estressores ambientais e identificar doenças invasivas.