Biossensor óptico
Biosensores ópticos utilizam a luz para detectar a ligação de uma molécula alvo. Esses sensores podem utilizar uma molécula de rótulo, que produz um s…
Biosensores ópticos são sensores que detectam um alvo biológico ou alvos de interesse usando a luz. Esses dispositivos encontraram aplicações em saúde, produtos farmacêuticos, monitoramento ambiental, Segurança Interna e até mesmo no campo de batalha. Os biosensores ópticos são amplamente divididos em sensores baseados em rótulos e sem rótulos. Um exemplo de sensoriamento baseado em rótulos é a Polymerase Chain Reaction, ou PCR, que usa rótulos fluorescentes, ou fluoroforos, para quantificar o DNA alvo amplificado. Um exemplo de método livre de rótulos é Surface Plasmon Resonance, ou SPR. Aqui, a interação sem alterações biomoléculas com a superfície do sensor é quantificada medindo uma característica fundamental do sensor, como o ângulo de reflexão. Este vídeo revisa o básico desses tipos de técnicas de biosensagem óptica e seus componentes críticos, os princípios de trabalho e aplicações comuns de biosensores ópticos.
Primeiro, vejamos os princípios gerais da biosensação óptica baseada em rótulos. Normalmente, uma sonda ou elemento de biorecognição, como um anticorpo complementar, é anexado na superfície do sensor usando a química tradicional de imobilização. A solução amostral é então fluída sobre a superfície dos sensores. A molécula alvo, que é complementar ao elemento biorecognição imobilizado, é capturada seletivamente a partir da complexa solução amostral. Em seguida, a solução de amostra em excesso é lavada com tampão ou água. Em seguida, para ajudar a visualizar e quantificar a quantidade de alvo vinculado, uma molécula secundária que é complementar ao alvo e anexada a um fluoróvo, é fluída através do sistema. Depois de algum tempo, quando a ligação da molécula secundária ao alvo ocorreu, o excesso de fluoróforo desvinculado é lavado. A intensidade do fluoróforo ligado pode então ser quantificada usando um microscópio fluorescente. Esta intensidade é primeiramente traçada para várias concentrações de alvo conhecidas para criar uma curva de calibração, que permite então a medida direta de uma quantidade desconhecida de alvo capturado. Assim, as técnicas baseadas em rótulos utilizam a intensidade de fluorescência de fluoroforos extremamente sensíveis para quantificar a concentração da biomolécula de interesse.
Agora que revisamos os princípios dos biosensores ópticos baseados em rótulos, vamos dar uma olhada em um exemplo comumente usado, o padrão atual para amplificação de DNA, PCR Quantitativo ou qPCR. A mistura de reação qPCR inclui uma sonda rotulada para quantificação de reação em tempo real. A sequência da sonda é anexada a moléculas fluorescentes e quencher, e se liga a uma sequência de DNA específica. A molécula saciador sacia a emissão do fluoróforo enquanto ambas estão ligadas à sonda. Durante a reação do PCR, a enzima polimerase degrada o DNA da sonda e separa fisicamente o repórter fluoróforo, impedindo assim a sacieçação e resultando em um aumento da fluorescência. Para executar qPCR, primeiro adicione todos os componentes da reação, incluindo os sondas rotuladas, em um tubo PCR ou bem. Em seguida, coloque os poços pcr em um termociclador especializado e insira os parâmetros para cada ciclo e o número de ciclos. O termociclador usado para qPCR inclui uma fonte de luz com os componentes ópticos necessários para selecionar um comprimento de onda e um detector para medir a intensidade da fluorescência em tempo real durante a reação do PCR. No final de cada ciclo térmico, a intensidade fluorescente devido aos Fluoroforos liberados é registrada e plotada. A intensidade fluorescente é diretamente proporcional ao logaritmo da concentração alvo na reação bem, e assim, para uma fluorescência conhecida, a concentração de alvo desconhecida pode ser calculada.
Vejamos agora como a detecção pode ser alcançada sem repórteres, como fluoroforos, usando técnicas de sensoriamento óptico sem rótulos. Para técnicas sem rótulos, a imobilização do elemento biorecognição é a mesma da técnica baseada em rótulos. Qualquer acessório biomolécula à superfície desses sensores modifica o índice de refração nas proximidades do dispositivo óptico. As moléculas alvo se ligam à superfície do dispositivo óptico funcionalizado formando uma camada fina e modificando ainda mais o índice de refração. Essas alterações no índice de refração podem ser monitoradas rastreando a mudança na frequência natural de vibração, ou na frequência ressonante do sistema. A diferença nas frequências ressonantes antes e depois da ligação do alvo, chamada f shift, é diretamente proporcional à concentração do alvo capturado.
Agora vamos dar uma olhada nos princípios básicos de uma técnica de sensoriamento óptico comumente usada sem rótulos, Surface Plasmon Resonance ou SPR. Um instrumento SPR típico combina uma fonte laser movevel, um detector óptico para medir a mudança de intensidade, e um chip de sensor com um prisma de vidro revestido de um lado com ouro. O prisma coberto de ouro é integrado a um sistema fluido que permite uma operação de fluxo. Em um experimento, a molécula da sonda, ou elemento de biorecognição, é anexada à superfície dourada. O elemento alvo então flui sobre a superfície e se liga à sonda imobilizada. O sensor de sensibilidade utiliza o fenômeno SPR. Isso ocorre quando a luz polarizada é mostrada na superfície do metal, como o ouro, em um ângulo específico, theta SPR. Isso resulta na geração de plasmons superficiais que são oscilações eletrônicas coerentes que existem na interface de dois materiais que têm permitidaidades de sinais opostos. Quando a massa ligada à superfície do sensor muda, a condição de ressonância dos plasmons de superfície é alterada. Consequentemente, quando apenas o elemento de biorecognição está ligado na superfície, o feixe é refletido em um ângulo, ota um. Em seguida, quando mais massa é anexada à superfície, como o alvo capturado, uma redução da intensidade da luz refletida no ângulo específico, theta SPR é observado, à medida que o ângulo de reflexão muda para dois. A mudança de intensidade da luz refletida no ângulo de ressonância, theta SPR, é então uma função do ângulo da luz refletida, e pode ser medida como a diferença nos ângulos, um e dois.
Agora que cobrimos os princípios e procedimentos por trás dos biosensores ópticos, vamos ver como os pesquisadores estão aplicando essas técnicas hoje. O citómetro de célula de fluxo é um sistema óptico de biossensagem que é comumente usado para contar células e medir uma variedade de outras propriedades e componentes celulares. Uma amostra composta por vários tipos de células, cada uma marcada com um fluoróforo único, é preparada em uma suspensão. Em seguida, a amostra é executada através do citómetro de fluxo de tal forma que as células passam por um raio laser um de cada vez. À medida que cada célula passa pelo raio laser, a luz fluorescente dispersa e emitida pelos diferentes fluoroforos são separadamente quantificadas, o que dá uma contagem direta dos vários tipos de células da amostra. Outra aplicação de biosensores ópticos é a detecção de bactérias em amostras. Uma maneira de fazer isso é usando sensores ópticos de ressonador de anel. Eles são compostos de um loop fechado acoplado a guias de entrada de luz e ondas de saída. Quando a luz do comprimento de onda ressonante é aplicada ao guia de onda de entrada, ela é passada através do loop e constrói uma intensidade sobre várias viagens de ida e volta devido a interferências construtivas e é saída para o guia de onda de saída. Anticorpos específicos para proteínas da superfície bacteriana são imobilizados na superfície do ressonador do anel e um espectro de absorção de linha de base é obtido. Em seguida, a amostra bacteriana é fluída para a superfície do ressonador para permitir a ligação bacteriana ao corpo imobilizado, após o qual um segundo espectro de absorção é obtido. Se a bactéria de interesse se ligar, observa-se uma mudança visível nos picos ressonantes, o que é diretamente proporcional à concentração das bactérias-alvo.
Você acabou de assistir o vídeo do JoVE sobre biosensagem óptica. Discutimos os princípios básicos tanto da sensoriamento óptico baseada em rótulos quanto sem rótulos, juntamente com dois exemplos proeminentes desses métodos e algumas aplicações das técnicas. Obrigado por assistir.
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Biossensores ópticos são sensores que detectam um alvo biológico ou alvos de interesse usando luz. Esses dispositivos encontraram aplicações na área da saúde, produtos farmacêuticos, monitoramento ambiental, Segurança Interna e até mesmo no campo de batalha. Os biossensores ópticos são amplamente divididos em sensores baseados em rótulos e sem rótulos. Um exemplo de detecção baseada em rótulos é a Reação em Cadeia da Polimerase, ou PCR, que usa marcadores fluorescentes, ou fluoróforos, para quantificar o DNA alvo amplificado. Um exemplo de método sem rótulo é a Ressonância Plasmônica de Superfície, ou SPR. Aqui, a interação inalterada das biomoléculas com a superfície do sensor é quantificada medindo uma característica fundamental do sensor, como o ângulo de reflexão. Este vídeo analisa os fundamentos de ambos os tipos de técnicas de biossensoriamento óptico e seus componentes críticos, os princípios de funcionamento e as aplicações comuns dos biossensores ópticos.
Primeiro, vejamos os princípios gerais do biossensoriamento óptico baseado em rótulos. Normalmente, uma sonda ou elemento de biorreconhecimento, como um anticorpo complementar, é anexado à superfície do sensor usando a química de imobilização tradicional. A solução de amostra é então fluída sobre a superfície dos sensores. A molécula alvo, que é complementar ao elemento de bioreconhecimento imobilizado, é capturada seletivamente da solução de amostra complexa. Em seguida, o excesso de solução de amostra é lavado com tampão ou água. Em seguida, para ajudar a visualizar e quantificar a quantidade de alvo ligado, uma molécula secundária que é complementar ao alvo e ligada a um fluoróforo, flui através do sistema. Depois de algum tempo, quando ocorre a ligação da molécula secundária ao alvo, o excesso de fluoróforo não ligado é lavado. A intensidade do fluoróforo ligado pode então ser quantificada usando um microscópio fluorescente. Essa intensidade é primeiro plotada para várias concentrações de alvo conhecidas para criar uma curva de calibração, que permite a medição direta de uma quantidade desconhecida de alvo capturado. Assim, as técnicas baseadas em rótulos usam a intensidade de fluorescência de fluoróforos extremamente sensíveis para quantificar a concentração da biomolécula de interesse.
Agora que revisamos os princípios dos biossensores ópticos baseados em rótulos, vamos dar uma olhada em um exemplo comumente usado, o padrão atual para amplificação de DNA, PCR quantitativo ou qPCR. A mistura de reação qPCR inclui uma sonda marcada para quantificação da reação em tempo real. A sequência da sonda é anexada às moléculas fluorescentes repórter e extintor e se liga a uma sequência específica de DNA. A molécula de supressor extingue a emissão do fluoróforo enquanto ambos estão conectados à sonda. Durante a reação de PCR, a enzima polimerase degrada o DNA da sonda e separa fisicamente o repórter do fluoróforo, evitando assim a extinção e resultando em um aumento na fluorescência. Para realizar qPCR, primeiro adicione todos os componentes da reação, incluindo as sondas marcadas, em um tubo ou poço de PCR. Em seguida, coloque os poços de PCR em um termociclador especializado e insira os parâmetros para cada ciclo e o número de ciclos. O termociclador usado para qPCR inclui uma fonte de luz com os componentes ópticos necessários para selecionar um comprimento de onda e um detector para medir a intensidade da fluorescência em tempo real durante a reação de PCR. No final de cada ciclo térmico, a intensidade fluorescente devido aos fluoróforos liberados é registrada e plotada. A intensidade fluorescente é diretamente proporcional ao logaritmo da concentração alvo no poço de reação e, portanto, para uma fluorescência conhecida, a concentração alvo desconhecida pode ser calculada.
Vejamos agora como a detecção pode ser alcançada sem nenhum repórter, como fluoróforos, usando técnicas de detecção óptica sem rótulos. Para técnicas sem marcadores, a imobilização do elemento de biorreconhecimento é a mesma que a técnica baseada em marcadores. Qualquer ligação de biomolécula à superfície desses sensores modifica o índice de refração nas imediações do dispositivo óptico. As moléculas-alvo se ligam à superfície do dispositivo óptico funcionalizado, formando uma camada fina e modificando ainda mais o índice de refração. Essas mudanças no índice de refração podem ser monitoradas rastreando a mudança na frequência natural da vibração ou na frequência ressonante do sistema. A diferença nas frequências ressonantes antes e depois da ligação do alvo, chamada de deslocamento f, é diretamente proporcional à concentração do alvo capturado.
Agora vamos dar uma olhada nos princípios básicos de uma técnica de detecção óptica sem rótulo comumente usada, Ressonância de Plasmon de Superfície, ou SPR. Um instrumento SPR típico combina uma fonte de laser móvel, um detector óptico para medir a mudança de intensidade e um chip sensor com um prisma de vidro revestido de ouro em um lado. O prisma revestido de ouro é integrado a um sistema fluídico que permite uma operação de escoamento. Em um experimento, a molécula da sonda, ou elemento de biorreconhecimento, é anexada à superfície do ouro. O elemento alvo então flui sobre a superfície e se liga à sonda imobilizada. A detecção utiliza o fenômeno SPR. Isso ocorre quando a luz polarizada é mostrada na superfície do metal, como o ouro, em um ângulo específico, theta SPR. Isso resulta na geração de plasmons de superfície que são oscilações eletrônicas coerentes que existem na interface de dois materiais que possuem permissividades de sinais opostos. Quando a massa ligada à superfície do sensor muda, a condição de ressonância dos plasmons de superfície é alterada. Consequentemente, quando apenas o elemento de biorreconhecimento está ligado à superfície, o feixe é refletido em um ângulo, teta um. Então, quando mais massa é anexada à superfície, como o alvo capturado, uma redução da intensidade da luz refletida no ângulo específico, theta SPR é observada, pois o ângulo de reflexão muda para theta dois. A mudança na intensidade da luz refletida no ângulo de ressonância, teta SPR, é então uma função do ângulo da luz refletida e pode ser medida como a diferença nos ângulos, teta um e teta dois.
Agora que abordamos os princípios e procedimentos por trás dos biossensores ópticos, vamos ver como os pesquisadores estão aplicando essas técnicas hoje. O citômetro de célula de fluxo é um sistema óptico de biossensoriamento comumente usado para contar células e medir uma variedade de outras propriedades e componentes celulares. Uma amostra composta por vários tipos de células, cada uma marcada com um fluoróforo exclusivo, é preparada em suspensão. Em seguida, a amostra é passada pelo citômetro de fluxo de modo que as células passem por um feixe de laser, uma de cada vez. À medida que cada célula passa pelo feixe de laser, a luz fluorescente espalhada e emitida pelos diferentes fluoróforos é quantificada separadamente, o que fornece uma contagem direta dos vários tipos de células na amostra. Outra aplicação dos biossensores ópticos é a detecção de bactérias em amostras. Uma maneira de fazer isso é usando sensores ressonadores de anel óptico. Eles são compostos por um circuito fechado acoplado a guias de onda de entrada e saída de luz. Quando a luz do comprimento de onda ressonante é aplicada ao guia de onda de entrada, ela é passada pelo loop e aumenta uma intensidade em várias viagens de ida e volta devido à interferência construtiva e é enviada para o guia de onda de saída. Anticorpos específicos para proteínas de superfície bacteriana são imobilizados na superfície do ressonador do anel e um espectro de absorção de linha de base é obtido. Em seguida, a amostra bacteriana é fluída para a superfície do ressonador para permitir a ligação bacteriana ao corpo imobilizado, após o que um segundo espectro de absorção é obtido. Se a bactéria de interesse se liga, observa-se uma mudança visível nos picos ressonantes, que é diretamente proporcional à concentração da bactéria-alvo.
Você acabou de assistir ao vídeo de JoVE sobre biossensoriamento óptico. Discutimos os princípios básicos do sensoriamento óptico baseado em rótulos e sem rótulos, juntamente com dois exemplos proeminentes desses métodos e algumas aplicações das técnicas. Obrigado por assistir.
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Q1: What is the difference between label-based and label-free optical biosensors?
Label-based biosensors use fluorescent molecules called fluorophores attached to secondary probes to generate measurable signals, such as in quantitative PCR. Label-free biosensors detect binding by monitoring changes in optical properties like refractive index without adding reporter molecules. Both approaches immobilize biorecognition elements on sensor surfaces but differ in how they quantify target binding. Optical and electrochemical biosensors represent complementary detection strategies in modern bioanalysis.
Q2: How does quantitative PCR use fluorescence to measure DNA concentration?
In qPCR, a labeled probe contains both a fluorescent reporter and a quencher molecule that suppresses fluorescence when attached. During PCR amplification, the polymerase degrades the probe, separating the fluorophore from the quencher and releasing fluorescence. The thermocycler measures fluorescent intensity in real time at each cycle, which is directly proportional to the logarithm of target DNA concentration.
Q3: What role does the biorecognition element play in optical biosensing?
The biorecognition element, such as a complementary antibody, is immobilized on the sensor surface using chemical attachment methods. It selectively captures target molecules from complex sample solutions based on molecular specificity. This immobilized probe forms the foundation for both label-based and label-free detection methods by enabling selective binding of targets.
Q4: How does Surface Plasmon Resonance detect target binding without labels?
SPR uses polarized light directed at a gold-coated prism at a specific angle to generate surface plasmons, which are coherent electron oscillations at the metal interface. When target molecules bind to immobilized probes on the gold surface, the mass changes alter the resonance condition. This shifts the angle of reflected light, and the change in reflection intensity at the resonance angle is measured and quantified.
Q5: What is a calibration curve and why is it important in label-based biosensing?
A calibration curve is created by plotting fluorescent intensity measurements against known target concentrations. This curve establishes the relationship between fluorescence signal and target concentration. Once established, the calibration curve allows researchers to determine unknown target concentrations by measuring the fluorescent intensity of unknown samples and referencing the curve.
Q6: How does flow cytometry use optical biosensing to identify cell types?
Flow cytometry prepares cell samples with each cell type tagged with a unique fluorophore. Cells flow past a laser beam one at a time, and scattered and emitted fluorescent light from different fluorophores are separately quantified. This direct measurement provides accurate counts of various cell types in the sample based on their distinct fluorescent signatures.
Q7: How do optical ring resonators detect bacteria in samples?
Optical ring resonators consist of a closed loop coupled to input and output waveguides. Antibodies specific to bacterial surface proteins are immobilized on the resonator surface. When bacterial samples flow over the surface and bind to antibodies, the resonant peaks shift visibly. This shift is directly proportional to bacterial concentration, enabling sensitive detection and quantification.