Name: Um gradiente de temperatura de ensaio para determinar preferências térmicas de larvas de Drosophila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Aprenda a determinar preferências térmicas de larvas de Drosophila melanogaster usando um ensaio de gradiente de temperatura contínuo. Este método robusto permite avaliar comportamentos de somatosensação em neurociência.

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<ol><li>Fowler, M. A., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+TRP+channels+and+animal+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Drosophila TRP channels and animal behavior.</a> Life Sci. 92, 394-403 (2013).</li>
<li>Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+thermosensation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals.</a> Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).</li>
<li>Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+thermosensation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Peripheral thermosensation in mammals.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).</li>
<li>Rosenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+ortholog+of+vertebrate+TRPA1+regulates+thermotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis.</a> Genes Dev. 19, 419-424 (2005).</li>
<li>Kwon, Y., Shim, H. S., Wang, X., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+thermotactic+behavior+via+coupling+of+a+TRP+channel+to+a+phospholipase+C+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Control of thermotactic behavior via coupling of a TRP channel to a phospholipase C signaling cascade.</a> Nat Neurosci. 11, 871-873 (2008).</li>
<li>Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+thermotactic+discrimination+between+the+optimal+and+slightly+cooler+temperatures+via+a+TRPV+channel+in+chordotonal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons.</a> J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).</li>
<li>Shen, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+rhodopsin+in+temperature+discrimination+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Function of rhodopsin in temperature discrimination in Drosophila.</a> Science. 331 (6022), 1333-1336 (2011).</li>
<li>Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+switch+in+thermal+preference+in+Drosophila+larvae+depends+on+multiple+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins.</a> Cell Rep. 17, 336-344 (2016).</li>
<li>Ni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ionotropic+Receptors+IR21a+and+IR25a+mediate+cool+sensing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila.</a> Elife. 5, 13254(2016).</li>
<li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigational+decision+making+in+Drosophila+thermotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Navigational decision making in Drosophila thermotaxis.</a> J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).</li>
<li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+a+laboratory+handbook%22">Drosophila: a laboratory handbook</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Para garantir o sucesso do presente protocolo, é importante tomar medidas para obter números adequados de larvas a realizar os experimentos. Estes incluem pre-alimentando as moscas em frascos de levedura contendo colar para 2-3 d melhorar a postura de ovos. Os frascos precisam ser colocados em uma bandeja contendo frascos de água e colocado em um saco plástico transparente, que mantém a umidade dos alimentos e promove a alimentação eficaz por larvas, permitindo a exposição aos ciclos normais de claro-escuro. No entanto, ...

Thermotaxis é empregado por animais móveis para selecionar um ambiente com as mais favoráveis condições1,2,3. Se o clima é excessivamente quente ou frio, esse comportamento é vital para a sobrevivência. Além disso, muitos animais são sensíveis às diferenças muito pequenas em temperatura na faixa de confortável e procuram ambiente com uma temperatura ideal. Isto é de particular importância para organismos poiquilotérmicos como moscas de fruta, que equilibrar a temperatura corporal com o meio ambiente. Ensaios para monitorar thermotaxis larval têm sido fundamentais para identificar e clarificar as funções dos sensores moleculares como Drosophila transitória do Receptor potencial (TRP) canais4,5,6, rhodopsins7,8e geleificação do receptor receptores (IRs)9, que dotar estes animais com sensibilidades de temperatura ao longo de intervalos de temperatura diferentes.
Um teste de escolha bidirecional fornece uma abordagem para estudar as preferências térmicas em larvas6,7. O ensaio envolve a criação de duas zonas de temperatura distintas e permite que os animais selecionar um lado sobre o outro. Os resultados dos testes de escolha de duas vias podem ser robustos, especialmente se as diferenças de temperatura entre as duas opções são grandes. Além disso, uma vez que cada ensaio envolve Tabulação apenas dois grupos, os dados podem ser expressas como um índice de preferência simples. A facilidade e simplicidade de escolha bidirecional ensaios também são aptos para telas de genéticas. No entanto, uma grande limitação é que muitos experimentos são necessários para estabelecer a temperatura preferida dos animais selvagem-tipo ou mutantes.
Um ensaio de gradiente oferece a oportunidade de estabelecer a temperatura preferida em um único ensaio8. Além disso, ao contrário do teste de escolha de duas vias, permite a avaliação da distribuição de um grupo de animais, quando confrontado com uma série contínua de temperaturas. Um ensaio de gradiente usa uma placa de Petri e único animais e é well-suited para caracterizar o comportamento detalhado de cada animal10. No entanto, desde pratos de Petri são redondos, os tamanhos das zonas de temperatura variam e são progressivamente menores dependendo da distância do centro. Portanto, esta configuração não é ideal para monitorar as seleções de temperatura das populações de animais.
Um aparelho gradiente térmico contínuo que é adequado para avaliar as preferências de temperatura dos grupos de larvas emprega uma arena rectangular e está descrito aqui. É simples de construir e montar o aparelho. Além disso, o gradiente é linear e é flexível, como ele pode ser usado para avaliar a thermotaxis ao longo de intervalos de temperatura de 10 ° C a 42 ° C. O ensaio é rápido e simples de executar e produz dados reprodutíveis. Além de relatar a temperatura favorecida de larvas, revela as preferências da população de animais sobre uma escala linear inteira em uma única experiência. Devido a estas vantagens, é uma excelente escolha para a identificação de genes necessários para thermotaxis.

<table><tbody><tr><td><forte>aparelho de ensaio de gradiente</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolyScience 9106, Banheira de Circulação Refrigerada/Aquecida 6L</td><td>Thomas Scientific</td><td>9106</td><td>Este modelo foi descontinuado. Os modelos de substituição atualizados incluem: 1186R00 e 1197U04 para 120 V, 60 Hz ou 1184L08 e 1197U04 para 240 V, 50 Hz.</td></tr><tr><td>Placa de ensaio de alumínio (para gradiente direcional único)</td><td></td><td></td><td>Tamanho externo: 14 x 10,1 x 0,9 cm, tamanho interno: 12,9 x 8,7 x 0,8 cm, anodizado preto.</td></tr><tr><td>Placa de alumínio (para gradiente bidirecional)</td><td></td><td></td><td>25 x 22 x 0,2 cm, anodizado preto.</td></tr><tr><td>Bloco</td><td></td><td></td> de alumínio <td>Tamanho externo: 25,5 x 5 x 1,4 cm, os parâmetros dos canais internos são mostrados na Figura 1D.</td></tr><tr><td>Conector para blocos e tubos de alumínio</td><td>McMaster-Carr</td><td>91355K82</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Sanitary Silicone Tubing</td><td>Tygon</td><td>57296</td><td>1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" parede</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa<</td><td>strong>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Items e reagentes para ensaio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pestle</td><td>USA Scientific</td><td>17361</td><td>Pilão para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td></tr><tr><td>Termômetro</td><td>Termopar Fluke</td><td>51II</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fluke</td><td>K tipo</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de microplaca universal</td><td>Corning</td><td>6980A77</td><td></td></tr><tr><td>Prato de 35 mm</td><td>Corning</td><td>9380D40</td><td></td></tr><tr><td>Fita de rotulagem (para gradiente bidirecional)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>15-951</td><td>Fita de rotulagem Fisherbrand 2 in x 14 yds</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td>Prepare a solução a 1%</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td></td><td>Sigma S0389-5KG</td><td>Prepare a solução a 18% logo antes de iniciar o ensaio</td></tr><tr><td>Pincel</td><td>Fisher Scientific</td><td>11860</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de</td> <td>centrífuga de 50 mLDenville</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>Scoopula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>Garrafa redonda de boca larga de 500 mL</td><td>Pyrex</td><td>1395-500</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células (poro de 300 mm)</td><td>PluriSelect</td><td>43-50300</td><td>Item opcional para lavagem de larvas</td></tr><tr><td>Caixa de papelão (bandeja de frasco)</td><td>Genesee Scientific</td><td>FS32-124</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Drosophila food</td><td></td><td></td><td></td></tr>Água <tr><td>destilada</td><td></td><td></td><td>22.400 mL</td></tr><tr><td>Fubá, amarelo (malha extra fina, flocado) 20 kg</td><td>LabScientific Inc.</td><td>NC0535320</td><td>1.609 g</td></tr><tr><td>de levedura de cerveja 100 lbs</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN90331280</td><td>379 g</td></tr><tr><td>NutriSoy&reg; Farinha de soja (10 kg/unidade)</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-115</td><td>221 g</td></tr><tr><td>Drosophila Ágar, Tipo II (5 kg)</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td>190 g</td></tr><tr><td>de xarope de milho leve Karo</td><td>Karo</td><td></td><td>1.700 mL</td></tr><tr><td>de 4-hidroxibenzoato de metila (suspender em etanol de prova 200)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H5501-5KG</td><td>72 g/240 mL</td></tr><tr><td>Puriss de ácido propiônico. p.a.,>99,5% (GC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81910-1 L</td><td>108 mL</td></tr><tr><td>Ácido fosfórico&nbsp; Reagente ACS, &ge; % em peso de 85 em H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>438081-500 mL</td><td>8,5 mL</td></tr></tbody></table>

um gradiente de temperatura de ensaio para determinar preferências térmicas de larvas de drosophila

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Muitos animais, incluindo a mosca da fruta, Drosophila melanogaster, são capazes de discriminar diferenças minutos em temperatura ambiente, o que permite que eles buscar sua paisagem termal preferida. Para definir as preferências de temperatura de larvas ao longo de um intervalo definido de linear, desenvolvemos um ensaio usando um gradiente de temperatura. Para estabelecer um gradiente de single-direcional, dois blocos de alumínio são conectados aos banhos de água independentes, cada um deles controla a temperatura dos blocos individuais. Os dois blocos defina os limites inferior e superiores do gradiente. O gradiente de temperatura é estabelecido pela colocação de uma placa de alumínio revestido com agarose sobre os dois blocos de água controlados para que a placa se estende a distância entre eles. As extremidades da placa de alumínio que é definido na parte superior dos blocos de água define as temperaturas mínimas e máximos, e as regiões entrelinhas os dois blocos formam um gradiente linear de temperatura. O ensaio de gradiente pode ser aplicado para as larvas de diferentes idades e pode ser usado para identificar os mutantes que apresentam fenótipos, tais como aqueles com mutações que afetam os genes que codificam os canais TRP e opsins, que são necessários para a discriminação de temperatura.

Para estabelecer um único-direcional de 18 ° C e 28 ° C gradiente, definimos as temperaturas dos dois banhos de água de 16,8 ° C e 31 ° C. As temperaturas em 13 pontos Obtém-se medindo a temperatura em 26 posições dentro as partes superior e inferiores de todas as 6 zonas, as linhas de fronteira entre as zonas e os confins extremos da superfície do gel de agarose (Figura 2, 2E). A distribuição de temperatura ao longo do gradiente foi quase li...

Aqui, apresentamos um protocolo para determinar a temperatura ambiental preferida de larvas de Drosophila usando um gradiente térmico contínuo.

Um gradiente de temperatura de ensaio para determinar preferências térmicas de larvas de Drosophila

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

Este método pode ser usado para abordar uma questão-chave no campo da somatossensação, o mecanismo pelo qual um animal, como Drosophila melanogaster, seleciona sua temperatura ambiente preferida. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode estabelecer a temperatura preferida do grupo de larvas em um único ensaio quando confrontada com uma faixa contínua de temperaturas. Além de fornecer informações sobre as preferências de temperatura das larvas de drosófila, a placa de impressão também pode ser adaptada para uso com outros organismos modelo, como o verme, C elegans.Primeiro, faça pasta de fermento para preparar frascos para uma cruz. Misture os grânulos de fermento em água destilada e triture-os até formar uma pasta com um pilão. Em seguida, adicione um pouco de pasta de fermento perto das paredes internas dos frascos de drosófila padrão, logo acima da superfície do alimento.Para produzir as larvas, colete de 12 a 35 fêmeas e até metade dos machos, mas não mais do que 10 machos. Combine esses grupos no frasco contendo pasta de fermento. Coloque os frascos preparados em uma bandeja de 100 frascos.Inclua 20 frascos abertos carregados com água na bandeja para fornecer umidade.

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Neurociência

Neste artigo, demonstramos ensaios para estudar a nocicepção térmica...

Métodos locais e globais de Avaliação nocicepção térmica em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

Este vídeo descreve o ensaio de preferência de sabor, um método comportamental usado para medir a atração ou evitação por soluções coloridas com sabor diferente, avaliando a coloração abdominal da mosca após a ingestão da substância preferida. O protocolo apresentado demonstra o procedimento usado para medir a preferência das moscas por soluções de concentrações variadas de sacarose.

Ensaio de Preferência de Sabor: Um Método para Medir o Comportamento Alimentar em Drosophila

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Ensaio de sonda de calor local: um método para avaliar a nocicepção de altas temperaturas em larvas de Drosophila

As moscas-das-frutas Drosophila podem distinguir pequenas mudanças de temperatura e, portanto, selecionar ambientes com condições térmicas favoráveis. Este vídeo descreve um ensaio comportamental que testa a preferência de temperatura de larvas de Drosophila em um gradiente térmico linear.

Ensaio de gradiente de temperatura: um método para testar a preferência de temperatura em larvas de Drosophila

Recentemente identificamos uma nova produção circadiana Drosophila, ritmo de preferência de temperatura (TPR), em que a temperatura preferida em moscas sobe durante o dia e cai durante a noite. O TPR é regulado independentemente de outra produção circadiana, atividade locomotor. Aqui descrevemos o desenho e análise do TPR em Drosophila.

Projeto e Análise do Comportamento de Preferência de Temperatura e seu Ritmo Circadiano em Drosophila

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Medição da Actividade larval no<em&gt; Drosophila</em&gt; Monitor de Atividade

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Romance Ensaio para Fria nocicepção em<em&gt; Drosophila</em&gt; Larvas

Aqui nós apresentamos um protocolo para determinar automaticamente o desempenho locomotor de Drosophila em mudança de temperaturas usando uma arena programável de temperatura controlada que produz mudanças de temperatura rápidas e precisas no tempo e no espaço.

Um método automatizado para determinar o desempenho de Drosophila em resposta às mudanças de temperatura no espaço e no tempo

Os limites térmicos podem prever os ambientes que os organismos toleram, que são informações valiosas diante das rápidas mudanças climáticas. Descritos aqui estão protocolos de alta produtividade para avaliar minima térmico crítico e tempo de knockdown de calor em insetos. Ambos os protocolos maximizam o rendimento e minimizam o custo dos ensaios.

Ensaios de alta taxa de limite térmico em insetos

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Determinando a preferência de temperatura de mosquitos e outros ectotérmicos

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Ensaios de tolerância ao calor usando o sistema de monitoramento de atividade de Drosophila : um guia para um aplicativo executável para análise de dados

Aprenda a determinar preferências térmicas de larvas de Drosophila melanogaster usando um ensaio de gradiente de temperatura contínuo. Este método robusto permite avaliar comportamentos de somatosensação em neurociência.

Um gradiente de temperatura de ensaio para determinar preferências térmicas de larvas de Drosophila

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