Name: Um gradiente de temperatura de ensaio para determinar preferências térmicas de larvas de Drosophila (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Aprenda a determinar preferências térmicas de larvas de Drosophila melanogaster usando um ensaio de gradiente de temperatura contínuo. Este método robusto permite avaliar comportamentos de somatosensação em neurociência.

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<ol><li>Fowler, M. A., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+TRP+channels+and+animal+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Drosophila TRP channels and animal behavior.</a> Life Sci. 92, 394-403 (2013).</li>
<li>Palkar, R., Lippoldt, E. K., McKemy, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+and+cellular+basis+of+thermosensation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The molecular and cellular basis of thermosensation in mammals.</a> Curr Opin Neurobiol. 34, 14-19 (2015).</li>
<li>Vriens, J., Nilius, B., Voets, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+thermosensation+in+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Peripheral thermosensation in mammals.</a> Nat Rev Neurosci. 15 (9), 573-589 (2014).</li>
<li>Rosenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Drosophila+ortholog+of+vertebrate+TRPA1+regulates+thermotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The Drosophila ortholog of vertebrate TRPA1 regulates thermotaxis.</a> Genes Dev. 19, 419-424 (2005).</li>
<li>Kwon, Y., Shim, H. S., Wang, X., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+thermotactic+behavior+via+coupling+of+a+TRP+channel+to+a+phospholipase+C+signaling+cascade%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Control of thermotactic behavior via coupling of a TRP channel to a phospholipase C signaling cascade.</a> Nat Neurosci. 11, 871-873 (2008).</li>
<li>Kwon, Y., Shen, W. L., Shim, H. S., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fine+thermotactic+discrimination+between+the+optimal+and+slightly+cooler+temperatures+via+a+TRPV+channel+in+chordotonal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Fine thermotactic discrimination between the optimal and slightly cooler temperatures via a TRPV channel in chordotonal neurons.</a> J Neurosci. 30 (31), 10465-10471 (2010).</li>
<li>Shen, W. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+rhodopsin+in+temperature+discrimination+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Function of rhodopsin in temperature discrimination in Drosophila.</a> Science. 331 (6022), 1333-1336 (2011).</li>
<li>Sokabe, T., Chen, H. S., Luo, J., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+switch+in+thermal+preference+in+Drosophila+larvae+depends+on+multiple+rhodopsins%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">A switch in thermal preference in Drosophila larvae depends on multiple rhodopsins.</a> Cell Rep. 17, 336-344 (2016).</li>
<li>Ni, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ionotropic+Receptors+IR21a+and+IR25a+mediate+cool+sensing+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">The Ionotropic Receptors IR21a and IR25a mediate cool sensing in Drosophila.</a> Elife. 5, 13254(2016).</li>
<li>Luo, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Navigational+decision+making+in+Drosophila+thermotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Navigational decision making in Drosophila thermotaxis.</a> J Neurosci. 30 (12), 4261-4272 (2010).</li>
<li>Ashburner, M., Golic, K. G., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+a+laboratory+handbook%22">Drosophila: a laboratory handbook</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2005).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Para garantir o sucesso do presente protocolo, é importante tomar medidas para obter números adequados de larvas a realizar os experimentos. Estes incluem pre-alimentando as moscas em frascos de levedura contendo colar para 2-3 d melhorar a postura de ovos. Os frascos precisam ser colocados em uma bandeja contendo frascos de água e colocado em um saco plástico transparente, que mantém a umidade dos alimentos e promove a alimentação eficaz por larvas, permitindo a exposição aos ciclos normais de claro-escuro. No entanto, ...

Thermotaxis é empregado por animais móveis para selecionar um ambiente com as mais favoráveis condições1,2,3. Se o clima é excessivamente quente ou frio, esse comportamento é vital para a sobrevivência. Além disso, muitos animais são sensíveis às diferenças muito pequenas em temperatura na faixa de confortável e procuram ambiente com uma temperatura ideal. Isto é de particular importância para organismos poiquilotérmicos como moscas de fruta, que equilibrar a temperatura corporal com o meio ambiente. Ensaios para monitorar thermotaxis larval têm sido fundamentais para identificar e clarificar as funções dos sensores moleculares como Drosophila transitória do Receptor potencial (TRP) canais4,5,6, rhodopsins7,8e geleificação do receptor receptores (IRs)9, que dotar estes animais com sensibilidades de temperatura ao longo de intervalos de temperatura diferentes.
Um teste de escolha bidirecional fornece uma abordagem para estudar as preferências térmicas em larvas6,7. O ensaio envolve a criação de duas zonas de temperatura distintas e permite que os animais selecionar um lado sobre o outro. Os resultados dos testes de escolha de duas vias podem ser robustos, especialmente se as diferenças de temperatura entre as duas opções são grandes. Além disso, uma vez que cada ensaio envolve Tabulação apenas dois grupos, os dados podem ser expressas como um índice de preferência simples. A facilidade e simplicidade de escolha bidirecional ensaios também são aptos para telas de genéticas. No entanto, uma grande limitação é que muitos experimentos são necessários para estabelecer a temperatura preferida dos animais selvagem-tipo ou mutantes.
Um ensaio de gradiente oferece a oportunidade de estabelecer a temperatura preferida em um único ensaio8. Além disso, ao contrário do teste de escolha de duas vias, permite a avaliação da distribuição de um grupo de animais, quando confrontado com uma série contínua de temperaturas. Um ensaio de gradiente usa uma placa de Petri e único animais e é well-suited para caracterizar o comportamento detalhado de cada animal10. No entanto, desde pratos de Petri são redondos, os tamanhos das zonas de temperatura variam e são progressivamente menores dependendo da distância do centro. Portanto, esta configuração não é ideal para monitorar as seleções de temperatura das populações de animais.
Um aparelho gradiente térmico contínuo que é adequado para avaliar as preferências de temperatura dos grupos de larvas emprega uma arena rectangular e está descrito aqui. É simples de construir e montar o aparelho. Além disso, o gradiente é linear e é flexível, como ele pode ser usado para avaliar a thermotaxis ao longo de intervalos de temperatura de 10 ° C a 42 ° C. O ensaio é rápido e simples de executar e produz dados reprodutíveis. Além de relatar a temperatura favorecida de larvas, revela as preferências da população de animais sobre uma escala linear inteira em uma única experiência. Devido a estas vantagens, é uma excelente escolha para a identificação de genes necessários para thermotaxis.

<table><tbody><tr><td><forte>aparelho de ensaio de gradiente</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PolyScience 9106, Banheira de Circulação Refrigerada/Aquecida 6L</td><td>Thomas Scientific</td><td>9106</td><td>Este modelo foi descontinuado. Os modelos de substituição atualizados incluem: 1186R00 e 1197U04 para 120 V, 60 Hz ou 1184L08 e 1197U04 para 240 V, 50 Hz.</td></tr><tr><td>Placa de ensaio de alumínio (para gradiente direcional único)</td><td></td><td></td><td>Tamanho externo: 14 x 10,1 x 0,9 cm, tamanho interno: 12,9 x 8,7 x 0,8 cm, anodizado preto.</td></tr><tr><td>Placa de alumínio (para gradiente bidirecional)</td><td></td><td></td><td>25 x 22 x 0,2 cm, anodizado preto.</td></tr><tr><td>Bloco</td><td></td><td></td> de alumínio <td>Tamanho externo: 25,5 x 5 x 1,4 cm, os parâmetros dos canais internos são mostrados na Figura 1D.</td></tr><tr><td>Conector para blocos e tubos de alumínio</td><td>McMaster-Carr</td><td>91355K82</td><td></td></tr><tr><td>Tygon Sanitary Silicone Tubing</td><td>Tygon</td><td>57296</td><td>1/4" ID x 3/8" OD x 1/16" parede</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa<</td><td>strong>Número de Catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Items e reagentes para ensaio</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pestle</td><td>USA Scientific</td><td>17361</td><td>Pilão para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL</td></tr><tr><td>Termômetro</td><td>Termopar Fluke</td><td>51II</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fluke</td><td>K tipo</td><td></td></tr><tr><td>Tampa de microplaca universal</td><td>Corning</td><td>6980A77</td><td></td></tr><tr><td>Prato de 35 mm</td><td>Corning</td><td>9380D40</td><td></td></tr><tr><td>Fita de rotulagem (para gradiente bidirecional)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>15-951</td><td>Fita de rotulagem Fisherbrand 2 in x 14 yds</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Invitrogen</td><td>16500500</td><td>Prepare a solução a 1%</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td></td><td>Sigma S0389-5KG</td><td>Prepare a solução a 18% logo antes de iniciar o ensaio</td></tr><tr><td>Pincel</td><td>Fisher Scientific</td><td>11860</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de</td> <td>centrífuga de 50 mLDenville</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>Scoopula</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-357Q</td><td></td></tr><tr><td>Garrafa redonda de boca larga de 500 mL</td><td>Pyrex</td><td>1395-500</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de células (poro de 300 mm)</td><td>PluriSelect</td><td>43-50300</td><td>Item opcional para lavagem de larvas</td></tr><tr><td>Caixa de papelão (bandeja de frasco)</td><td>Genesee Scientific</td><td>FS32-124</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Drosophila food</td><td></td><td></td><td></td></tr>Água <tr><td>destilada</td><td></td><td></td><td>22.400 mL</td></tr><tr><td>Fubá, amarelo (malha extra fina, flocado) 20 kg</td><td>LabScientific Inc.</td><td>NC0535320</td><td>1.609 g</td></tr><tr><td>de levedura de cerveja 100 lbs</td><td>MP Biomedicals</td><td>ICN90331280</td><td>379 g</td></tr><tr><td>NutriSoy&reg; Farinha de soja (10 kg/unidade)</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-115</td><td>221 g</td></tr><tr><td>Drosophila Ágar, Tipo II (5 kg)</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td>190 g</td></tr><tr><td>de xarope de milho leve Karo</td><td>Karo</td><td></td><td>1.700 mL</td></tr><tr><td>de 4-hidroxibenzoato de metila (suspender em etanol de prova 200)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H5501-5KG</td><td>72 g/240 mL</td></tr><tr><td>Puriss de ácido propiônico. p.a.,>99,5% (GC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>81910-1 L</td><td>108 mL</td></tr><tr><td>Ácido fosfórico&nbsp; Reagente ACS, &ge; % em peso de 85 em H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>438081-500 mL</td><td>8,5 mL</td></tr></tbody></table>

um gradiente de temperatura de ensaio para determinar preferências térmicas de larvas de drosophila

A Temperature Gradient Assay to Determine Thermal Preferences of Drosophila Larvae

Muitos animais, incluindo a mosca da fruta, Drosophila melanogaster, são capazes de discriminar diferenças minutos em temperatura ambiente, o que permite que eles buscar sua paisagem termal preferida. Para definir as preferências de temperatura de larvas ao longo de um intervalo definido de linear, desenvolvemos um ensaio usando um gradiente de temperatura. Para estabelecer um gradiente de single-direcional, dois blocos de alumínio são conectados aos banhos de água independentes, cada um deles controla a temperatura dos blocos individuais. Os dois blocos defina os limites inferior e superiores do gradiente. O gradiente de temperatura é estabelecido pela colocação de uma placa de alumínio revestido com agarose sobre os dois blocos de água controlados para que a placa se estende a distância entre eles. As extremidades da placa de alumínio que é definido na parte superior dos blocos de água define as temperaturas mínimas e máximos, e as regiões entrelinhas os dois blocos formam um gradiente linear de temperatura. O ensaio de gradiente pode ser aplicado para as larvas de diferentes idades e pode ser usado para identificar os mutantes que apresentam fenótipos, tais como aqueles com mutações que afetam os genes que codificam os canais TRP e opsins, que são necessários para a discriminação de temperatura.

Para estabelecer um único-direcional de 18 ° C e 28 ° C gradiente, definimos as temperaturas dos dois banhos de água de 16,8 ° C e 31 ° C. As temperaturas em 13 pontos Obtém-se medindo a temperatura em 26 posições dentro as partes superior e inferiores de todas as 6 zonas, as linhas de fronteira entre as zonas e os confins extremos da superfície do gel de agarose (Figura 2, 2E). A distribuição de temperatura ao longo do gradiente foi quase li...

Aqui, apresentamos um protocolo para determinar a temperatura ambiental preferida de larvas de Drosophila usando um gradiente térmico contínuo.

Um gradiente de temperatura de ensaio para determinar preferências térmicas de larvas de Drosophila

Many animals, including the fruit fly, Drosophila melanogaster, are capable of discriminating minute differences in&#160;environmental temperature, which ...

Este método pode ser usado para abordar uma questão-chave no campo da somatossensação, o mecanismo pelo qual um animal, como Drosophila melanogaster, seleciona sua temperatura ambiente preferida. A principal vantagem dessa técnica é que ela pode estabelecer a temperatura preferida do grupo de larvas em um único ensaio quando confrontada com uma faixa contínua de temperaturas. Além de fornecer informações sobre as preferências de temperatura das larvas de drosófila, a placa de impressão também pode ser adaptada para uso com outros organismos modelo, como o verme, C elegans.Primeiro, faça pasta de fermento para preparar frascos para uma cruz. Misture os grânulos de fermento em água destilada e triture-os até formar uma pasta com um pilão. Em seguida, adicione um pouco de pasta de fermento perto das paredes internas dos frascos de drosófila padrão, logo acima da superfície do alimento.Para produzir as larvas, colete de 12 a 35 fêmeas e até metade dos machos, mas não mais do que 10 machos. Combine esses grupos no frasco contendo pasta de fermento. Coloque os frascos preparados em uma bandeja de 100 frascos.Inclua 20 frascos abertos carregados com água na bandeja para fornecer umidade. Em seguida, feche a bandeja em um saco plástico transparente e incube-a a 25 graus Celsius por 48 horas. Após 48 horas de alimentação e acasalamento, transfira as moscas para novos frascos de comida para coletar os ovos.Toque neles. Não use dióxido de carbono. Em seguida, deixe as moscas botarem ovos por três horas a 25 graus Celsius.Mais tarde, retire os adultos e coloque os frascos contendo os ovos de volta na bandeja com frascos de água e feche o saco. Em seguida, desenvolva os ovos a 25 graus Celsius até o estágio larval desejado. Para preparar um único gradiente direcional, primeiro crie um ambiente humano para o ensaio.Coloque dois blocos de alumínio conectados a banhos-maria separados em toalhas de papel molhadas, a 10 centímetros de distância. Os banhos-maria precisam ser aquecidos com antecedência. Em seguida, faça 100 mililitros de 1% de agarose e adicione 25 mililitros a cada placa de ensaio em uma superfície nivelada.Depois que a agarose solidificar, esfregue suavemente a superfície com uma esponja de melamina para torná-la ligeiramente grossa. Em seguida, para promover uma transferência de temperatura eficiente, preencha todas as lacunas entre os blocos de alumínio nas placas de ensaio com água fornecida por um borrifador. Agora, coloque as placas de ensaio nos blocos de alumínio e certifique-se de que as demarcações estejam a dois centímetros de cada borda para corresponder exatamente às bordas dos blocos de alumínio.Em seguida, borrife uma película de água na superfície das placas para que os géis não sequem. Em seguida, cubra o sistema com uma caixa de papelão para reduzir a evaporação e ajudar a estabilizar a temperatura da superfície do gel. Aguarde de cinco a 10 minutos para permitir que a temperatura se equilibre.Em seguida, verifique a temperatura da superfície na placa em pelo menos 12 locais para garantir que haja uma temperatura uniforme em todo o prato, mais ou menos dois graus Celsius. Em seguida, recoloque a tampa da caixa até que o ensaio seja realizado. Para isolar larvas limpas, primeiro adicione cerca de 40 mililitros de solução de sacarose a 18% a um tubo de ensaio de 50 mililitros.Em seguida, transfira as larvas das pilhas de alimentos para a solução, usando uma escópula. Em seguida, misture bem as larvas na solução, usando a escópula. Agora, espere de 30 a 60 segundos para que as larvas flutuem para a camada superior do tubo.Em seguida, despeje a solução com larvas em outro tubo de 50 mililitros e cubra com 18% de sacarose fresca. Novamente, espere que as larvas flutuem. A presença de alimentos pode influenciar nos resultados.Portanto, para obter resultados reprodutíveis, é importante limpar bem as larvas para minimizar a contaminação com alimentos. Faça isso com cuidado, para evitar danos às larvas. Em seguida, coloque um filtro de células de 300 mícrons em cima de um tubo de 50 mililitros e, em seguida, remova quaisquer corpos adultos mortos e detritos flutuantes da superfície da solução de sacarose.Agora, despeje as larvas pela peneira para coletá-las na tela de malha. Em seguida, passe cerca de 50 mililitros de água pela peneira duas vezes para limpar ainda mais as larvas. Em seguida, em um prato vazio de 35 milímetros, enxágue a maior parte das larvas da peneira, usando água.Use um pincel para transferir as larvas restantes na malha. Em seguida, retire a maior parte da água do prato usando uma micropipeta. Em seguida, coloque a tampa no prato de cabeça para baixo para que as larvas não escapem.Agora, permita que as larvas se recuperem por 10 a 20 minutos antes de iniciar o ensaio. Primeiro, remova a caixa de papelão sobre o gel e verifique rapidamente a temperatura da superfície do gel. Se a superfície estiver seca, borrife uma pequena quantidade de água na superfície.Se o gel estiver bom, coloque de 100 a 200 larvas no centro de cada placa, usando um pincel pequeno. Em seguida, coloque uma tampa sobre cada placa de ensaio para prender as larvas e cubra a configuração com uma caixa de papelão para evitar a exposição à luz. O ensaio está agora em andamento.Após 10 a 30 minutos, remova a caixa de papelão e a tampa da microplaca. Em seguida, fotografe as placas de cima para registrar a posição das larvas. Coloque a caixa acima da câmera para evitar reflexos na superfície do gel.Para limpar a placa, aspire todas as larvas onde quer que elas tenham se espalhado. Agora, calcule a distribuição percentual de larvas em cada zona, usando um software de análise de imagens. Faça linhas a cada dois centímetros, com base nas demarcações da placa de ensaio e conte o número de larvas em cada zona.Ao contar, ignore as larvas distribuídas em cristas a 0,5 centímetro de cada borda, pois a espessura do gel e as condições de temperatura não são uniformes perto da borda. Em 18 graus Celsius a 28 graus Celsius, o gradiente direcional único foi feito usando banhos-maria ajustados para 16,8 graus Celsius e 31 graus Celsius. A distribuição de temperatura ao longo do gradiente foi quase linear.As larvas de controle foram testadas em várias idades. As larvas de primeiro, segundo e início do terceiro ínstar mostraram preferências de pico para a zona de 24 graus Celsius. Durante o terceiro ínstar, a maioria das larvas se acumulou na zona de 18 graus Celsius.As larvas de terceiro ínstar tardio não errantes estavam fortemente agrupadas na zona de 18 graus Celsius. A tendência de acumular na zona de 18 graus Celsius na cepa controle, que era White 1118, não foi devido a um efeito de borda, uma vez que as larvas do final do terceiro ínstar ainda se acumulavam na zona de 18 graus Celsius, usando um gradiente bidirecional. Quando analisamos as mutações abrigadas por larvas de terceiro ínstar necessárias para discriminar a temperatura, os resultados mudaram.Larvas com uma mutação nula em trpA1 distribuídas igualmente por todo o gradiente de 18 graus Celsius a 28 graus Celsius. As larvas que faltam apenas as isoformas A e B ou as isoformas C e D de trpA1 também apresentaram graves comprometimentos. Larvas com uma mutação em um dos dois genes que codificam a fosfolipase c beta, norpA, também foram interrompidas.No entanto, larvas com uma mutação em um gene que codifica a outra fosfolipase c beta, plc21c, se comportaram normalmente. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma compreensão clara sobre como obter resultados reprodutíveis usando um gradiente térmico contínuo, o que permitirá comparar as preferências de temperatura de larvas de drosófila selvagem e mutante. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em 30 minutos para um único ensaio.Ao tentar este procedimento, é importante prestar atenção ao estado dos frascos para moscas e não usar as larvas se estiverem secas. Essa técnica simplifica a descoberta de novos genes exigidos pelas larvas de drosófila para selecionar sua temperatura favorita na faixa confortável.

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociência

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