Iniciação de geração e demanda de atividade estável aguda em roedores e tecido humano

Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no estudo de mecanismos de apreensão, como, como, quais subpopulações neurais são responsáveis pelo início e término da convulsão eletrográfica. A principal vantagem dessa técnica, é que ela pode reproduzir eventos de convulsão eletrográfica, sob demanda, e modelos in vivo e in vitro que lembram os observados clinicamente. Esta técnica também pode ser usada para procurar potenciais terapias anticonvulsivas, tentando desencadear eventos de convulsão eletrográfica durante a aplicação de diferentes candidatos a medicamentos anticonvulsivos.

Para preparar as fatias corticais, cole o tecido cerebral pré-clínico no estágio Vibratome, usando cola adesiva instantânea. Coloque suavemente o suporte de especimin na bandeja de buffer. Assegure-se de que a parte dorsal do cérebro está virada para a lâmina do Vibratome.

Corte o cérebro em seções de 450 micrômetros de espessura, na direção dorsal para ventral. Faça o primeiro corte no cérebro animal pré-clínico para remover a lâmpada olfativa. Em seguida, faça cortes subsequentes até que a área motora somatosensorial seja observada.

Use uma pipeta larga. Transfira as fatias coronais direcionadas para uma placa de Petrie contendo solução de dissecção a frio. Para as fatias coronais, faça um corte transversal logo abaixo da comissura neo cortical, e, em seguida, corte na linha média para separar os hemisférios.

Em seguida, use uma nova lâmina de barbear para cortar qualquer excesso de tecido das fatias. É fundamental realizar o procedimento de corte cerebral de forma eficiente. Cada momento que o tecido cerebral não está submerso no ACSF, é prejudicial à sua qualidade.

Tecido cerebral danificado e de baixa qualidade é menos provável que gere eventos de convulsão eletrográfica. Transfira a porção dorsal das fatias coronais, que contêm o córtex neo, para uma segunda placa de Petrie preenchida com 35 graus Celsius ACSF, por um momento. Em seguida, transfira prontamente as fatias para uma câmara de incubação, contendo 35 graus Celsius carbogenado ACSF.

Deixe as fatias cerebrais ligeiramente submersas na câmara de incubação a 35 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, retire a câmara de incubação do banho de água e permita que ela volte à temperatura ambiente. Espere uma hora para que as fatias cerebrais se recuperem, antes de realizar gravações eletrofisiológicas.

Neste procedimento, corte o papel da lente que é ligeiramente maior que a fatia cerebral. Use uma pipeta de furo largo ou um pincel de detalhamento para transferir uma fatia cerebral para o papel da lente recortado que é mantido no lugar usando uma pinça dentária. Em seguida, transfira o papel da lente com uma fatia cerebral para a câmara de gravação, e fixá-lo em posição com uma tela de harpa.

Posteriormente, profuse a fatia cerebral na câmara de gravação com ACSF carbogenado a 35 graus Celsius a uma taxa de três mililitros por minuto. Use um termômetro digital para garantir que a câmara de gravação seja de 33 a 36 graus Celsius. Em seguida, enchimento de vidro com 10 microliters de ACSF, usando uma seringa Hamilton.

Sob o estereóquio 20 vezes, guie o eletrodo de vidro de gravação para a camada cortical superficial, dois, três, usando manipuladores manuais. Veja a atividade elétrica da fatia cerebral com software padrão. Para induzir atividades de convulsão eletrográfica, profuse a fatia cerebral com ACSF contendo 4-AP a 100 micromolar.

Veja a atividade elétrica da fatia cerebral com software padrão. Para gerar eventos semelhantes a convulsões eletrográficas, utilizando estratégia optogenética nas fatias cerebrais de camundongos optogenéticos, use um manipulador manual para posicionar uma fibra óptica de 1.000 mícrons de diâmetro do cabo diretamente acima da região de gravação. Aplique um breve pulso de luz azul para iniciar um evento ictal.

Um programa baseado em MATLAB foi desenvolvido especificamente para detectar e classificar os vários tipos de eventos epilépticos que ocorrem nos modelos de apreensão in vitro e in vivo 4-AP. Este programa de detecção está disponível no repositório Do Valiante Labs GitHub. A aplicação de 100 micromolar 4-AP para uma boa qualidade 450 mícrons de tamanho cortical fatias cerebrais de um rato de canal VGAT juvenil, induziu de forma confiável eventos recorrentes semelhantes a ictal dentro de 15 minutos.

A aplicação de 100 micromolar 4-AP em fatias de má qualidade, resultou em eventos de estouro ou atividade de espirro. Em média, 40% das fatias de cada cérebro pré-clínico dissecado, geraram eventos semelhantes a ictal com sucesso. Além disso, 83% dos camundongos dissecados resultaram em pelo menos uma fatia cerebral que gerou eventos semelhantes a ictal com sucesso.

Em fatias cerebrais com eventos semelhantes a ictal de ocorrência espontânea, a aplicação de um breve pulso de luz de 30 milissegundos na fatia cerebral, desencadeou de forma confiável um evento semelhante a ictal que era idêntico na morfologia. As mesmas descobertas foram feitas em fatias cerebrais de Thy one Channelrhodopsin dois ratos. Assim, independentemente de qual subpopulação neuronal foi ativada, qualquer breve evento sincronizador na rede neural cortical isolada, levou ao início de um evento semelhante a ictal.

Estes eventos semelhantes a ictal eram compostos de um pico sentinela, disparos tônicos, disparos clonicos e atividade semelhante a explosão no final. Eram de natureza semelhante às assinaturas eletrográficas associadas a convulsões clínicas. Após esse procedimento, outros tipos de transições de estado cerebral podem ser realizadas para abordar questões como, quais são os mecanismos neurobi biologicamente subjacentes às transições do estado cerebral?

E como podemos regular essas transições para evitar a entrada em vários estados cerebrais patológicos?