Um gradiente de temperatura de ensaio para determinar preferências térmicas de larvas de Drosophila

Este método pode ser usado para abordar uma questão-chave no campo da somatossensação, o mecanismo pelo qual um animal, como Drosophila melanogaster, seleciona sua temperatura ambiente preferida. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode estabelecer a temperatura preferida do grupo de larvas em um único ensaio quando confrontada com uma faixa contínua de temperaturas. Além de fornecer informações sobre as preferências de temperatura das larvas de drosófila, a placa de impressão também pode ser adaptada para uso com outros organismos modelo, como o verme, C elegans.

Primeiro, faça pasta de fermento para preparar frascos para uma cruz. Misture os grânulos de fermento em água destilada e triture-os até formar uma pasta com um pilão. Em seguida, adicione um pouco de pasta de fermento perto das paredes internas dos frascos de drosófila padrão, logo acima da superfície do alimento.

Para produzir as larvas, colete de 12 a 35 fêmeas e até metade dos machos, mas não mais do que 10 machos. Combine esses grupos no frasco contendo pasta de fermento. Coloque os frascos preparados em uma bandeja de 100 frascos.

Inclua 20 frascos abertos carregados com água na bandeja para fornecer umidade. Em seguida, feche a bandeja em um saco plástico transparente e incube-a a 25 graus Celsius por 48 horas. Após 48 horas de alimentação e acasalamento, transfira as moscas para novos frascos de comida para coletar os ovos.

Toque neles. Não use dióxido de carbono. Em seguida, deixe as moscas botarem ovos por três horas a 25 graus Celsius.

Mais tarde, retire os adultos e coloque os frascos contendo os ovos de volta na bandeja com frascos de água e feche o saco. Em seguida, desenvolva os ovos a 25 graus Celsius até o estágio larval desejado. Para preparar um único gradiente direcional, primeiro crie um ambiente humano para o ensaio.

Coloque dois blocos de alumínio conectados a banhos-maria separados em toalhas de papel molhadas, a 10 centímetros de distância. Os banhos-maria precisam ser aquecidos com antecedência. Em seguida, faça 100 mililitros de 1% de agarose e adicione 25 mililitros a cada placa de ensaio em uma superfície nivelada.

Depois que a agarose solidificar, esfregue suavemente a superfície com uma esponja de melamina para torná-la ligeiramente grossa. Em seguida, para promover uma transferência de temperatura eficiente, preencha todas as lacunas entre os blocos de alumínio nas placas de ensaio com água fornecida por um borrifador. Agora, coloque as placas de ensaio nos blocos de alumínio e certifique-se de que as demarcações estejam a dois centímetros de cada borda para corresponder exatamente às bordas dos blocos de alumínio.

Em seguida, borrife uma película de água na superfície das placas para que os géis não sequem. Em seguida, cubra o sistema com uma caixa de papelão para reduzir a evaporação e ajudar a estabilizar a temperatura da superfície do gel. Aguarde de cinco a 10 minutos para permitir que a temperatura se equilibre.

Em seguida, verifique a temperatura da superfície na placa em pelo menos 12 locais para garantir que haja uma temperatura uniforme em todo o prato, mais ou menos dois graus Celsius. Em seguida, recoloque a tampa da caixa até que o ensaio seja realizado. Para isolar larvas limpas, primeiro adicione cerca de 40 mililitros de solução de sacarose a 18% a um tubo de ensaio de 50 mililitros.

Em seguida, transfira as larvas das pilhas de alimentos para a solução, usando uma escópula. Em seguida, misture bem as larvas na solução, usando a escópula. Agora, espere de 30 a 60 segundos para que as larvas flutuem para a camada superior do tubo.

Em seguida, despeje a solução com larvas em outro tubo de 50 mililitros e cubra com 18% de sacarose fresca. Novamente, espere que as larvas flutuem. A presença de alimentos pode influenciar nos resultados.

Portanto, para obter resultados reprodutíveis, é importante limpar bem as larvas para minimizar a contaminação com alimentos. Faça isso com cuidado, para evitar danos às larvas. Em seguida, coloque um filtro de células de 300 mícrons em cima de um tubo de 50 mililitros e, em seguida, remova quaisquer corpos adultos mortos e detritos flutuantes da superfície da solução de sacarose.

Agora, despeje as larvas pela peneira para coletá-las na tela de malha. Em seguida, passe cerca de 50 mililitros de água pela peneira duas vezes para limpar ainda mais as larvas. Em seguida, em um prato vazio de 35 milímetros, enxágue a maior parte das larvas da peneira, usando água.

Use um pincel para transferir as larvas restantes na malha. Em seguida, retire a maior parte da água do prato usando uma micropipeta. Em seguida, coloque a tampa no prato de cabeça para baixo para que as larvas não escapem.

Agora, permita que as larvas se recuperem por 10 a 20 minutos antes de iniciar o ensaio. Primeiro, remova a caixa de papelão sobre o gel e verifique rapidamente a temperatura da superfície do gel. Se a superfície estiver seca, borrife uma pequena quantidade de água na superfície.

Se o gel estiver bom, coloque de 100 a 200 larvas no centro de cada placa, usando um pincel pequeno. Em seguida, coloque uma tampa sobre cada placa de ensaio para prender as larvas e cubra a configuração com uma caixa de papelão para evitar a exposição à luz. O ensaio está agora em andamento.

Após 10 a 30 minutos, remova a caixa de papelão e a tampa da microplaca. Em seguida, fotografe as placas de cima para registrar a posição das larvas. Coloque a caixa acima da câmera para evitar reflexos na superfície do gel.

Para limpar a placa, aspire todas as larvas onde quer que elas tenham se espalhado. Agora, calcule a distribuição percentual de larvas em cada zona, usando um software de análise de imagens. Faça linhas a cada dois centímetros, com base nas demarcações da placa de ensaio e conte o número de larvas em cada zona.

Ao contar, ignore as larvas distribuídas em cristas a 0,5 centímetro de cada borda, pois a espessura do gel e as condições de temperatura não são uniformes perto da borda. Em 18 graus Celsius a 28 graus Celsius, o gradiente direcional único foi feito usando banhos-maria ajustados para 16,8 graus Celsius e 31 graus Celsius. A distribuição de temperatura ao longo do gradiente foi quase linear.

As larvas de controle foram testadas em várias idades. As larvas de primeiro, segundo e início do terceiro ínstar mostraram preferências de pico para a zona de 24 graus Celsius. Durante o terceiro ínstar, a maioria das larvas se acumulou na zona de 18 graus Celsius.

larvas de terceiro ínstar tardio não errantes estavam fortemente agrupadas na zona de 18 graus Celsius. A tendência de acumular na zona de 18 graus Celsius na cepa controle, que era White 1118, não foi devido a um efeito de borda, uma vez que as larvas do final do terceiro ínstar ainda se acumulavam na zona de 18 graus Celsius, usando um gradiente bidirecional. Quando analisamos as mutações abrigadas por larvas de terceiro ínstar necessárias para discriminar a temperatura, os resultados mudaram.

Larvas com uma mutação nula em trpA1 distribuídas igualmente por todo o gradiente de 18 graus Celsius a 28 graus Celsius. As larvas que faltam apenas as isoformas A e B ou as isoformas C e D de trpA1 também apresentaram graves comprometimentos. Larvas com uma mutação em um dos dois genes que codificam a fosfolipase c beta, norpA, também foram interrompidas.

No entanto, larvas com uma mutação em um gene que codifica a outra fosfolipase c beta, plc21c, se comportaram normalmente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão clara sobre como obter resultados reprodutíveis usando um gradiente térmico contínuo, o que permitirá comparar as preferências de temperatura de larvas de drosófila selvagem e mutante. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 30 minutos para um único ensaio.

Ao tentar este procedimento, é importante prestar atenção ao estado dos frascos para moscas e não usar as larvas se estiverem secas. Essa técnica simplifica a descoberta de novos genes exigidos pelas larvas de drosófila para selecionar sua temperatura favorita na faixa confortável.